Articolo metodologico

La produzione di cellule staminali pluripotenti da mouse amniotico cellule del liquido Utilizzando un sistema di trasposoni

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DOI:

10.3791/54598

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28 febbraio 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

In questo articolo

Sommario

In questo studio, generiamo cellule staminali pluripotenti indotte da cellule di liquido amniotico di topo, utilizzando un sistema di trasposoni non virale.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) sono generate da cellule somatiche di topo e umane mediante l'espressione forzata di fattori di trascrizione definiti utilizzando metodi diversi. Qui, abbiamo prodotto cellule iPS da cellule di liquido amniotico di topo, utilizzando un sistema di trasposoni non virale. Tutte le linee cellulari iPS ottenute hanno mostrato le caratteristiche delle cellule pluripotenti, inclusa la capacità di differenziarsi verso derivati di tutti e tre gli strati germinali in vitro e in vivo. Questa strategia apre la possibilità di utilizzare cellule di feti malati per sviluppare nuove terapie per i difetti alla nascita.

Introduzione

La diagnosi prenatale è un importante strumento clinico per valutare le malattie genetiche (cioè aberrazioni cromosomiche, malattie monogeniche o poligeniche / multifattoriale) e malformazioni congenite (cioè ernia diaframmatica congenita, lesioni polmonari cistiche, onfalocele, gastroschisi). Il liquido amniotico (AF), le cellule sono semplici da ottenere dalle procedure di routine in programma durante il secondo trimestre di gravidanza (cioè l'amniocentesi e amnioreduction) o parti cesarei 1, 2. La disponibilità di cellule da pazienti AF prenatale o neonatale fornisce la possibilità di utilizzare questa fonte per la medicina rigenerativa, e diversi ricercatori studiato la possibilità di trattare diversi danni tissutali o malattie utilizzando una popolazione di cellule staminali isolate da AF 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12. La possibilità di ottenere facilmente cellule AF di pazienti malati, in una finestra temporale in cui la malattia è spesso stazionario, apre la strada per l'idea di utilizzare questa fonte di cellule per scopi di riprogrammazione. Infatti, staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule derivate da cellule AF potrebbero essere differenziate nelle cellule di interesse per i test in vitro di droga o per gli approcci di ingegneria dei tessuti, al fine di preparare una adeguata terapia specifica per il paziente prima del parto. Molti studi hanno già dimostrato la capacità delle cellule AF da riprogrammare e differenziato in una vasta gamma di tipi di cellule 13, 14, 15, 16, 17 </ sup>, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.

Dal momento che la scoperta da Takahashi e Yamanaka 28 di riprogrammazione delle cellule somatiche attraverso l'espressione forzata di quattro fattori di trascrizione (Oct4, Sox2, cMyc e Klf4), sono stati compiuti progressi nel campo della riprogrammazione. Considerando i diversi metodi, possiamo distinguere tra approcci virali e non virali. Il primo si aspetta l'utilizzo di vettori virali (retrovirus e lentivirus), che hanno elevata efficienza, ma silenziamento solito incompleta del transgene retrovirale, sia con la conseguenza di una linea cellulare parzialmente riprogrammato e il rischio diinserzionale mutagenesi 29, 30, 31. Il metodo non virale utilizza diverse strategie: cioè plasmidi, vettori, mRNA, proteine, trasposoni. La derivazione di cellule iPS liberi di sequenze transgeniche ha lo scopo di aggirare gli effetti potenzialmente nocivi di espressione del transgene che perde e mutagenesi inserzionale. Tra tutte le strategie non virali di cui sopra, il piggyBac (PB) Sistema di trasposoni / trasposasi richiede solo le ripetizioni terminali invertite che fiancheggiano un transgene ed espressione transitoria dell'enzima trasposasi di catalizzare l'inserimento o escissione eventi 32. Il vantaggio nell'uso trasposoni rispetto ad altri metodi per la generazione di cellule iPS è la possibilità di ottenere cellule iPS privo di vettore con un approccio vettore non virale che mostra la stessa efficienza di vettori retrovirali. Ciò è possibile mediante escissione traccia meno della codifica trasposone integrato per la reprogramming fattori a seguito di una nuova espressione transitoria del trasposasi nelle cellule iPS 33. Dato che PB è efficiente in diversi tipi cellulari 34, 35, 36, 37, è più adatto per un approccio clinico rispetto ai vettori virali, e consente la produzione di cellule iPS libera-xeno contrariamente a protocolli di produzione virali correnti che utilizzano xenobiotico condizioni, questo sistema viene utilizzato per ottenere cellule iPS da murino AF.

