A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

Carolina Rodriguez-Tirado; Takanori Kitamura; Yu Kato; Jeffery W. Pollard; John S. Condeelis; David Entenberg

doi:10.3791/54603

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Articolo metodologico

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

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DOI:

10.3791/54603

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6 ottobre 2016

Carolina Rodriguez-Tirado¹ , Takanori Kitamura⁵ , Yu Kato¹^,² , Jeffery W. Pollard¹^,²^,⁵ , John S. Condeelis³^,⁴ , David Entenberg³^,⁴

¹Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, ²Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, ³Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, ⁴Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, ⁵Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multifotone per eseguire l'imaging a lungo termine ad alta risoluzione di una singola cellula del polmone intatto in tempo reale utilizzando una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto.

Abstract

Metastasi a siti secondari come il polmone, fegato e osso è un evento traumatico con un tasso di mortalità di circa il 90% ^1. Di questi siti, il polmone è il più difficile da valutare utilizzando imaging ottico intravitale grazie alla sua posizione chiusa all'interno del corpo, delicatezza e ruolo essenziale nel sostenere corretta fisiologia. Mentre le modalità cliniche (tomografia ad emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica (MRI) e la tomografia computerizzata (CT)), sono in grado di fornire immagini non invasive di questo tessuto, non hanno la risoluzione necessaria per visualizzare i primi eventi di semina, con un singolo pixel composto da quasi un migliaio di cellule. I modelli attuali di metastasi polmonari semina postulato che gli eventi subito dopo l'arrivo di una cellula tumorale sono deterministico per la sopravvivenza e la successiva crescita. Ciò significa che in tempo reale strumenti di imaging intravitale con risoluzione singola cella ² sono necessari per definire i fenotipi della cel seminaLS e testare questi modelli. Mentre l'imaging ottico ad alta risoluzione del polmone è stato eseguito utilizzando vari ex vivo i preparativi, questi esperimenti sono in genere saggi di tempo a punto singolo e sono suscettibili di manufatti e le possibili conclusioni errate a causa dell'ambiente drammaticamente alterato (temperatura, profusione, citochine, etc. ) risultante dalla rimozione dalla cavità toracica e sistema circolatorio ^3. Studi recenti hanno dimostrato che il time-lapse imaging ottico intravitale del polmone intatto è possibile utilizzando un vuoto stabilizzato finestra di imaging ^2,4,5 Tuttavia, i tempi tipici di imaging si sono limitati a circa 6 ore. Qui si descrive un protocollo per eseguire l'imaging intravitale time-lapse a lungo termine del polmone utilizzando tale finestra su un periodo di 12 ore. Le sequenze di immagini time-lapse ottenuti con questo metodo consentono la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni cellula-cellula, la dinamica della membrana e perfusione vascolare nel polmone. Abbiamo inoltre dEscribe una tecnica di elaborazione di immagini che offre una visione senza precedenti chiara del microcircolo polmonare.

Introduzione

Imaging ad alta risoluzione ottica intravitale ha dimostrato di essere fondamentale per comprendere molti processi biologici, permettendo a cella singola e parametri sub-cellulari da misurare e quantificare. Nella ricerca cancro, l'imaging intravitale delle cellule tumorali e stromali ha portato alla scoperta di molte interazioni microambientali ^6-11 che sono presenti solo in animali intatti.

Scoperte circa microambienti associati intravasation e la diffusione delle cellule tumorali nel cancro al seno con l'imaging ottico risoluzione di singola cellula in vivo ha anche portato a nuovi marcatori per la prognosi ....