In questo studio, generiamo cellule staminali pluripotenti indotte da cellule di liquido amniotico di topo, utilizzando un sistema di trasposoni non virale.
Articolo metodologico
In questo studio, generiamo cellule staminali pluripotenti indotte da cellule di liquido amniotico di topo, utilizzando un sistema di trasposoni non virale.
Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) sono generate da cellule somatiche di topo e umane mediante l'espressione forzata di fattori di trascrizione definiti utilizzando metodi diversi. Qui, abbiamo prodotto cellule iPS da cellule di liquido amniotico di topo, utilizzando un sistema di trasposoni non virale. Tutte le linee cellulari iPS ottenute hanno mostrato le caratteristiche delle cellule pluripotenti, inclusa la capacità di differenziarsi verso derivati di tutti e tre gli strati germinali in vitro e in vivo. Questa strategia apre la possibilità di utilizzare cellule di feti malati per sviluppare nuove terapie per i difetti alla nascita.
La diagnosi prenatale è un importante strumento clinico per valutare le malattie genetiche (cioè aberrazioni cromosomiche, malattie monogeniche o poligeniche / multifattoriale) e malformazioni congenite (cioè ernia diaframmatica congenita, lesioni polmonari cistiche, onfalocele, gastroschisi). Il liquido amniotico (AF), le cellule sono semplici da ottenere dalle procedure di routine in programma durante il secondo trimestre di gravidanza (cioè l'amniocentesi e amnioreduction) o parti cesarei 1, 2. La disponibilità di cellule da pazienti AF prenatale o neonatale fornisce la possi....
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Tutte le procedure erano in conformità con la legge italiana. campioni murini AF sono state raccolte dai topi in gravidanza a 13,5 giorni dopo coitum (DPC) da C57BL / 6-Tg topi (UBC-GFP) 30Scha / J chiamato GFP.
1. Transposon Produzione
NOTA: vettori di espressione trasposoni sono stati generati utilizzando le procedure di clonazione standard. Il DNA plasmidico per il mouse AF cellule trasfezione è stato preparato utilizzando kit commerciali.
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Per valutare la capacità di riprogrammazione, le cellule del mouse AF sono stati raccolti da feti di topi GFP. Le cellule sono state trasfettate con il plasmide trasposoni circolare PB-tetO2-IRES-OKMS, che esprime i fattori di Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc e Klf4) legati alla proteina fluorescente mCherry in maniera doxiciclina-inducibile, e invertire tetraciclina transactivator (PB CAG-rtTA) plasmidi insieme con il plasmide espressione trasposasi (mPBase). Cellule di topo AF sono state tra.......
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Il metodo scelto per ottenere l'induzione di pluripotenza è rilevante per la sicurezza clinica cellule rispetto al trapianto di lungo termine. Oggi, ci sono diversi metodi adatti per la riprogrammazione. Tra i metodi non-integrative, il virale (SeV) vettore Sendai è un virus a RNA in grado di produrre grandi quantità di proteine senza integrare nel nucleo delle cellule infette 40 e potrebbe essere una strategia per ottenere cellule iPS. vettori SEV potrebbe essere un candidato per la generazi.......
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione CARIPARO con il Grant numero 13/04 e dalla Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza con il numero 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin e Michela Pozzobon sono finanziate dalla Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin è finanziata dalla Fondazione CARIPARO con il Grant numero 13/04. Paolo De Coppi è finanziato dalla Great Ormond Street Hospital Children's Charity.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre di Petri di grado batterico da 100 mm | BD Falcon | 351029 | Per in vitro differenziazione |
| 2-mercaptoetanolo | Sigma | M6250 | Per AF di topo, cellule iPS-AF e terreno di differenziazione |
| Alexa568 - capra coniugata anti-topo IgM | Thermo Fisher Scientific | A21043 | Anticorpo secondario (immunofluorescenza) |
| Alexa594-pollo coniugato anti-capra IgG | Thermo Fisher Scientific | A21468 | Anticorpo secondario (immunofluorescenza) |
| Alexa594-pollo coniugato anti-coniglio IgG | Thermo Fisher Scientific | A21442 | Anticorpo secondario (immunofluorescenza) |
| Alexa594-capra coniugata anti-topo IgG | Thermo Fisher Scientific | A11005 | Anticorpo secondario (immunofluorescenza) |
| Kit fosfatasi alcalina | Sigma | 85L1 | Colorazione con fosfatasi alcalina |
| Ampicillina | Sigma | A0166 | Per la selezione batterica |
| Albumina sierica bovina | Sigma | A7906 | BSA, per soluzione bloccante. Diluito in PBS 1x |
| Cloroformio | Sigma | C2432 | Per l'estrazione di RNA |
| Cellule DH5&alfa; | Thermo Fisher Scientific | 18265-017 | Batteri per procedura |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Thermo Fisher Scientific | 41965039 | Per MEF, FA di topo, cellule iPS-AF e terreno |
