Questo protocollo dimostra come eseguire cellula intera registrazione patch clamp su neuroni della retina da una preparazione TV a montare.
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Articolo metodologico
Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina
In questo articolo
Sommario
Abstract
La retina dei mammiferi è un tessuto stratificato composto da più tipi di neuroni. Per capire come i segnali visivi vengono elaborati all'interno della propria rete sinaptica intricata, registrazioni elettrofisiologiche sono spesso utilizzati per studiare le connessioni tra i singoli neuroni. Abbiamo ottimizzato una preparazione TV a monte per la registrazione patch clamp di neuroni geneticamente marcate sia in GCL (strato di cellule gangliari) e INL (strato nucleare interno) di retine di topo. Registrazione neuroni INL a Flat-monti è favorita rispetto fette perché le connessioni sia verticali e laterali sono conservati nella ex di configurazione, consentendo circuiti della retina con componenti di grandi dimensioni laterali da studiare. Abbiamo usato questa procedura per confrontare le risposte dei neuroni specchio-partnered in retine come i colinergici cellule amacrine starburst (ZSC).
Introduzione
Come parte facilmente accessibile del sistema nervoso centrale, la retina è stata per decenni un modello utile negli studi di neuroscienze. La marcatura genetica dei neuroni ha permesso una caratterizzazione dettagliata delle connessioni sinaptiche nella retina. Con molte metodologie disponibili per esaminare la funzione e la morfologia dei neuroni retinici, la tecnica di registrazione patch clamp è stata determinante per la nostra attuale comprensione dei segnali trasmessi verticalmente nella retina. Questi segnali sono originati dall'assorbimento di fotoni nei fotorecettori e inviati ai centri visivi del cervello attraverso lo spiking delle cellule gangliari retiniche (RGC). Nonostante l'ampio corpus di conoscenze accumulate finora, la diversità neurale nella retina vascolarizzata dei mammiferi rimane irrisolta e ostacola il pieno apprezzamento dei circuiti retinici che servono la visione normale. Ciò è in parte dovuto al fatto che la maggior parte delle registrazioni sono state eseguite su fette di retina per scambiare l'integrità del circuito laterale con l'accesso a più neuroni retinici prossimali1-3. Per ottenere un quadro completo di come la retina calcola i segnali visivi, è quindi auspicabile registrare i neuroni in montature piatte in cui le connessioni laterali, grandi e piccole, possono essere meglio conservate.
Quando la trasmissione sinaptica dai fotorecettori alle cellule bipolari viene interrotta a causa di una via di segnalazione metabotropica difettosa del recettore del glutammato 6 (mGluR6) nelle cellule bipolari depolarizzanti4-6 o semplicemente come risultato della perdita di fotorecettori nelle retine degenerate7-10, molte RGC mostrano attività oscillatorie. Queste oscillazioni hanno origine da molteplici fonti, tuttavia quella che coinvolge l'accoppiamento della giunzione gap tra le cellule amacrine AII (AII-AC) e le celle bipolari a cono depolarizzante (DCBC) ha ricevuto la massima attenzione e quindi è meglio compresa1,7,11. Abbiamo trovato un'altra fonte, che persiste sotto il blocco farmacologico della suddetta rete AII-AC/DCBC e guida l'oscillazione delle SAC di tipo OFF nei topi RhoΔCTA e Nob con retine deafferenziate7,8,12. Qui descriviamo in dettaglio il nostro protocollo di preparazione dei flat-mount retinici per la registrazione dei neuroni INL. Questo approccio utilizza linee di topi commerciali (codice Jax 006410 e 007905) per marcare i neuroni retinici colinergici mediante l'espressione di una proteina fluorescente (tdTomato) identificabile al microscopio fluorescente dotato di ottiche che migliorano il contrasto. Alcuni risultati sperimentali acquisiti attraverso questo approccio sono stati precedentemente riportati4,5,7,13.
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Protocollo
l'approvazione etica - procedure che coinvolgono soggetti animali sono state condotte in conformità con le norme ei regolamenti del National Institutes of linee guida sanitarie per gli animali di ricerca, come approvato dalla cura degli animali istituzionale e usare comitato di Baylor College of Medicine.
