Articolo metodologico

A lungo termine ad alta risoluzione intravitale Microscopia nel polmone con un vuoto stabilizzato finestra Imaging

DOI:

10.3791/54603

⸱

6 ottobre 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine, 2Department of Obstetrics/Gynecology and Woman’s Health, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Anatomy & Structural Biology, Albert Einstein College of Medicine, 4Gruss-Lipper Biophotonics Center Integrated Imaging Program, Albert Einstein College of Medicine, 5Medical Research Council Centre for Reproductive Health, Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive l'uso della microscopia multifotone per eseguire l'imaging a lungo termine ad alta risoluzione di una singola cellula del polmone intatto in tempo reale utilizzando una finestra di imaging stabilizzata sotto vuoto.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastasi a siti secondari come il polmone, fegato e osso è un evento traumatico con un tasso di mortalità di circa il 90% 1. Di questi siti, il polmone è il più difficile da valutare utilizzando imaging ottico intravitale grazie alla sua posizione chiusa all'interno del corpo, delicatezza e ruolo essenziale nel sostenere corretta fisiologia. Mentre le modalità cliniche (tomografia ad emissione di positroni (PET), la risonanza magnetica (MRI) e la tomografia computerizzata (CT)), sono in grado di fornire immagini non invasive di questo tessuto, non hanno la risoluzione necessaria per visualizzare i primi eventi di semina, con un singolo pixel composto da quasi un migliaio di cellule. I modelli attuali di metastasi polmonari semina postulato che gli eventi subito dopo l'arrivo di una cellula tumorale sono deterministico per la sopravvivenza e la successiva crescita. Ciò significa che in tempo reale strumenti di imaging intravitale con risoluzione singola cella 2 sono necessari per definire i fenotipi della cel seminaLS e testare questi modelli. Mentre l'imaging ottico ad alta risoluzione del polmone è stato eseguito utilizzando vari ex vivo i preparativi, questi esperimenti sono in genere saggi di tempo a punto singolo e sono suscettibili di manufatti e le possibili conclusioni errate a causa dell'ambiente drammaticamente alterato (temperatura, profusione, citochine, etc. ) risultante dalla rimozione dalla cavità toracica e sistema circolatorio 3. Studi recenti hanno dimostrato che il time-lapse imaging ottico intravitale del polmone intatto è possibile utilizzando un vuoto stabilizzato finestra di imaging 2,4,5 Tuttavia, i tempi tipici di imaging si sono limitati a circa 6 ore. Qui si descrive un protocollo per eseguire l'imaging intravitale time-lapse a lungo termine del polmone utilizzando tale finestra su un periodo di 12 ore. Le sequenze di immagini time-lapse ottenuti con questo metodo consentono la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni cellula-cellula, la dinamica della membrana e perfusione vascolare nel polmone. Abbiamo inoltre dEscribe una tecnica di elaborazione di immagini che offre una visione senza precedenti chiara del microcircolo polmonare.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Imaging ad alta risoluzione ottica intravitale ha dimostrato di essere fondamentale per comprendere molti processi biologici, permettendo a cella singola e parametri sub-cellulari da misurare e quantificare. Nella ricerca cancro, l'imaging intravitale delle cellule tumorali e stromali ha portato alla scoperta di molte interazioni microambientali 6-11 che sono presenti solo in animali intatti.

Scoperte circa microambienti associati intravasation e la diffusione delle cellule tumorali nel cancro al seno con l'imaging ottico risoluzione di singola cellula in vivo ha anche portato a nuovi marcatori per la prognosi e la risposta al trattamento in pazienti con cancro mammario 12-16. Le migliori tecnologie di imaging disponibili per la visualizzazione in profondità all'interno intatti gli organi vitali interni sono le modalità clinici (risonanza magnetica, PET, CT), che offrono una vista eccellente di tutta organo e possono rivelare patologie ancor prima che essi producono sintomi clinici. Non sono in grado, however, per rivelare le prime fasi di metastasi e dei meccanismi cellulari di guida progressione del tumore a causa della loro mancanza di risoluzione di singola cellula. Per il momento in metastasi polmonari sono visibili in queste modalità, sono ben stabiliti e proliferare. Data la stima che il 90% delle cellule disseminate tumorali che arrivano al polmone o non sopravvivono 17 o inizialmente rimangono dormienti 18, e l'osservazione che arrivano molto prima di quanto precedentemente previsto 19, l'imaging le prime fasi di arrivo e la sopravvivenza diventa cruciale per la comprensione del processo di semina metastatico e la ricorrenza della crescita tumorale in siti distanti.

L'esecuzione di queste osservazioni nel polmone si è dimostrato estremamente difficile tuttavia; la stragrande maggioranza degli studi di imaging hanno utilizzato ex vivo o espianto preparati 20-23, che solo danno una visione nei polmoni in momenti singoli. Mentre questi preparativi forniscono informazioni utilirmazioni, non danno una comprensione completa delle interazioni, rapporti di causa ed effetto, e dinamiche che si verificano tra i vari componenti del microambiente. La mancanza di un adeguato sistema circolatorio (e squilibrio concomitante di omeostasi) e la disconnessione dal resto del sistema immunitario del corpo rende desideravano convalidare le conclusioni che queste preparazioni generano nel tessuto intatto in vivo.