Di seguito vi proponiamo un protocollo dettagliato seguenti lavori già pubblicati per mostrare la produzione di iPS pluripotenti cloni di cellule di topo AF (cellule iPS-AF) 38.

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Protocollo

Tutte le procedure erano in conformità con la legge italiana. campioni murini AF sono state raccolte dai topi in gravidanza a 13,5 giorni dopo coitum (DPC) da C57BL / 6-Tg topi (UBC-GFP) 30Scha / J chiamato GFP.

1. Transposon Produzione

NOTA: vettori di espressione trasposoni sono stati generati utilizzando le procedure di clonazione standard. Il DNA plasmidico per il mouse AF cellule trasfezione è stato preparato utilizzando kit commerciali.

  1. Mescolare 10 ng di DNA plasmidico con 50 ml di batteri DH5α in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Incubare la provetta in ghiaccio per 20 min.
  2. scossa di calore a 42 ° C per 40 sec.
  3. Mettere provetta in ghiaccio per 2 minuti.
  4. Aggiungere 250 ml di brodo di pre-riscaldato (C 37 °) brodo lisogenia (LB). Agitare (300 rpm) a 37 ° C per 30 min.
  5. Distribuire 30 ml di ogni trasformazione su piastre LB con 0,1 mg / ml di ampicillina. Lasciare le piastre a secco e incubare invertiti a 37 ° C overnight.
  6. Il giorno dopo, nel pomeriggio, prendere 3 colonie, utilizzando sterili 200 microlitri punte, da ogni trasformazione e trasferimento su 0,1 mg / ml LB amp.
  7. Agitare batteri (300 rpm) durante la notte a 37 ° C.
  8. Per la depurazione plasmide utilizzare kit commerciali. plasmidi stock a -20 ° C.

2. embrionali di topo fibroblasti (MEF) Cultura

  1. Rivestimenti dei 6 pozzetti con 0,1% di gelatina
    1. piastre Coat sotto il cofano aggiungendo 1 ml di soluzione sterile 0,1% di gelatina a ciascuna delle sei pozzetti. Sia la gelatina polimerizzare sulla incubatore (37 ° C) per 1 ora.
    2. Eliminare l'eccesso, e asciugare le piastre per 1 ora.
    3. Utilizzare parafilm per sigillare e piastre di conservare a temperatura ambiente.
  2. L'inattivazione del MEF con Mitomicina C
    1. Scongelare una fiala di 4 x 10 6 cellule MEF utilizzando una C vasca 37 °.
    2. Seme MEF nella cappa su una piastra di Petri (150 mm) con il mezzo MEF.
    3. Coltivare cellule a 37 ° C e 5% CO 2.
    4. (ATTENZIONE) Aggiungere mitomicina C (5 mg / ml) quando le cellule sono confluenti.
    5. Cellule posto in un incubatore (37 ° C e 5% CO 2) per 3 ore.
    6. Rimuovere media con cellule mitomicina C. Lavare tre volte con 1x tampone fosfato salino (PBS).
    7. Aggiungere 2 ml di cellule tripsina e luogo commerciale nel 37 ° C incubatore per 5 min. Dopo, aggiungere 18 ml di blocco mezzo per arrestare la reazione tripsina.
    8. Contare le cellule utilizzando una camera di Burker secondo il protocollo del produttore.
    9. cellule centrifugare a 145 xg per 5 min. Eliminare il surnatante.
    10. Seme 60.000 cellule / cm 2 di inattivato MEF su 0,1% piastre rivestite di gelatina.
    11. Coltivare cellule per 24 ore a 37 ° C e 5% CO 2, prima della semina AF e / o cellule iPS-AF.