1. esterno e delle soluzioni interne
- Utilizzare la soluzione di Ringer mammiferi durante la dissezione retina e la soluzione esterna nella successiva registrazione elettrofisiologica. Preparare la soluzione di Ringer mammiferi da 10x soluzione madre (senza calcio) il giorno della registrazione, e aggiungere CaCl 2 goccia a goccia dopo 15 min di carbogenation (95% O 2 e il 5% di CO 2). La soluzione finale 1x contiene (in mM): 120 NaCl, KCl 5, 25 NaHCO 3, 0.8 Na 2 HPO 4, 0,1 NaH 2 PO 4, 2 CaCl 2, 1 MgSO 4 e 10 D-glucosio.
- Utilizzare due soluzioni interne per caratterizzare oscillazioni SAC. Testl'utilità di soluzioni preparate in cellule intere registrazioni di patch clamp prolungati sulla RGCs topo adulto e memorizzare i lotti verificati in 500 microlitri aliquote a -20 ° C fino al momento dell'uso.
- Per la registrazione potenziale di membrana di oscillazione, utilizzare una soluzione interna a base di potassio contenente (in mM): 125 K-gluconato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina (w / v). Regolare il pH a 7,3 con KOH.
- Per la registrazione eccitatori e correnti postsinaptiche inibitorie, utilizzare una soluzione interna cesio base contenente (in mM): 100 Cs-metansolfonato, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES e 0,2% biocitina ( w / v). Regolare il pH a 7,3 con CsOH.
2. Preparazione per il giorno di registrazione
- Per preparare una membrana di nitrocellulosa con fori aperti, punch manualmente la membrana con un perforatore personalizzato fatto da un smussata 16 G ago della siringa e appiattire la membrana tra due lastre di vetro pulite. Per un all'in- grossomontare retina, fare un foro centrale di 0,2 mm di diametro e circondarla da 4 fori più grandi che sono 1-1,2 mm di diametro.
- Per fare un filamento di riempimento personalizzato per caricare soluzione interna in elettrodi, sciogliere un puntale 10 microlitri nel mezzo e allungare delicatamente la parte fusa fino a quando si raffredda e si indurisce. Appena prima dell'uso, utilizzare una lama di rasoio pulito per tagliare il filamento finché è leggermente più lungo le pipette di patch.
- Tirare le pipette di patch in un estrattore programmabile da tubo di vetro borosilicato con un filamento interno. Fabbricazione le micropipette il giorno dell'esperimento e utilizzarli immediatamente.
NOTA: per ZSC registrazione, usiamo la seguente impostazione puller: calore: 484; tirare: 0; Velocità: 25; tempo di ritardo: 1; pressione: 400 e un valore di rampa 462. L'OD e ID dei tubi borosilicato sono rispettivamente di 1,65 millimetri e 1,0 mm. La resistenza delle pipette è 10-14 MW. - Una h prima della raccolta dei tessuti, scongelare un tubo di soluzione interna per shaking su un vortex per> 30 min.
3. Retina Dissection
- Anestetizzare l'animale del 4% isoflurano in ossigeno fino a quando l'animale perde la reattività di un pizzico dito del piede. Sacrificare l'animale da dislocazione cervicale.
- Tagliare due bulbi oculari fuori i nervi ottici a distanza dalle teste del nervo ottico con Iris rette punte forbici 1-2 mm.
- Lancia i bulbi oculari su un tovagliolo di carta pulito per rimuovere il sangue e poi immergerli in una soluzione carbogenated mammiferi di Ringer. Effettuare un foro sul limbus con un ago G 23 e bisect bulbi oculari tagliando lungo il limbus con micro-forbici. Rimuovere la cornea e la lente utilizzando una pinza sottile.
- Per retina tutto il montaggio, rimuovere delicatamente tutta la retina fuori dell'epitelio pigmentato con una pinza sottile e fare tagli quattro 1,5-2 mm ortogonali dal bordo verso la testa del nervo ottico.
- Immergere una membrana di nitrocellulosa perforato nel piatto e trascinare delicatamente la retina su di esso conil GCL verso l'alto. Mettere la testa del nervo ottico nel foro centrale quando si prepara un tutto il montaggio della retina. Trasferire la membrana della retina in un altro piatto pulito. appiattire delicatamente la retina con un pennello fine per assomigliare ad una croce di Malta e porre i quattro bordi sui fori.
- Se una frazione della retina è da esaminare alla volta, tagliare ogni eyecup preparati dal punto 3.3 in 3-4 pezzi con una lama di rasoio con l'epitelio pigmentato rimane attaccato. Proteggere i pezzi inutilizzati dalla luce in soluzione esterna carbogenated e utilizzarli entro 12 ore.