Molti gruppi hanno eseguito l'imaging intravitale del polmone intatto 2,4,5,24-33 con Wearn e tedesco essere il primo a chirurgicamente esporre lo strato pleurico 24 e Terry il primo a utilizzare una finestra di imaging impiantabile 25.

immagini ad alta risoluzione nel polmone è fortemente ostacolata dal movimento costante del polmone e diverse tecniche sono state sviluppate per superare questa limitazione. Wagner e Filley 27 hanno studiato il movimento naturale del polmone caninoe progettato loro protocollo chirurgico per localizzare loro finestra impiantato su una regione relativamente fisso mentre Wagner utilizzata vuoto nella sua finestra preparazione chirurgica per immobilizzare il tessuto 28. Da quel momento, una varietà di tecniche sono state utilizzate per l'immagine polmone tra cui: bloccaggio bronchi, apnea sequenziale e di imaging gated, acquisizione sovracampionato, incollaggio del lobo polmonare e aspirazione 34. Ognuno di questi ha i suoi vantaggi e svantaggi e nessuno tecnica è emerso come superiore ad un altro 34. Ad esempio, bronchi bloccaggio e apnea sequenziale alterano il normale scambio di gas nei polmoni e possono causare atelettasia. l'imaging Gated e l'acquisizione sovracampionato non soffrono di questi svantaggi, ma richiedono ad alta velocità o di apparecchiature di imaging specializzata non ampiamente accessibile. Infine sia incollaggio del polmone e la tecnica del vuoto evitare entrambi gli inconvenienti sopra citati, ma che possono mostrare lesioni forza indotta taglio se cura non è takit. Negli ultimi anni, la finestra di vuoto è stato miniaturizzato e adattato per l'uso nei topi utilizzando confocale e microscopia multifotonica 4,5,33 e eccellente imaging ad alta risoluzione è stato raggiunto 2. La tabella 1 riassume questa ricca storia ed esalta quelle carte che descrivono romanzo avanzamenti nella l'uso di finestre di imaging polmonare intravitale.

Questo protocollo descrive l'uso di prolungato time-lapse multiphoton intravitale microscopia a immagine di metastasi nel vivo, polmone intatto con la massima risoluzione possibile subcellulare. Le immagini sono acquisite fino a 12 ore utilizzando un microscopio multifotone dotato di elevata apertura numerica della lente obiettivo e rivelatori tubo fotomoltiplicatore multipla (PMT). modelli di topi transgenici sono utilizzati per etichetta fluorescente macrofagi native con fluorescente ad alta destrano peso molecolare e proteine ​​transfettate cellule tumorali fluorescenti (per etichettare le cellule tumorali e sistema vascolare respectively). Anche se questa scelta di cellule fluorescente consente la visualizzazione delle interazioni cellula-macrofagi cellule endoteliali tumorali e le dinamiche, questo protocollo funziona per qualsiasi ceppo di topo fluorescenti o non fluorescente. Dopo l'acquisizione, il movimento residuo di deriva (se presente) viene eliminata con un plug-in Fiji 35,36 e personalizzati macro tempo medio del canale vascolare per eliminare lampeggiante causata da cellule del sangue circolanti senza etichetta.

Mentre questo protocollo concentra sull'imaging metastasi, le tecniche sono applicabili a molti altri processi biologici osservabili con l'imaging cella singola ad alta risoluzione nel polmone.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure descritte in questo protocollo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti per l'uso di animali vertebrati, tra cui la preventiva approvazione da parte del Albert Einstein College of Medicine Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso.