L'isolamento delle cellule 3. mouse AF

  1. Impostare accoppiamenti a tempo e verificare plu vaginalegs dopo 24 ore di co-housing.
  2. Osservare fino a 13,5 DPC e sacrificare diga incinta attraverso dislocazione cervicale.
  3. Pulire la parete addominale dell'animale utilizzando il 70% di etanolo.
  4. Utilizzando le forbici, eseguire una laparotomia mediana incisione della lunghezza della parete addominale per accedere nella cavità addominale.
  5. Esporre l'utero con pinze. Rimuovere l'utero con le forbici e il trasferimento in un piatto da 100 millimetri di Petri piena di sterile PBS 1x posto sul ghiaccio.
  6. Utilizzare uno stereomicroscopio per raccogliere l'AF a 10X di ingrandimento.
  7. Tenere l'utero con una pinza e rimuovere la parete uterina con le forbici. Fare attenzione a non danneggiare le membrane fetali e conseguente perdita di liquido amniotico.
  8. Raccogliere feti in una capsula di Petri 100 millimetri pieno di sterili 1x PBS e disporli sul ghiaccio.
  9. Afferrare la placenta di un feto con una pinza sottile punti e posto in un ambiente pulito 100 millimetri piastra Petri.
  10. Rimuovere il sacco vitellino con pinze punta fine.
  11. disturbare la membrana amniotica con pinze punta fine e raccogliere 30 ml di AF per ogni feto utilizzando una siringa da insulina in un flacone da 15 ml conica.
  12. Dopo la raccolta AF, lavare ogni feto con sterile 1x PBS integrato con siero fetale bovino 1% (FBS) e raccogliere nei tubo da 15 ml contenente l'AF.
  13. Centrifugare AF a 145 xg per 5 min. Rimuovere il surnatante sotto il cofano e seminare le cellule AF pellet.

4. mouse AF Cell Culture

  1. Semina di cellule di topo AF
    1. Un giorno prima della semina, preparare un 6-pozzetti di gelatina rivestite 0,1% con mitomicina C trattati con MEF.
    2. Dopo la raccolta AF, seminare le cellule ottenute da una amniocentesi (circa 1 x 10 7 cellule ottenute da feti 6) sul mitoticamente inattivato MEF utilizzando terreno di coltura AF.
    3. Coltivare cellule a 37 ° C e 5% CO 2, cambiando il mezzo ogni altro giorno.
    4. Dopo 7 giorni di coltura, transcellule fetto AF seguendo la procedura descritta di seguito.

5. Transfection, iPS-AF cellulare Generation e cultura

NOTA: cellule mouse AF sono state trasfettate con il plasmide trasposone PB-tetO2-IRES-OKMS, in combinazione con un plasmide di espressione trasposasi (mPBase) e con il transattivatore inverso tetraciclina trasposone plasmide (PB-CAG-rtTA). Tutti i plasmidi sono stati forniti dal professor Andras Nagy 33.