| di differenziazioneDoxiciclina | Sigma | D9891 | Per l'espressione di fattori esogeni |
| Provette per microcentrifuga (1,5 ml) | Sarstedt | 72.706 | Per la produzione di PB |
| ES FBS | Thermo Fisher Scientific | 10439024 | Per FA di topo, cellule iPS-AF e terreno di differenziazione |
| FBS | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | Per pinza a |
| punta fine | MEF F.S.T | Dumont #5 | Isolamento AF |
| Gelatina | J.T.Baker | 131 | Usato 0,1%, diluito in PBS 1x |
| Glycine | Bio-Rad | 161-0718 | Per soluzione bloccante. Diluito in PBS 1x |
| Ematossilina QS | Vector Laboratories | H3404 | Rilevamento dei nuclei |
| HE | Bio-Optica | 04-061010 | Analisi istologica del teratoma |
| Hoechst | Thermo Fisher Scientific | H3570 | Siero di cavallo per il rilevamento dei nuclei |
| Thermo Fisher Scientific | 16050-122 | Per soluzione bloccante | |
| HRP-coniugato capra anti-topo IgG | SantaCruz | sc2005 | Anticorpo secondario (immunoperossidasi) |
| ImmPACT NovaRED | Vector Laboratories | SK4805 | Substrato di perossidasi |
| Siringa da insulina con ago (25 G) | Terumo | SS+01H25161 | Procedura di amniocentesi |
| Klf4 | SantaCruz | sc-20691 | Coniglio policlonale IgG |
| L-glutammina | Thermo Fisher Scientific | 25030 | Per FA di topo, cellule iPS-AF e terreno di differenziazione |
| LB brodo (Lennox) | Sigma | L3022 | Per la crescita batterica |
| LIF | Sigma | L5158 | Per cellule AF e iPS-AF di topo medio |
| Matrigel | BD | 354234 | Per in vitro differenziazione. Diluito 1:10 in DMEM |
| Metanolo | Sigma | 32213 | Blocco della perossidasi |
| MULTIWELL Piastra a 24 pozzetti | BD | Falcon 353047 | Per differenziazione in vitro |
| Piastra a 6 pozzetti MULTIWELL | Falcon | 353046 | Per colture cellulari MEF, AF di topo e iPS-AF |
| Nanog | ReproCELL | RCAB0002P-F | IgG policlonali di coniglio |
| Aminoacidi non essenziali | Sigma | M7145 | Per AF di topo, cellule iPS-AF e mezzo di differenziazione |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S2000 | Per soluzione bloccante. Diluito in PBS 1x |
| NP-40 | Sigma | 12087-87-0 | Per permeabilizzazione cellulare. Diluito in PBS 1x |
| Oct4 | SantaCruz | sc-5279 | IgG2b |
| Oligo (dT) | Thermo Fisher Scientific | 18418012 | per RT-PCR |
| Paraformaldeide (soluzione) | Sigma | 441244 | PFA, fissativo, diluito in PBS |
| PBS 10x | Thermo Fisher Scientific | 14200-067 | D-PBS, esente da Ca2+/Mg2+. Diluito con acqua sterile per ottenere PBS 1x |
| Penicillina - Streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Per MEF, AF di topo, cellule iPS-AF e terreno di derivazione |
| Piastra di Petri (150 mm) | BD Falcon | 353025 | Per colture MEF, coltura tissutale |
| PiggyBac plasmide di espressione della trasposisi | Fornito dal professor Andras Nagy | laboratory-mPBase | |
| PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plasmide trasposone | Fornito dal professor Andras Nagy | laboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS | |
| QIAprep Spin Maxiprep Kit | Qiagen | 12663 | Per la purificazione dei plasmidi |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | Per la purificazione |
| dei plasmidiPlasmide del trasposone del transattivatore della tetraciclina inversa | Fornito dal professor Andras Nagy | laboratory-rtTA | |
| RNeasy Mini Kit. | Qiagen | 74134 | Per l'estrazione dell'RNA |
| Sox2 | SantaCruz | sc-17320 | IgG policlonali di capra |
| SSEA1 | Abcam | ab16285 | IgM SuperScript II monoclonale di topo |
| Thermo Fisher Scientific | 18064-014 | per RT-PCR | |
| T | Abcam | ab20680 | Coniglio policlonale IgG |
| Taq DNA polimerasi | Thermo Fisher Scientific | 10342020 | PCR |
| Tripsina | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | Passaggio per colture cellulari |
| Triton X-100 | Bio-Rad | 161-047 | Per permeabilizzazione cellulare, diluito in PBS 1x |
| Reagente TRIzol | Thermo Fisher Scientific | 15596-026 | Per estrazione |
| Tubb3 | Promega | G712A | Monoclonale di topo IgG1 |
| TWEEN-20 | Sigma | P1379 | Per permeabilizzazione cellulare, diluito in PBS 1x |
| &alfa; fp | R& Sistemi D | MAB1368 | IgG1 monoclonale di topo |
| αSMA | Abcam | ab7817 | IgG2a |
| (FuGENE HD) | Promega | E2311 | Per la trasfezione delle cellule AF |
| Stereomicroscopio | Nikon | SM2645 | Per eseguire l'amniocentesi |
| 200 μ l consigli | Sarstedt | 70.760012 | Per raccogliere colonie di batteri |
| Forbice | F.S.T | 14094-11 inox 25U | Per eseguire l'amniocentesi |
| Etanolo | Sigma | 2860 | Per pulire la parete addominale della madre gravida |
| Piastra di Petri per coltura tissutale (150 mm) | BD Falcon | 353025 | Per l'espansione MEF |
| Mitomicina C | Sigma | M4287-2MG | Per l'inattivazione MEF |
| Piastra MULTIWELL 96 pozzetti | BD | Falcon 353071 | Per coltura iPS-AF |
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