1. Modello mouse e cellule tumorali Generazione fluorescente

  1. Preparare 100 ml di 0,1% (w / v) di siero albumina bovina / tampone fosfato (BSA / PBS) mescolando 0,1 g di BSA con 100 ml di PBS.
  2. Preparare le cellule tumorali fluorescente mediante trasfezione stabile.
    NOTA: Qui usiamo cellule E0771-LG, un derivato altamente metastatico E0771 topo cellule di adenocarcinoma mammario 37 che sono stati isolati da tumori metastatici sviluppate nel polmone di C57BL / 6 del mouse iniettata per via endovenosa con le cellule E0771 parentali 38.
    1. 24 ore prima della trasfezione, Piastra 1 x 10 5 cellule EO771-LG su un piatto di coltura di tessuti 60 millimetri su 2 ml di antibiofree 10% FBS (siero fetale bovino) DMEM tic (Dulbecco Modified Eagle Medium) e incubare a 37 ° C e 5% di CO 2.
    2. Al momento della transfezione, incubare 2 ug del vettore proteina fluorescente con 10 ml di reagente di trasfezione per 30 minuti prima di aggiungere 190 ml di mezzi di siero ridotte.
    3. Lavare EO771-LG cellule con tampone fosfato Dulbecco (D-PBS) una volta e aggiungere al mix trasfezione delicatamente.
    4. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 per 6 ore.
    5. Lavare le cellule e la cultura trasfettate in 2 ml di DMEM completo (10% FBS, piruvato 1 mM, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml di streptomicina) per 2 giorni.
    6. Lavare le cellule con 2 ml di PBS sterile, aggiungere 500 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubare per 2 minuti a 37 ° C.
    7. Raccogliere sospensione cellulare e mescolare con almeno 1 volume di DMEM completo e spin down a 280 x g.
    8. Risospendere le cellule in 1 ml di DMEM completo ed espandere la coltura cellulare in10 cm coltura di tessuti piatto.
    9. Avviare selezione di cellule trasfettate con l'aggiunta di 700 ug / ml di G418 antibiotico selettivo 8 ml di DMEM completo e cultura per una settimana, cambiando media ogni tre giorni.
  3. Arricchisci la popolazione fluorescente da cellule transfettate che sono stati sotto selezione in G418 per l'ordinamento delle cellule di fluorescenza-attivato (FACS) 39,40.
    1. Lavare le cellule con 5 ml di PBS e aggiungere 1,5 ml di 0,25% tripsina.
    2. Incubare per 2 minuti a 37 ° C e miscelare con almeno un volume di DMEM completo.
    3. Raccogliere sospensione cellulare e centrifugare a 280 xg e risospendere le cellule in 1 ml di soluzione sterile 0,1% (w / v) di tampone BSA / PBS.
    4. Filtrare la sospensione cellulare attraverso una maglia 40 micron e regolare il volume di 1 ml con 0,1% BSA / PBS per l'ordinamento.
    5. FACS-ordinare la popolazione più luminoso del 10% sulla base di spettro di fluorescenza utilizzando il sorter FACS 41.
    6. Coltivare le cellule ordinati per un'altra settimana uselezione nder (700 ug / ml di G418 in DMEM completo).
    7. Selezionare di nuovo le cellule fluorescente di citometria a flusso ripetendo i punti da 1.3.1 a 1.3.6, ancora una volta.
    8. Dopo un secondo turno di selezione, trypsinize, filtro e ri-sospendere le cellule in 0,1% BSA / PBS come descritto (gradini 1.3.1-1.3.4). Regolare la concentrazione a 2 x 10 6 cellule / ml per singola cella di smistamento in 96 pozzetti usando Ordine FACS.
    9. Preparare 3-5 96 pozzetti con 100 ml di DMEM completo per la raccolta. Per migliorare la sopravvivenza dopo la cernita, aggiungere 100 ml di terreno di coltura filtrati dai piatti in cui le cellule EO771-LG sono stati coltivati 42.
    10. Dopo l'ordinamento delle cellule nelle piastre a 96 pozzetti, tornare alle cellule di coltura per 2 giorni (37 ° C, 5% di CO 2).
    11. Identificare pozzi con vitali singoli cloni con l'esame sotto un microscopio invertito a 5x ingrandimento.
    12. Trypsinize ed espandere cloni vitali e congelare le cellule per il backup.
      1. Lavare pozzi con gra causa cloni con 100 ml di PBS sterile. Aggiungere 50 ml di 0,25% w / v tripsina e incubare 2 min a 37 ° C. Aggiungere 50 ml di DMEM completo e trasferimento sterile fondo piastra a 96 pozzetti V-parte inferiore o rotonda a girare verso il basso a 280 xg per 5 min.
      2. Risospendere le cellule in 100 ml di 700 mg / ml G418 DMEM completo e piastra ogni clone in piastre da 12 pozzetti. Aggiungere 400 ml di DMEM completo con G418 e la cultura fino confluenti.
      3. Lavare i pozzetti con 500 ml di PBS, aggiungere 100 ml di 0,25% tripsina e incubare 2 minuti a 37 ° C. Aggiungere 100 ml di DMEM completo e spin down per 5 min a 280 x g. Risospendere le cellule in 100 ul di DMEM completo con le cellule G418 e lamiere in 6 piastre bene fino confluenti.
      4. Una volta confluenti, trypsinize cellule, centrifugare e risospendere in 10% DMSO in FBS di congelare le scorte di cellule.
      5. Mantenere 1/10 delle sospensioni cellulari in coltura da loro placcatura in 100 mm piastre di coltura dei tessuti per la valutazione del loro potenziale metastatico.
  4. Prova potenziale metastatico dei cloni selezionati.
    1. Trypsinize e risospendere le cellule in soluzione salina ad una concentrazione di 2,5 x 10 6 cellule / ml e iniettare 200 microlitri in C57BL / 6 topi per via endovenosa attraverso la vena della coda.
    2. Dopo 2 settimane, raccogliere tessuto polmonare come descritto in precedenza 23 e quantificare il carico tumorale dal conte di superficie o di un metodo stereologica 43. Selezionare cloni ad alto potenziale metastatico per l'imaging intravitale.
  5. Sollevare MacBlue (un promotore specifico mieloide guida proteina fluorescente (PCP) espressione ciano (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16)) 44 topi reporter.
    NOTA: in genere, vengono utilizzati topi tra 8 e 12 settimane, ma i topi già nel 7 e più tardi a 20 settimane sono stati testati per funzionare pure.

2. Multiphoton Microscopio Set up and Imaging Preparazione

NOTA: Anche se questo protocollo può essere eseguita su qualsiasi multiphoton microscopio, il sistema utilizzato per acquisire i dati riportati in questo protocollo è stato descritto in precedenza in dettaglio 45.

  1. Accendere tutti i componenti del microscopio e laser, tra cui laser a due fotoni e rivelatori almeno un'ora prima del tempo di imaging desiderato.
  2. Appena prima dell'intervento chirurgico, misurare la potenza dell'ingresso luce microscopio posizionando la testa del misuratore di potenza ottica nel percorso ottico poco prima del microscopio e regolare le manopole specchio fine cavità laser fino alla massima intensità luminosa a 880 nm è leggere il misuratore di potenza ottica.

3. Vacuum System Impostare

  1. Incollare il vetrino nella finestra di imaging (Supplemental Figura 1) con cianoacrilato. Lasciare almeno 4 ore per la colla si asciughi completamente.
    NOTA: Questo passaggio può essere fatto anche prima del tempo.
  2. Tagliare la punta della pipetta 100 microlitri alla prima linea dalla piccola apertura e collegare l'estremità non tagliata per il sottile vTubo uoto.
  3. Collegare il sistema di aspirazione secondo la figura 1 e la figura 2 supplementare.
  4. Con il vuoto su e l'estremità aperta bloccato, regolare il regolatore di vuoto per <3 Hg.
    NOTA: La regolazione finale del livello di vuoto viene eseguita mediante osservazione del sistema vascolare in vivo.
  5. Applicare un sottile strato di grasso minerale al lato inferiore della piastra di imaging per evitare il mezzo di immersione lente dell'obiettivo venga trasferita all'esterno dalla piastra di imaging.
  6. Posizionare la piastra di imaging sul palco microscopio.
    NOTA: La piastra di imaging personalizzato (Supplemental Figura 3) è un foglio di 1/8 "in alluminio di spessore lavorato sia per adattarsi allo spazio inserto palco e con un foro passante nel centro per lo svolgimento della finestra di imaging.
  7. Inserire la finestra di vuoto nella piastra di imaging con il vetrino verso il basso.
  8. Sterilizzare tutte le superfici e gli strumenti tra cui piastra fase di imaging, e vincere l'imagingDow con il 70% di etanolo.
  9. Collegare l'estremità del taglio della punta della pipetta alla finestra del vuoto e il nastro il tubo verso il basso alla piastra di imaging.
  10. Portare l'obiettivo vicino alla finestra di imaging e posto una grossa goccia d'acqua tra l'obiettivo e il vetrino.
  11. Assicurarsi che non vi siano perdite dal vetrino, bloccando l'apertura centrale della finestra vuoto e verificare che la goccia d'acqua tra l'obiettivo e il vetrino non viene aspirato.
    NOTA: Una sfera del mouse del computer vecchio stile posto sopra la finestra è utile per bloccare l'apertura centrale.