  1. Mescolare 1 mg di PB-tetO2-IRES-OKMS con 0,5 mg di mPBase e 0,5 mg di PB-CAG-rtTA (DNA totale: 2 mg) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  2. Diluire il DNA di 100 ml con terreno privo di siero (Dulbecco Modified Eagle Medium - DMEM).
  3. Aggiungere 8 ml di reagente di trasfezione (ad esempio, Fugene) (nel rapporto di DNA plasmidico: agente trasfezione di 2 mg (DNA) all'agente trasfezione 8 mL) nel DNA contenente 1,5 mL provetta.
  4. Incubare trasfezione miscela reagente / DNA per 15 min a temperatura ambiente.
  5. Aggiungere goccia a goccia 100 ml della miscela di trasfezione reagente / DNA per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti con cellule di topo AF e distribuire delicatamente vorticoso, con un volume finale di 2 ml / pozzetto. Lasciare agire per 24 h.
  6. Il giorno dopo, indurre l'espressione di fattori della Yamanaka (Oct4, Klf4, cMyc, Sox2) alimentando le cellule con mezzo fresco iPS-AF integrato con 1,5 mg / ml di doxiciclina (2 ml di mezzi per ogni pozzetto).
  7. Nutrire le cellule ogni giorno, senza passaggio, con il mezzo DOX contenente fresco (mantenere le cellule in mezzi integrato con doxiciclina fino punto 5.13).
  8. Osservare le cellule entro 24 ore per l'espressione mCherry e tutti i giorni per la formazione di colonie (colonie compaiono tipicamente tra i 20 e 30 giorni dopo la transfezione).
  9. Un giorno prima colonia raccolta, preparare una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti con mitomicina C trattati con MEF.
  10. Scegliere singole colonie in 50 ml di volume di usinga 200 microlitri pipetta, e trasferire in sequenza in una piastra da 96 pozzetti in singoli pozzetti.
  11. Il giorno dopo, dissociarsi ogni colonia in singole cellule aggiungendo 50 ml di tripsina commerciale e incubare per 5 min a 37 ° C.
  12. Pipetta su e giù per disaggregare la colonia.
  13. Trasferire 50 ml di tripsina contenente la colonia dissociato in un nuovo pozzo con inattivato MEF su una gelatina 0,1% rivestito 96 ben piatto pieno di 100 ml di fresca media IPS-AF integrato con doxiciclina.
  14. Quando le cellule raggiungono il 60-70% di confluenza, suddiviso in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti.
  15. Quando le cellule raggiungono 60-70% di confluenza, raggruppati 1: 2 a due pozzetti, uno con doxiciclina e l'altro senza doxiciclina, per verificare se le colonie appaiono anche nella condizione senza doxiciclina.
  16. Continuare a mantenere cloni iPS-AF, doxiciclina indipendenti, su inattivato MEF nel medio iPS-AF.
  17. Coltivare le cellule a 37 ° C e 5% di CO 2, CHAnging media giornaliera.

6. fosfatasi alcalina Colorazione

  1. Eseguire alcalina colorazione fosfatasi seguendo il protocollo del produttore ogni volta che c'è la comparsa di cellule iPS-AF doxiciclina indipendenti.

7. immunofluorescenza

  1. Ogni volta che c'è l'aspetto delle cellule iPS doxiciclina indipendenti-AF, semi di 150.000 cellule / cm 2 su un pozzo di un 24-pozzetti con inattivato MEF, e far crescere le cellule per 48 ore a 37 ° C e 5% di CO 2.
  2. (ATTENZIONE) Fissare le cellule aggiungendo 300 pl per pozzetto del 4% paraformaldeide (PFA) per 15 min a temperatura ambiente.
  3. Aggiungere 300 microlitri di 0.1% NP-40 per permeabilize cellule.
  4. Risciacquare le cellule con 300 ml di 0,1% PBS-Tween 20.
  5. Aggiungere 300 ml di tampone di bloccaggio (siero di cavallo 10% in PBS 1x) per 1 ora a temperatura ambiente.
  6. Utilizzare i seguenti anticorpi primari: Oct4 (1:80), Sox2 (1:80), Klf4 (1:80), Nanog (1:100) e SSEA1 (1:80). Diluire SSEA1 con 1% di siero albumina bovina (BSA), 10% siero di capra normale, 0,3 M glicina in 0.1% PBS-Tween-20. Diluire tutti gli altri anticorpi con 10% di siero di cavallo in 1x PBS.
  7. Incubare gli anticorpi notte a 4 ° C.
  8. Risciacquare con 300 ml di 0,1% PBS-Tween-20.
  9. Usare gli anticorpi secondari diluiti in 10% di siero di cavallo in 1x PBS: capra Alexa594 coniugato anti-topo IgG (1: 200), Alexa594 coniugato IgG pollo anti-capra (1: 200), Alexa594 coniugato pollo anti-IgG di coniglio (1: 200), capra Alexa568 coniugato anti-topo IgM (1: 200). Incubare per 2 ore a temperatura ambiente.
  10. Risciacquare con PBS 1x.
  11. nuclei macchia con soluzione di Hoechst (1: 10.000) in PBS 1x.