- Tamponare la membrana di nitrocellulosa con un pezzo di carta da filtro asciutta e rimuovere la membrana vitreo e interna limitativo con una pinza e un pennello.
- Assicurarsi che tutti i bordi retiniche sono completamente attaccati alla membrana prima di trasferire il gruppo nella camera di registrazione con una copertura in vetro sigillato antiscivolo sul fondo. Fissare la membrana con grasso vuoto per la polizza di copertura e rehydratvia e la retina con la soluzione esterna. Non essere attenti a intrappolare eventuali bolle d'aria sotto l'assemblaggio.
- Impostare la camera sulla scena di un microscopio verticale. Profumato la camera con acqua calda (34-35 ° C) soluzione esterna carbogenated ad una velocità di ~ 3 ml al minuto.
- Esaminare la retina sotto una lente obiettivo 10X prima, e poi utilizzare un obiettivo 60x acqua-immersion per vedere i neuroni GCL e INL sotto contrasto interferenziale differenziale (DIC) e / o epifluorescenza. Per visualizzare ZSC tdTomato esprimenti, utilizzare una sorgente di luce bianca in combinazione LED con un filtro di eccitazione di 554 nm e un filtro di emissione di 581 nm.
4. patch clamp whole-cell da Flat-mount Retina
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro interno siringa nel filamento riempimento personalizzato.
- Inserire il filamento in una micropipetta appena spillata e dispensare la soluzione interna vicino alla punta fino a che la soluzione copre il filo elettrodo d'argento per>5 mm. Fissare la micropipetta su un portaelettrodo con un palo di aspirazione, attraverso il quale la pressione all'interno dell'elettrodo può essere regolata premendo o tirando lo stantuffo di una siringa di plastica da 10 ml tubo collegato.
- Trova la pipetta sotto l'obiettivo e portarlo fino a ~ 100 micron sopra la retina. Sotto la modalità corrente-seguace (I = 0), utilizzare offset DC a zero il segnale di tensione continua in piedi. Misurare la resistenza pipetta sotto il morsetto modalità corrente (I morsetto) iniettando corrente ad onda quadra di ampiezza fissa tramite la pipetta mentre è nel bagno e neutralizzare la differenza ruotando la manopola raccess. Utilizzare la lettura sulla manopola raccess per calcolare la resistenza pipetta dalla legge di Ohm.
- Portare lentamente l'elettrodo a ~ 10 micron sopra la retina. Applicare pressione positiva all'elettrodo. Guarda il cambiamento riflessione vicino alla punta della pipetta mentre si avvicina la retina. Rapidamente, ma delicatamente forzare la pipetta nel GCL e ridurre il PRESSU positivori immediatamente.
- Spostare la pipetta verso un neurone etichettati. Evitare il contatto con altri neuroni, vasi sanguigni e delle cellule endfeet Muller. Applicare una pressione più positivo, se necessario, per evitare l'intasamento degli elettrodi.
- Posizionare la punta della pipetta vicino alla linea mediana di un neurone marcato fino a quando una fossetta è visibile. Rilasciare la pressione positiva e lasciare la membrana plasmatica di riprendersi sulla punta della pipetta.
- Applicare 20 a 120 pA correnti negative alla pipetta per aiutare la formazione di una tenuta giga ohm. Applicare una delicata aspirazione se necessario tirare la membrana plasmatica nella pipetta. Attendere 5 min dopo la formazione della guarnizione di rottura della membrana cellulare. In questo modo la soluzione interna versato viene controllata da superfusione. Rompere la membrana da una delicata aspirazione.
- Dopo la rottura della membrana e in modalità morsetto corrente, accendere l'equilibrio ponte e regolarlo con la manopola raccess.
NOTA: Per una piccola cella come il SAC, è necessaria solo leggero aggiustamento, se presente. Alterntivamente, registrare eccitatorio e le correnti post-sinaptiche inibitorie in modalità morsetto tensione (V morsetto) tenendo il cellulare a potenziali inversione di cloruro (circa -75 mV) e il glutammato (circa 0 mV), rispettivamente. Controllare e regolare la posizione della pipetta, se necessario, per ospitare retina occasionale e / o micromanipolatore deriva. - Per registrare potenziale di membrana o variazione di corrente prima, durante e dopo il trattamento farmacologico, preparare bloccanti sinaptiche (ad esempio, CNQX, AP5, picrotoxin, tubocurarina, etc.) e modulatori dei canali (ad esempio, flupirtina, dopamina, acido meclofenamico, ecc) fresco su il giorno dell'esperimento dalle scorte congelati. Diluire i farmaci con la soluzione carbogenated di Ringer. applicarle in maniera lotto attraverso la perfusione.