4. Chirurgia

  1. Preparare l'area chirurgica sterile.
    1. Mettere tutti gli strumenti a portata di mano. Sterilizzare tutte le superfici e gli strumenti tra cui area chirurgica, e strumenti chirurgici con il 70% di etanolo.
  2. Tie una lunghezza di 3 pollici di 2-0 sutura al catetere, ¼ di pollice sopra la bussola con un doppio nodo.
  3. Preparare coda fol vena del cateterelowing il protocollo pubblicato da Harney et al. 46.
  4. Utilizzando una lampada di calore a raggi infrarossi (IR), riscaldare l'animale nella sua gabbia per ~ 5 minuti per aumentare il flusso di sangue nella vena della coda e per aiutare a catetere. Si raccomanda di mantenere l'animale riscaldato a temperature fisiologiche durante tutta la procedura chirurgica utilizzando una lampada di calore o un pad riscaldamento.
  5. Anestetizzare l'animale con 5% isoflurano e verificare che non vi è alcuna risposta ad una presa punta.
  6. Applicare una pomata oftalmica per gli occhi dell'animale.
  7. Applicare la lozione depilatorio per 10-30 secondi per rimuovere i capelli dal lato sinistro dell'animale; dalla linea mediana del torace per ¼ della schiena e dal cavo ascellare per appena sotto la gabbia toracica.
  8. Pulire qualsiasi lozione in eccesso e sterilizzare la pelle esposta con il 70% di alcol.
  9. Attaccare una siringa sterile riempita con PBS alla coda della vena del catetere e inserire e nastro in posizione seguendo il protocollo pubblicato da Harney et al. 46. Assicurarsi che il nastro è rispettato in modo sicuro l'ago stesso e non è libero nello spazio tra la coda e il nastro.
  10. Intubare il mouse, o dopo il protocollo pubblicato da Das et al. 47 o da DuPage et al. 48
  11. Accendere il ventilatore e impostarlo per la fornitura di 135 respiri al minuto e 200 ml di miscela isoflurano-ossigeno.
  12. Collegare il catetere tracheale al ventilatore.
  13. Muovi il mouse per l'area chirurgica. Fate estrema attenzione a non rimuovere il catetere.
  14. Legare il 2-0 sutura intorno al muso del mouse sotto i denti davanti.
  15. Nastro il catetere per il muso.
  16. Nastro dell'arto anteriore sinistra al catetere di tenerlo fuori del campo chirurgico.
  17. Abbassare le anestesia isoflurano ad un livello di 2,5% manutenzione e verificare l'assenza di risposta ad una presa punta.
  18. Utilizzando le forbici affilate, rimuovere 1 cm 2 di pelle al di sopra della parete toracica sinistra.
  19. ascensore tegli mammaria cuscinetto adiposo e cauterizzare eventuali vasi sanguigni vista con la penna cauterizzazione.
  20. Resecare il cuscinetto adiposo tagliando con le forbici affilate.
  21. Rimuovere lo strato muscolare fino alla gabbia toracica tagliando con le forbici affilate. Fare attenzione a non tagliare la vena ascellare esecuzione alla base della zampa anteriore.
  22. Utilizzare pinze per afferrare e sollevare il 6 ° costola. Utilizzando le forbici affilate tenuti ad un angolo poco profondo (~ 5 °) tagliare la nervatura in prossimità del bordo dell'apertura in pelle. Prestare la massima attenzione a non toccare il tessuto polmonare esposto.
  23. Allargare l'apertura nella parete toracica per esporre l'intero lobo polmonare rimuovendo quattro costole consecutivi.
    Nota: Mantenere l'apertura di almeno 5 mm di distanza dallo sterno per evitare il cuore.
  24. Sollevare con cautela il mouse afferrando la coda e tracheale catetere e spostare il mouse alla fase di imaging microscopio.
  25. Con l'off vuoto, riempire la camera della finestra sottovuoto con PBS.
  26. Capovolgere il mouse e posizionare l'espostopolmone sopra la finestra di imaging vuoto.
  27. Lentamente attivare il vuoto per circa 3-5 pollici di mercurio utilizzando la valvola a sfera.
  28. Inserire una cintura di trattenimento di carta tissue piegato a metà per due volte sul petto del mouse e nastro al piattello come mostrato in Figura 2 supplementare.
  29. Agganciare il sensore coscia del pulsossimetro per coscia dell'animale e avviare il software.
  30. Posizionare la camera ambientale sulla fase e accendere il calore per mantenere il mouse a temperatura fisiologica.
  31. Ridurre il livello di isoflurano al 1-1,5% per mantenere l'anestesia e mantenere il flusso di sangue.