8. In Vitro cellulare Differenziazione

  1. Per formare goccia d'attaccatura corpi embrionali (EBS), coltivare singole gocce (2.000 cellule / ml 20) sul coperchio di piastre Petri, utilizzando il mezzo di differenziazione.
  2. Incubare i piatti a 37 ° Ce 5% CO 2 per 4 giorni.
  3. Trasferire EBs in 100 mm piatti batterica-grade in coltura in sospensione per 3 giorni in media di differenziazione.
  4. EB piastra in 24 e piastre rivestite con matrice di membrana basale (diluito 1:10 in DMEM) per altri 14 giorni.
  5. Per analisi immunofluorescenza, utilizzare anticorpi primari: T (1: 100), αfp (1: 200) e Tubb3 (1: 500) 37.

Formazione 9. In Vivo Teratoma

  1. Iniettare 100 ml di 1x PBS contenente 1 x 10 6 cellule iPS-AF nel muscolo della arti posteriori di RAG2 - / - γc - / - mice.
  2. Sacrificio topi tramite dislocazione cervicale 6 settimane dopo l'iniezione delle cellule.
  3. Rimuovere le masse tumorali, che si distinguono per le loro dimensioni, dalla arti posteriori dei topi per le seguenti analisi.
  4. Tagliare 7-10 micron di spessore sezioni trasversali del tumore isopentano congelato con un criostato.
  5. Per Ematossilina und Eosin (HE) Stain:
    1. Macchia con SE di valutare la composizione del tessuto tumorale, seguendo il protocollo del produttore.
  6. Per Stain dell'immunoperossidasi:
    1. Fissare sezioni teratoma con 4% PFA per 15 min a temperatura ambiente.
    2. Permeabilize con 0,1% Triton X-100.
  7. Incubare con i seguenti anticorpi: Tubb3 (1: 100), αfp (1:50) e αSMA (1: 100) diluito in 1% BSA in PBS 1x. Incubare per 1 ora a 37 ° C (per Tubb3) o per una notte a 4 ° C (per gli altri anticorpi).
  8. perossidasi blocco utilizzando il 100% di metanolo per 20 minuti.
  9. Incubare per 45 minuti a 37 ° C con l'anticorpo secondario HRP-coniugato (1: 150) anti-topo.
  10. Risciacquare con PBS 1x.
  11. Incubare con perossidasi (HRP) substrato (vedi Materiali Tavolo) per 5 min.
  12. Risciacquare con acqua di rubinetto per 5 minuti.
  13. Macchia con ematossilina QS per 9 sec.
  14. Risciacquare con acqua di rubinetto.

10. RNA Estrazione da cellule

  1. Utilizzare un kit di estrazione di RNA commerciale secondo il protocollo consigliato dal produttore.

11. RNA Estrazione da teratoma

  1. Omogeneizzare il teratoma con un pestello e mortaio e di azoto liquido per evitare lo scongelamento del campione.
  2. Pesare 25 mg di tessuto.
  3. Aggiungere 1 ml di reagente commerciale per l'estrazione di RNA e 200 ml di cloroformio.
  4. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  5. Centrifugare a 13.000 xg e 4 ° C per 15 min.
  6. Trasferire il surnatante eliminato in una nuova provetta.
  7. Per purificare l'RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA commerciale secondo il protocollo del produttore.

12. trascrizione inversa-polimerasi Analisi Reazione a catena

  1. Sintetizzare il primo filamento cDNA utilizzando una trascrittasi inversa per la trascrizione inversa (RT) reazione a catena -polymerase (PCR) e oligo Accor (dT)ding il protocollo del produttore, per ottenere 50 ng / ml di cDNA. Diluire cDNA con acqua priva di RNasi ad una concentrazione di 10 ng / ml.
  2. Eseguire RT-PCR utilizzando la DNA polimerasi secondo il protocollo del produttore, utilizzando 1 ng / ml di cDNA.

