L'interazione tra i canali HCN e la loro subunità accessoria è stato identificato come un obiettivo terapeutico nel Disturbo Depressivo Maggiore. Qui, un metodo di polarizzazione basato fluorescenza per identificare piccole molecole inibitrici di questa interazione proteina-proteina, è presentato.
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Articolo metodologico
Metodo per identificare piccole molecole inibitori della interazione proteina-proteina tra HCN1 e TRIP8b
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
canali nucleotide-gated cicliche iperpolarizzazione attivato (HCN) sono espressi ubiquitariamente in tutto il cervello, dove funzionano per regolare l'eccitabilità dei neuroni. La distribuzione subcellulare di questi canali nei neuroni piramidali dell'ippocampo CA1 di superficie è regolata da tetratricopeptide Rab8b proteina repeat-contenenti interagenti (TRIP8b), subunità accessoria. knockout genetica di HCN poro formare subunità o TRIP8b, sia portare ad un aumento dei comportamenti antidepressivo-like, suggerendo che la limitazione della funzione dei canali HCN può essere utile come trattamento per il disturbo depressivo maggiore (MDD). Nonostante rilevante interesse terapeutico, canali HCN sono anche espressi nel cuore, dove regolano ritmicità. Per aggirare i problemi fuori bersaglio associati con il blocco canali HCN cardiaci, il nostro laboratorio ha recentemente proposto mira l'interazione proteina-proteina tra HCN e TRIP8b al fine di interrompere specificamente la funzione di canale HCN nel cervello.TRIP8b lega al HCN pori formando subunità a due siti di interazione distinti, anche se qui l'attenzione è rivolta all'interazione tra la ripetizione tetratricopeptide (TPR) domini di TRIP8b e la coda del terminale C di HCN1. In questo protocollo, una descrizione estesa di un metodo per purificare TRIP8b e l'esecuzione di uno schermo ad alta produttività per identificare piccole molecole inibitrici della interazione fra HCN e TRIP8b, è descritto. Il metodo di screening ad alto rendimento utilizza un fluorescenza polarizzata (FP) a base di test per monitorare il legame di un grande frammento TRIP8b ad un undici fluoroforo-tag amino peptide acido corrispondente alla coda terminale HCN1 C. Questo metodo permette composti HIT per essere identificati sulla base della variazione della polarizzazione della luce emessa. test di convalida vengono poi eseguiti per garantire che 'colpiscono' composti non sono artefatta.
Introduzione
(HCN) canali nucleotide-gated cicliche iperpolarizzazione attivato sono espressi nel cuore e sistema nervoso centrale dove giocano un ruolo importante nella regolazione dell'eccitabilità di membrana 1. Canali HCN sono stati implicati nella patogenesi del Disturbo Depressivo Maggiore (MDD) 2, che ha portato diversi gruppi di proporre che la limitazione HCN funzione del canale farmacologicamente può essere efficace come un trattamento innovativo per MDD 3. Tuttavia, il targeting direttamente canali HCN non è praticabile a causa del loro ruolo importante nella cardiaca potenziale d'azione 4. Ivabradina, l'unico app....
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Protocollo
1. Purificazione di TRIP8b (241-602) Proteine
- Trasformare il plasmide contenente TRIP8b (241-602) nella espressione della proteina batterica vettore pGS21 3 in E. competente coli per l'espressione della proteina in base alle istruzioni del produttore. Piastra 300 ml di cultura su Luria Broth (LB) -agar con 5 mg / ml di cloramfenicolo e ampicillina. Incubare la piastra a 37 ° C per 16 h.
- Il giorno successivo, scegliere una singola colonia per inoculare 50 ml LB con 50 mg / ml di cloramfenicolo e ampicillina. Incubare la coltura a 37 ° C per 16 ore (con agitazione).
- Aggiungere cultura 50 ml di 1 L di LB co....
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Risultati
Per evitare problemi di copyright con la nostra precedente pubblicazione, una sonda TAMRA-tag HCN1 TAMRA è stato utilizzato per generare figure 2 e 3. Si noti che questa sostituzione non ha fatto una differenza apprezzabile nei risultati, ed i protocolli sono identiche a quelle descritte sopra, con HCN1 FITC. Per valutare l'interazione con HCN1 TAMRA, TRIP8b (241-602) è stato titolato in una concentrazione fissa di HC.......
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Discussione
A causa della sua potenziale come un bersaglio terapeutico in MDD 24, c'è stato un considerevole interesse per gli approcci farmacologici che antagonizzano funzione del canale HCN nel sistema nervoso centrale 4. Tuttavia, questi sforzi sono stati in fase di stallo per l'importante ruolo dei canali HCN in pacemaking cardiaco e il rischio di aritmia 25. Abbiamo ragionato che interrompere l'interazione tra HCN e la sua subunità ausiliaria specifica del cervello, TRIP8b 8,
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Institutes of Health Grant R21MH104471 and R01MH106511 (D.M.C.), Brain Research Foundation SG 2012-01 (D.M.C.), Northwestern University Clinical and Translational Sciences Institute 8UL1TR000150 (Y.H.), Chicago Biomedical Consortium HTS-004 (Y.H. e D.M.C.) e National Institutes of Health Grant 2T32MH067564 (K.L.). Una parte di questo lavoro è stata eseguita dal Northwestern University Medicinal and Synthetic Chemistry Core (ChemCore) presso il Center for Molecular Innovation and Drug Discovery (CMIDD), finanziato dal Chicago Biomedical Consortium con il supporto dei fondi Searle presso il Chicago Community Trust e il Cance....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio Ni-NTA | Qiagen | 30210 | |
| Cassetta per dialisi | ThermoFisher | 66456 | |
| Isopropil b-D-1-tiogalattopiranoside | Sigma-Aldrich | I5502 - 1 gr | |
| Piastra nera a 384 pozzetti | Corning | 3820 | |
| Proxiplate | Perkin-Elmer | ||
| Perline accettore anti-GST | Perkin-Elmer | 6760603C | |
| NiChelate | Perkin-Elmer | AS101D | |
| pGS21-a | Genscript | SD0121 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | 10837091001 | |
| Coomassie Kit | ThermoFisher | 23200 | |
| Concentratore di proteine | ThermoFisher | 88527 | |
| Perkin Elmer Enspire Lettore di piastre multimodale | Perkin-Elmer | #2300-001M | |
| BL21 (DE3) Cellule Competenti | Agilent | 200131 |
Riferimenti
- Biel, M., Wahl-Schott, C., Michalakis, S., Zong, X. Hyperpolarization-activated cation channels: from genes to function. Physiol Rev. 89 (3), 847-885 (2009).
- Shah, M. M. HCN1 channels: a new therapeutic target for depressive disorders? Sci Signal. 5 (2....
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Ristampe e permessi