5. Imaging intravitale

  1. Portare la lente obiettivo 25 x 0,95 apertura numerica (NA), vicino al vetrino e aggiungere una grande goccia d'acqua tra di loro.
  2. Utilizzando la modalità epifluorescenza, visualizzare il canale FITC e portare il tessuto polmonare a fuoco.
  3. Se non fatto prima dell'intervento chirurgico, icellule tumorali nject attraverso il catetere vena della coda.
    1. Staccare la siringa PBS dal catetere coda vena.
    2. Caricare una siringa sterile con 100 ml di sospensione cellulare tumorale (2 x 10 7 cellule / ml in PBS massimo).
      NOTA: Questo passaggio può essere fatto in anticipo per studiare arrivo cellule di cancro al polmone in diversi punti temporali.
    3. Collegare la siringa con le cellule tumorali sul catetere vena della coda.
    4. Iniettare lentamente le cellule tumorali nella vena della coda.
    5. Staccare la siringa con le cellule tumorali dal catetere vena della coda.
    6. Collegare nuovamente la siringa PBS al catetere vena della coda.
      NOTA: identificare le posizioni di tutte le cellule tumorali prima di iniettare il destrano come diventa difficile distinguere le cellule tumorali dal segnale destrano via oculare dopo l'iniezione.
  4. Individuare le cellule tumorali a immagine
    1. Per l'imaging cellule tumorali singole, individuare tutte le cellule tumorali e registrare le loro posizioni con °Pannello multipunto e del software.
      1. Individuare tutti i campi di vista di immagine osservando le cellule tumorali nel oculari microscopio.
      2. Nel software, passare al pannello multipunto facendo clic sul pulsante Multi-Point e memorizzare la posizione della cella facendo clic sul pulsante Aggiungi posizione.
    2. Per l'imaging mosaico, localizzare l'origine del mosaico e impostare le coordinate di imaging
      1. Individuare una posizione in alto a sinistra della struttura per essere catturato.
      2. Zero le coordinate x, yez del palcoscenico premendo il tasto "Zero" sul controller palco.
      3. Caricare l'elenco appropriato di coordinate mosaico facendo clic sul pulsante "Carica" ​​e selezionando la lista.
        NOTA: Un elenco esempio per un mosaico 2 x 2 con una sovrapposizione di 20% di un campo di 500 micron di vista sarebbe: Pos.1 = (0,0), Pos. 2 = (400,0), Pos. 3 = (0,400), Pos. 4 = (400,400).
  5. Rimuovere la siringa with PBS nella vena della coda catetere e sostituirlo con la siringa contenente il destrano.
  6. Iniettare lentamente fino a 100 ml di 20 mg / ml 155 kDa rodamina-destrano sciolto in PBS nel mouse tramite il catetere vena della coda seguiti iniettando 50 ml di PBS sterile per lavare la linea. Non introdurre eventuali bolle nella linea. Quando necessario, iniettare destrano almeno un'ora dopo l'iniezione delle cellule del cancro in modo che il volume totale somministrata al topo non superi le 4 ml / Kg / hr.
  7. Impostare i parametri di imaging.
    1. Passare il microscopio alla modalità multiphoton.
    2. Impostare lo zoom ad un fattore di 2X facendo clic sul pulsante di segnali di temporizzazione e l'aggiornamento del campo Fattore di zoom.
    3. Regolare la potenza del laser al ~ 10% (~ 10-15 mW a campione) facendo clic sul pulsante Rilevatori e laser e poi regolando il cursore Tsunami alimentazione a 10.
  8. Immagine ciascuna posizione per verificare la presenza di cellule tumorali e visualizzare il flusso e l'integrità del vascunitario.
    NOTA: Le navi dovrebbero apparire pienamente perfuso con eritrociti fluenti e destrano fluorescente devono essere contenute all'interno dei vasi senza perdite agli spazi extravascolare. Circa 10 - 20 cellule tumorali dovrebbero essere all'interno della apertura libera della finestra di vuoto.
  9. Regolare la profondità di partenza di ciascuna posizione per essere ripreso.
    1. Per ciascuna posizione, regolare la posizione z ruotando la manopola del fuoco sul controller palco all'immagine la fetta superiore della cellula tumorale.
    2. Posizionare la cella al centro del campo visivo.
    3. Fare clic sul pulsante Multipoint, fare clic sulla posizione del campo visivo per evidenziarlo e fare clic su Add seguito dal pulsante Elimina per sostituire posizione memorizzata della cella nella lista multipunto.
    4. Visivamente osservare la luminosità relativa della cellula tumorale in ogni posizione.
  10. Salvare le nuove posizioni di ciascuna delle cellule facendo clic sul pulsante Salva nel pannello un multipuntod specificare un nome di file.
  11. Per l'imaging di cellule tumorali singole, raccogliere tre celle di luminosità approssimativamente equivalente ed eliminare tutte le altre località dalla lista multipunto cliccando sulla loro posizione nella lista e facendo clic sul pulsante Elimina.
  12. Fare clic sul pulsante Rilevatori e laser e regolare i cursori per il guadagno PMT dei canali verde e rosso 45 in modo che i segnali sono al di sotto della saturazione.
  13. Regolare il cursore per il canale blu 45 in modo che i macrofagi appaiono ciano.
    NOTA: apparirà Qualsiasi segnale di seconda armonica solo nel canale blu e può essere separato dal macrofagi ciano seguendo la procedura di canale di sottrazione descritto in precedenza 45.
  14. Impostare la profondità di inizio z-stack a 0 micron e la profondità finale di 24 micron spostando la fase Z per la posizione e facendo clic sul pulsante Start e pulsanti Fine rispettivamente.
    NOTA: Le cellule all'interno di questa profondità verrà visualizzato con il miglior segnale dirumore e risoluzione.
  15. Impostare la dimensione z passo per 3 micron.
  16. Impostare i parametri di imaging seguenti parametri precedentemente descritti 45,49.
    1. Per l'imaging di cellule tumorali singole, fare clic sul pulsante segnali di temporizzazione e quindi immettere 4 V nel campo fattore di zoom (equivalente ad un fattore di zoom 1.5X), inserire 3 nel campo medie telaio e fare clic sul pulsante di Time-Lapse e immettere 10 nel campo Time-lapse.
      NOTA: Queste impostazioni acquisiranno 1 frame ogni 3 secondi.
    2. Per l'imaging mosaico, fare clic sul pulsante segnali di temporizzazione e immettere un fattore di ingrandimento di 1,5 V (equivalente ad un fattore di zoom 4X), digitare 3 nel numero di medie telaio e fare clic sul pulsante Time-Lapse e immettere 10 nel tempo- lapse campo ritardo.
      NOTA: Queste impostazioni acquisiranno 1 frame ogni 3 secondi.
  17. Abilitare il multipunto, z-stack e modalità di imaging t-lapse cliccando sui relativi pulsanti.
  18. Premere il pulsante Record per acquisire immagini.
    NONE: il tessuto polmonare è molto delicata e suscettibile a foto-danni. Se dopo il tempo del flusso sanguigno lapse imaging ferma nel campo immaginata, il laser potrebbe essere troppo elevata e successiva imaging altri campi deve essere fatto a potenza inferiore.
  19. Ogni 30-45 min, iniettare lentamente 50 ml di PBS o soluzione salina per mantenere l'idratazione dell'animale.