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Risultati

Per valutare la capacità di riprogrammazione, le cellule del mouse AF sono stati raccolti da feti di topi GFP. Le cellule sono state trasfettate con il plasmide trasposoni circolare PB-tetO2-IRES-OKMS, che esprime i fattori di Yamanaka (Oct4, Sox2, cMyc e Klf4) legati alla proteina fluorescente mCherry in maniera doxiciclina-inducibile, e invertire tetraciclina transactivator (PB CAG-rtTA) plasmidi insieme con il plasmide espressione trasposasi (mPBase). Cellule di topo AF sono state tra...

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Discussione

Il metodo scelto per ottenere l'induzione di pluripotenza è rilevante per la sicurezza clinica cellule rispetto al trapianto di lungo termine. Oggi, ci sono diversi metodi adatti per la riprogrammazione. Tra i metodi non-integrative, il virale (SeV) vettore Sendai è un virus a RNA in grado di produrre grandi quantità di proteine senza integrare nel nucleo delle cellule infette 40 e potrebbe essere una strategia per ottenere cellule iPS. vettori SEV potrebbe essere un candidato per la generazi...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione CARIPARO con il Grant numero 13/04 e dalla Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza con il numero 10/02. Martina Piccoli, Chiara Franzin e Michela Pozzobon sono finanziate dalla Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. Enrica Bertin è finanziata dalla Fondazione CARIPARO con il Grant numero 13/04. Paolo De Coppi è finanziato dalla Great Ormond Street Hospital Children's Charity.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre di Petri di grado batterico da 100 mm BD Falcon351029Per in vitro differenziazione
2-mercaptoetanolo SigmaM6250Per AF di topo, cellule iPS-AF e terreno di differenziazione
Alexa568 - capra coniugata anti-topo IgM Thermo Fisher ScientificA21043Anticorpo secondario (immunofluorescenza)
Alexa594-pollo coniugato anti-capra IgG Thermo Fisher ScientificA21468Anticorpo secondario (immunofluorescenza)
Alexa594-pollo coniugato anti-coniglio IgG Thermo Fisher ScientificA21442Anticorpo secondario (immunofluorescenza)
Alexa594-capra coniugata anti-topo IgG Thermo Fisher ScientificA11005Anticorpo secondario (immunofluorescenza)
Kit fosfatasi alcalina Sigma85L1Colorazione con fosfatasi alcalina
AmpicillinaSigmaA0166Per la selezione batterica
Albumina sierica bovinaSigmaA7906BSA, per soluzione bloccante. Diluito in PBS 1x
CloroformioSigmaC2432Per l'estrazione di RNA
Cellule DH5&alfa;Thermo Fisher Scientific18265-017Batteri per procedura
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific41965039Per MEF, FA di topo, cellule iPS-AF e terreno
di differenziazioneDoxiciclina SigmaD9891Per l'espressione di fattori esogeni
Provette per microcentrifuga (1,5 ml) Sarstedt 72.706Per la produzione di PB 
ES FBS Thermo Fisher Scientific10439024Per FA di topo, cellule iPS-AF e terreno di differenziazione
FBS Thermo Fisher Scientific10270106Per pinza a
punta fineMEF F.S.TDumont #5 Isolamento AF
GelatinaJ.T.Baker131Usato 0,1%, diluito in PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718Per soluzione bloccante. Diluito in PBS 1x
Ematossilina QSVector LaboratoriesH3404Rilevamento dei nuclei
HE Bio-Optica04-061010Analisi istologica del teratoma
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Siero di cavallo per il rilevamento dei nuclei
 Thermo Fisher Scientific16050-122Per soluzione bloccante