- Dopo la registrazione, rimuovere delicatamente la pipetta dal soma. Trasferire il gruppo dalla camera di un piatto pulito. Staccare e ricollegare la retina su un altro membrana di nitrocellulosa appiattita senza Hol perforatoES per garantire la planarità della retina durante la fissazione.
- Fissare la retina immergendolo in paraformaldeide al 4% per 30 minuti a RT. Rimuovere la retina dalla membrana di nitrocellulosa e risciacquare a lungo con PBS 1x. Rivela la morfologia delle cellule registrate da O / N colorazione con streptavidina colorante coniugato diluito in PBS 1x con 0,4% Triton X-100 a 4 ° C 14. Montare la retina in media antifade e osservare le cellule registrati utilizzando un microscopio confocale a scansione.
NOTA: Le procedure che coinvolgono paraformaldeide, che è volatile e tossica, dovrebbero essere condotte in un progetto da camera per la sicurezza.
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Risultati
Registrazioni rappresentativi di on e off-tipo ZSC da una retina deafferentated del mouse sono mostrati in figura 1. Le cellule colinergici sia in GCL e INL può essere attendibilmente identificate da tdTomato fluorescenza e mirati per la cellula intera registrazione patch clamp sotto DIC (Figura 1A) a rivelare l'oscillazione dei loro potenziali di membrana (in alto tracce) e le correnti sinaptiche che la determinano (tracce di fondo, figura 1...
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Discussione
Molti laboratori hanno registrato dai neuroni GCL nella preparazione 15-18 TV a monte, ma le nostre procedure consentono la registrazione da neuroni INL. Con la presente sottolineare diversi passaggi che sono fondamentali per le registrazioni di routine di successo.
La freschezza e planarità della retina sono importanti per penetrare con una pipetta di registrazione. A questo proposito, il fermo attaccamento della retina alla membrana di nitrocellulosa perforato è fondamentale e s...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Joung Jang e Xin Guan per l'assistenza tecnica. Ringraziamo il Dr. Rory McQuiston della Virginia Commonwealth University per aver installato il nostro primo patch clamp rig e per i consigli sulle procedure sperimentali. Ringraziamo il Dr. Samuel Wu per i suggerimenti sulla registrazione del morsetto di tensione. Il lavoro è supportato da sovvenzioni NIH EY013811, EY022228 e da una sovvenzione Vision Core EY002520. C-KC è la cattedra Alice R. McPherson Retina Research Foundation presso il Baylor College of Medicine.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio fluorescente a stadio fisso con | Olympus | BX51-WI | |
| Sutter | MP-225 | ||
| A-M System | AM2400 | ||
| AD convertitore | National Instrument | NI-USB-6221 | |
| Controller riscaldatore | Warner Instrument | TC-324B | |
| Inline riscaldatore | Warner Instrument | SC-20 | |
| Pompa peristaltica | Estrattore | Rainin Dynamax | |
| Sutter Instrument | P-1000 | ||
| Tubo di vetro con filamento | King Precision Glass | Stimolatore personalizzato | |
| A.M.P.I. | Master-8 | ||
| Biocitina | Sigma | B4261 | |
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-1 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S0876 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S5011 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| MgSO4 | Sigma | M1880 | |
| D-glucosio | Sigma | G6152 | |
| K-gluconato | Sigma | G4500 | |
| ATP-Mg | Sigma | A9187 | |
| Li-GTP | Sigma | G5884 | |
| EGTA | Sigma | E0396 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KOH | Sigma | P5958 | |
| Cs-metansolfonato | Sigma | C1426 | |
| CsOH | Sigma | 232041 | |
| Filtro siringa | Nalgene | 171 | |
| 1 ml siringa | Rainin | ||
| 10 μ l puntale per pipetta | Genesee Scientific | 24-130RL | |
| Streptavidina-488 | ThermoFisher | S-11223 | |
| 10x PBS | Lonza | 17-517Q |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