6. L'eutanasia

  1. Aumentare la isoflurano al 5%.
  2. Mantenere l'animale sotto il 5% isoflurano fino al 30 sec dopo che cessa di respirare e rimuovere l'animale dal palco.
  3. Eseguire dislocazione cervicale per garantire la completa eutanasia.

Analisi 7. Immagine

  1. Per gli esperimenti singoli imaging cellulare:
    1. Caricare le immagini in Fiji e formato come una HyperStack.
    2. Per ogni z-slice nel HyperStack, riprodurre il filmato lasso di tempo e guardare per il movimento xy residua. Se viene rilevato il movimento xy residuo, applicare il plugin chiamato StackReg 36 alla pila aeliminare il movimento.
  2. Per gli esperimenti di imaging a mosaico:
  3. Caricare le immagini in Fiji ed unirle aprendo il Mosaico Stitching macro (file supplementare codice Mosaico in brossura) e le informazioni di entrare sulle immagini, come la directory, il nome di base del file, il numero di X e Y campi nel mosaico e il numero di fette e punti di tempo.
    NOTA: a causa di come Java interpreta le directory, i nomi delle cartelle deve avere due barre rovesciate come separatori sottocartella. A causa delle limitazioni del built-in plug-in a coppie in brossura, i nomi dei file di base non devono contenere trattini.
  4. Per ottenere una visione chiara dei confini del sistema vascolare, media insieme tutti i punti di tempo per il canale di sangue in una singola immagine e quindi replicare questa immagine come sfondo per ogni fotogramma del film degli altri canali.
    NOTA: Questo viene fatto semplicemente eseguendo la macro Eseguire della media Sangue (file di codice Supplemental Perform della media Sangue).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Per dimostrare il tipo di risultati che si possono ottenere con questo metodo, abbiamo iniettato cellule tumorali E0771-LG etichettati con il trifoglio proteina fluorescente nella vena della coda di topi MacBlue 44 a varie punti di tempo prima dell'intervento chirurgico. Dopo l'intervento chirurgico, 155 kD rodamina destrano marcato è stato iniettato IV per segnare è stata eseguita imaging vascolare e time-lapse.

Qu...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ad alta risoluzione in vivo imaging ottico in combinazione con le etichette funzionali fluorescente come proteine e anticorpi ha notevolmente aumentato la nostra comprensione della cascata metastatica. Ha permesso la visualizzazione diretta e la quantificazione di cella singola e parametri sub-cellulare nelle cellule tumorali, cellule ospiti e la loro microambiente. Questo l'imaging all'interno del tumore primario ha portato, ad esempio, alla scoperta di microambienti discreti, a sostegno di una invasio...

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata supportata dal NIH-CA100324, il P30CA013330 di sostegno al centro oncologico dell'Einstein National Cancer Institute, R01CA172451 a JWP e all'Integrated Imaging Program. Questa tecnologia è stata sviluppata nel Gruss-Lipper Biophotonics Center e nell'Integrated Imaging Program presso l'Albert Einstein College of Medicine. Riconosciamo il sostegno di questi Centri in questo lavoro. Gli autori ringraziano Mike Rottenkolber, Ricardo Ibagon e Anthony Leggiadro dell'officina meccanica Einstein per la loro abile e tempestiva maestria, il laboratorio di Matthew Krummel per aver generosamente condiviso i loro disegni di progettazione delle finestre, Kevin Elicieri e Jeremy Bredfeldt per la loro esperienza in microscopia e le loro raccomandazioni sugli amplificatori e Allison Harney e Bojana Gligorijevic per le discussioni informative.