HRP-coniugato capra anti-topo IgGSantaCruzsc2005Anticorpo secondario (immunoperossidasi)
ImmPACT NovaRED Vector LaboratoriesSK4805Substrato di perossidasi
Siringa da insulina con ago (25 G)TerumoSS+01H25161Procedura di amniocentesi
Klf4 SantaCruzsc-20691Coniglio policlonale IgG
L-glutammina Thermo Fisher Scientific25030Per FA di topo, cellule iPS-AF e terreno di differenziazione
LB brodo (Lennox)SigmaL3022Per la crescita batterica
LIF SigmaL5158Per cellule AF e iPS-AF di topo medio
MatrigelBD354234Per in vitro differenziazione. Diluito 1:10 in DMEM
MetanoloSigma32213Blocco della perossidasi
MULTIWELL Piastra a 24 pozzettiBDFalcon 353047Per differenziazione in vitro
Piastra a 6 pozzetti MULTIWELLFalcon353046Per colture cellulari MEF, AF di topo e iPS-AF
Nanog ReproCELLRCAB0002P-FIgG policlonali di coniglio
Aminoacidi non essenziali SigmaM7145Per AF di topo, cellule iPS-AF e mezzo di differenziazione
Normal Goat SerumVector LaboratoriesS2000Per soluzione bloccante. Diluito in PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0Per permeabilizzazione cellulare. Diluito in PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279IgG2b
Oligo (dT) Thermo Fisher Scientific18418012per RT-PCR
Paraformaldeide (soluzione)Sigma441244PFA, fissativo, diluito in PBS
PBS 10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS, esente da Ca2+/Mg2+. Diluito con acqua sterile per ottenere PBS 1x
Penicillina - Streptomicina Thermo Fisher Scientific15070063Per MEF, AF di topo, cellule iPS-AF e terreno di derivazione
Piastra di Petri (150 mm)BD Falcon353025Per colture MEF, coltura tissutale
PiggyBac plasmide di espressione della trasposisiFornito dal professor Andras Nagylaboratory-mPBase
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS plasmide trasposoneFornito dal professor Andras Nagylaboratory-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663Per la purificazione dei plasmidi
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106Per la purificazione
dei plasmidiPlasmide del trasposone del transattivatore della tetraciclina inversaFornito dal professor Andras Nagylaboratory-rtTA
RNeasy Mini Kit.Qiagen74134Per l'estrazione dell'RNA
Sox2 SantaCruzsc-17320IgG policlonali di capra
SSEA1 Abcamab16285IgM SuperScript II monoclonale di topo
 Thermo Fisher Scientific18064-014per RT-PCR
T Abcamab20680Coniglio policlonale IgG
Taq DNA polimerasiThermo Fisher Scientific10342020PCR
Tripsina Thermo Fisher Scientific25300-054Passaggio per colture cellulari
Triton X-100Bio-Rad161-047Per permeabilizzazione cellulare, diluito in PBS 1x
Reagente TRIzolThermo Fisher Scientific15596-026Per estrazione
Tubb3   Promega G712AMonoclonale di topo IgG1
TWEEN-20SigmaP1379Per permeabilizzazione cellulare, diluito in PBS 1x
&alfa; fp     R& Sistemi DMAB1368IgG1 monoclonale di topo
αSMA Abcamab7817IgG2a
(FuGENE HD)Promega E2311Per la trasfezione delle cellule AF
StereomicroscopioNikonSM2645Per eseguire l'amniocentesi 
200 μ l consigliSarstedt 70.760012Per raccogliere colonie di batteri
ForbiceF.S.T14094-11 inox 25UPer eseguire l'amniocentesi 
EtanoloSigma2860Per pulire la parete addominale della madre gravida
Piastra di Petri per coltura tissutale (150 mm) BD Falcon353025Per l'espansione MEF
Mitomicina CSigmaM4287-2MGPer l'inattivazione MEF
Piastra MULTIWELL 96 pozzettiBDFalcon 353071Per coltura iPS-AF
di clonazione media BD monoclonale di topo Trascrittasi inversa RNA Reagente di trasfezione monoclonale di topo

Riferimenti

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