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Regolatore di vuoto in ottone nichelato 1/8 NPT femmina, con manometro, 0 - 20" Hg VuotoMcMaster Carr4172K12 Regolatore di vuoto
Adattatore per tubo spinato in ottone per tubo flessibile da 1/4" ID x 1/8" NPTF Tubo maschioMcMaster Carr5346K13Adattatore per tubo flessibile con regolatore di vuoto
Palloni filtranti di marca Pyrex con tubazione; Collo lavorato per tappo in gomma n. 4; Capacità: 50 mlCorning Life Sciences Glass5360-50Flacone sottovuoto
Vetrini coprioggetti rotondi in vetro Spessore #1,5, 0,16 - 0,19 mm 10 mm di diametro.Ted Pella, Inc.260368Vetrini coprioggetti
Exel International Safelet monouso Cateteri per flebo; 22 g x 1 poll.Exel International26746Catetere tracheale
PERMA-HAND Suture di seta intrecciate nere, ETHICON LIGAPAK Bobina di erogazione Misura 2-0VWR95056-992Stringa
liquida Super colla, trasparente, 0.14 ozHendel Corp.LOC1647358Colla cianoacrilica
Isotiocianato di tetrametilrodamina DextranSigma-AldrichT1287-500MG155 kD Destrano
da laboratorio Tubo in PVC Tygon trasparente, 1/16" ID, 1/8" OD, 1/32" Spessore parete, 25 piedi di lunghezzaMcMaster Carr5155T12Tubi sottili e Tubi per
tubi in polietilene resistente alle crepe Luer, 1/8" ID, 1/4" OD, 1/16" spessore della parete, bianco, 50 piedi di lunghezza McMaster Carr5181K24 Tubi spessi
Lozione depillatoriaNair-Micro
Medical Tubing 95 Durometer LDPEScientific Commodities Inc.BB31695-PE/1Tubo per catetere della vena caudale
30 G x 1 poll. Ago BD PrecisionGlide AghiBD305128per catetere della vena caudale
Puritan Tamponi non sterili con punta in cotone Fisher Scientific867WCNOGLUE
Raccordo per tubo spinato in policarbonato trasparente, riducente dritto per tubo da 3/32" x 1/16" IDMcMaster Carr5117k51Connettori tra tubi
Tappi in gomma monoforo FisherScientific14-135FTappo per pallone da vuoto
Punte barriera di precisione SHARP, per P-100, 100 e micro; lDenville Scientific Inc.P1125Punta per pipetta
Nastro da laboratorioFisher Scientific159015R
PuralubeHenry Schein Salute degli animali008897Unguento oftalmico
Kit per cauterizzazione GeminiApparecchio HarvardPenna per cauterizzazione 726067
pinza per micro dissezione; Seghettato; leggera curva; Larghezza della punta 0,8 mm; 4" di lunghezzaRoboz SurgicalRS-5135 forcipe
Forbici da microdissezione extra fini 4" dritte affilate/affilate 24 mmRoboz SurgicalRS-5912Forbici affilate
Forbici da micro dissezione 4" Dritte smussate/smussateRoboz SurgicalRS-5980Salviette per forbici smussate
Fisher Scientific06-666-A imbracatura
PhysioSuite SystemKent ScientificPhysioSuiteVitals Monitor
Siringa da 1 ml, Tubercolina Slip TipBD309659Siringa
CianoacrilatoGraffeLOC1647358Cover Slip Adesivo
VaselinaFisher Scientific19-086291Adattatore barriera all'acqua
Luer Cannulla 1,5 - 2,2 mmHarvard Apparatus734118Connettore per catetere
FisioSuite MouseSTAT PulsossimetroKent ScientificPulsossimetro
Isoethesia (isoflurano)Henry Schein Animal Health50033250 ml
OxygenTechAirOX TM
1x PBSLife Technologies10010-023
Valvola a sfera in PVC, Push to Connect, 1/4 di polliceGrainger3CGJ7Ventilatore
Harvard Apparatus683L'alternativa è disponibile da Kent Scientific: MouseVent
OptiMEM Siero ridotto MediumThermoFisher Scientific31985062 
Reagente di trasfezione Lipofectamine 2000ThermoFisher Scientific11668019
MacBlue Tg(Csf1r*-GAL4/VP16,UAS-ECFP)1Hume/J TopiJackson Laboratory026051 
Microscopio multifotoneOlympusFluoview FV1000Alternativa al cannocchiale personalizzato
Involucro ambientaleprecisione in plasticaper FV1000Alternativa all'involucro personalizzato
Soluzione salina tamponata con fosfatoThermoFisher Scientific14190136
Misuratore di potenza lasercoerenteMaxIITOP
Testa del misuratore di potenza laserCoerentePM10
pcDNA3-Clover Vettore di proteine fluorescentiAddgene40259
G418 Solfato Antibiotico selettivoThermoFisher Scientific10131027
MoFlo Fluorescente-Attiva Smistatore cellulare Beckman CoulterXDP
Tripsina EDTA 1xCorning25-052-Cl
40 µ m MeshFalcon352235
Piastra a 96 pozzettiCostar3599
Piastra di coltura da 60 mmPiastra di coltura Corning430196
10 cmPiastra di coltura Corning353003
Albumina sierica bovinaSigma-AldrichA4503
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1xCorning21-031-CV
C57BL/6J Laboratorio di TopoJackson000664 
Kim SalvietteFisher Scientific06-666-A 
per piccoli animali con valvola a vuoto Camera di Campo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nat Rev Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
  2. Entenberg, D., et al. Subcellular resolution optical imaging in the lung reveals early metastatic proliferation and motility. Intravital. 4 (3), 1-11 (2015).
  3. Krahl, V. E. A method of studying the living lung in the closed thorax, and some preliminary observations. Angiology. 14, 149-159 (1963).
  4. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat Methods. 8 (1), 91-96 (2011).
  5. Presson, R. G. Jr, et al. Two-photon imaging within the murine thorax without respiratory and cardiac motion artifact. Am J Pathol. 179 (1), 75-82 (2011).
  6. Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995(2014).
  7. Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA. Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
  8. Tozluoglu, M., et al. Matrix geometry determines optimal cancer cell migration strategy and modulates response to interventions. Nat Cell Biol. 15 (7), 751-762 (2013).
  9. Suetsugu, A., et al. Imaging the recruitment of cancer-associated fibroblasts by liver-metastatic colon cancer. J Cell Biochem. 112 (3), 949-953 (2011).
  10. Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
  11. Kim, M. Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
  12. Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15 (7), 2433-2441 (2009).
  13. Rohan, T. E., et al. Tumor microenvironment of metastasis and risk of distant metastasis of breast cancer. J Natl Cancer Inst. 106 (8), (2014).
  14. Agarwal, S., et al. Quantitative assessment of invasive mena isoforms (Menacalc) as an independent prognostic marker in breast cancer. Breast Cancer Res. 14 (5), R124(2012).
  15. Forse, C. L., et al. Menacalc, a quantitative method of metastasis assessment, as a prognostic marker for axillary node-negative breast cancer. BMC Cancer. 15, 483(2015).
  16. Pignatelli, J., et al. Invasive breast carcinoma cells from patients exhibit MenaINV- and macrophage-dependent transendothelial migration. Sci Signal. 7 (353), ra112(2014).
  17. Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60 (9), 2541-2546 (2000).
  18. Bragado, P., Sosa, M. S., Keely, P., Condeelis, J., Aguirre-Ghiso, J. A. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 195, 25-39 (2012).
  19. Husemann, Y., et al. Systemic spread is an early step in breast cancer. Cancer Cell. 13 (1), 58-68 (2008).
  20. St Croix, C. M., Leelavanichkul, K., Watkins, S. C. Intravital fluorescence microscopy in pulmonary research. Adv Drug Del Rev. 58 (7), 834-840 (2006).
  21. Al-Mehdi, A. B., et al. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat Med. 6 (1), 100-102 (2000).
  22. Qian, B., et al. A distinct macrophage population mediates metastatic breast cancer cell extravasation, establishment and growth. PLoS One. 4 (8), e6562(2009).
  23. Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
  24. Wearn, J. T., Barr, J., German, W. The Behavior of the Arterioles and Capillaries of the Lung. Exp Biol Med. 24 (2), 114-115 (1926).
  25. Terry, R. J. A Thoracic Window for Observation of the Lung in a Living Animal. Science. 90 (2324), 43-44 (1939).
  26. De Alva, W. E., Rainer, W. G. A method of high speed in vivo pulmonary microcinematography under physiologic conditions. Angiology. 14, 160-164 (1963).
  27. Wagner, W. W. Jr, Filley, G. F. Microscopic observation of the lung in vivo. Vasc Dis. 2 (5), 229-241 (1965).
  28. Wagner, W. W. Jr Pulmonary microcirculatory observations in vivo under physiological conditions. J Appl Physiol. 26 (3), 375-377 (1969).
  29. Groh, J., Kuhnle, G. E., Kuebler, W. M., Goetz, A. E. An experimental model for simultaneous quantitative analysis of pulmonary micro- and macrocirculation during unilateral hypoxia in vivo. Res Exp Med. 192 (6), 431-441 (1992).
  30. Fingar, V. H., Taber, S. W., Wieman, T. J. A new model for the study of pulmonary microcirculation: determination of pulmonary edema in rats. J Surg Res. 57 (3), 385-393 (1994).
  31. Lamm, W. J., Bernard, S. L., Wagner, W. W., Glenny, R. W. Intravital microscopic observations of 15-micron microspheres lodging in the pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 98 (6), 2242-2248 (2005).
  32. Tabuchi, A., Mertens, M., Kuppe, H., Pries, A. R., Kuebler, W. M. Intravital microscopy of the murine pulmonary microcirculation. J Appl Physiol. 104 (2), 338-346 (2008).
  33. Funakoshi, N., et al. A new model of lung metastasis for intravital studies. Microvasc Res. 59 (3), 361-367 (2000).
  34. Fiole, D., Tournier, J. N. Intravital microscopy of the lung: minimizing invasiveness. J Biophotonics. , (2016).
  35. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  36. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  37. Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma. Anticancer Res. 25 (6B), 3905-3915 (2005).
  38. Kitamura, T., et al. CCL2-induced chemokine cascade promotes breast cancer metastasis by enhancing retention of metastasis-associated macrophages. J Exp Med. 212 (7), 1043-1059 (2015).
  39. Gross, A., et al. Technologies for Single-Cell Isolation. Int J Mol Sci. 16 (8), 16897-16919 (2015).
  40. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  41. Mammalian cell biotechnology in protein production. Hauser, H., Wagner, R. , Walter de Gruyter. Berlin, New York. (1997).
  42. Lim, U. M., Yap, M. G., Lim, Y. P., Goh, L. T., Ng, S. K. Identification of autocrine growth factors secreted by CHO cells for applications in single-cell cloning media. J Proteome Res. 12 (7), 3496-3510 (2013).
  43. Nielsen, B. S., et al. A precise and efficient stereological method for determining murine lung metastasis volumes. Am J Pathol. 158 (6), 1997-2003 (2001).
  44. Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukoc Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
  45. Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protoc. 6 (10), 1500-1520 (2011).
  46. Harney, A. S., Condeelis, J., Entenberg, D. Extended time-lapse intravital imaging of real-time multicellular dynamics in the tumor microenvironment. J Vis Exp. (112), e54042(2016).
  47. Das, S., MacDonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318(2013).
  48. DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4 (7), 1064-1072 (2009).
  49. Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 19, Unit 19.7(2013).
  50. Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294(2013).
  51. Rao, S., Verkman, A. S. Analysis of organ physiology in transgenic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279 (1), C1-C18 (2000).

Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.

Ristampe e permessi

Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi permesso

Tag

Imaging polmonarefinestra stabilizzata sottovuotorisoluzione a singola cellulasemina di cellule tumoraliimaging time lapseperfusione vascolarericostruzione Z stackmarcatura con destrano fluorescenteanalisi delle lesioni metastatiche

Articoli correlati