Articolo metodologico

Patch clamp di celle Starburst amacrine in un appartamento di montaggio Preparazione di Deafferentated mouse Retina

DOI:

10.3791/54608

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13 ottobre 2016

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1Department of Ophthalmology, Baylor College of Medicine, 2Department of Neuroscience, Baylor College of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Baylor College of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo dimostra come eseguire cellula intera registrazione patch clamp su neuroni della retina da una preparazione TV a montare.

Abstract

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La retina dei mammiferi è un tessuto stratificato composto da più tipi di neuroni. Per capire come i segnali visivi vengono elaborati all'interno della propria rete sinaptica intricata, registrazioni elettrofisiologiche sono spesso utilizzati per studiare le connessioni tra i singoli neuroni. Abbiamo ottimizzato una preparazione TV a monte per la registrazione patch clamp di neuroni geneticamente marcate sia in GCL (strato di cellule gangliari) e INL (strato nucleare interno) di retine di topo. Registrazione neuroni INL a Flat-monti è favorita rispetto fette perché le connessioni sia verticali e laterali sono conservati nella ex di configurazione, consentendo circuiti della retina con componenti di grandi dimensioni laterali da studiare. Abbiamo usato questa procedura per confrontare le risposte dei neuroni specchio-partnered in retine come i colinergici cellule amacrine starburst (ZSC).

Introduzione

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Come parte facilmente accessibile del sistema nervoso centrale, la retina è stata per decenni un modello utile negli studi di neuroscienze. La marcatura genetica dei neuroni ha permesso una caratterizzazione dettagliata delle connessioni sinaptiche nella retina. Con molte metodologie disponibili per esaminare la funzione e la morfologia dei neuroni retinici, la tecnica di registrazione patch clamp è stata determinante per la nostra attuale comprensione dei segnali trasmessi verticalmente nella retina. Questi segnali sono originati dall'assorbimento di fotoni nei fotorecettori e inviati ai centri visivi del cervello attraverso lo spiking delle cellule gangliari retinic....

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Protocollo

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l'approvazione etica - procedure che coinvolgono soggetti animali sono state condotte in conformità con le norme ei regolamenti del National Institutes of linee guida sanitarie per gli animali di ricerca, come approvato dalla cura degli animali istituzionale e usare comitato di Baylor College of Medicine.

1. esterno e delle soluzioni interne

  1. Utilizzare la soluzione di Ringer mammiferi durante la dissezione retina e la soluzione esterna nella successiva registrazione elettrofisiologica. Preparare la soluzione di Ringer mammiferi da 10x soluzione madre (senza calcio) il giorno della registrazione, e aggiungere CaCl 2 goccia a goccia do....

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Risultati

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Registrazioni rappresentativi di on e off-tipo ZSC da una retina deafferentated del mouse sono mostrati in figura 1. Le cellule colinergici sia in GCL e INL può essere attendibilmente identificate da tdTomato fluorescenza e mirati per la cellula intera registrazione patch clamp sotto DIC (Figura 1A) a rivelare l'oscillazione dei loro potenziali di membrana (in alto tracce) e le correnti sinaptiche che la determinano (tracce di fondo, figura 1b).<.......

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Discussione

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Molti laboratori hanno registrato dai neuroni GCL nella preparazione 15-18 TV a monte, ma le nostre procedure consentono la registrazione da neuroni INL. Con la presente sottolineare diversi passaggi che sono fondamentali per le registrazioni di routine di successo.

La freschezza e planarità della retina sono importanti per penetrare con una pipetta di registrazione. A questo proposito, il fermo attaccamento della retina alla membrana di nitrocellulosa perforato è fondamentale e s.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Joung Jang e Xin Guan per l'assistenza tecnica. Ringraziamo il Dr. Rory McQuiston della Virginia Commonwealth University per aver installato il nostro primo patch clamp rig e per i consigli sulle procedure sperimentali. Ringraziamo il Dr. Samuel Wu per i suggerimenti sulla registrazione del morsetto di tensione. Il lavoro è supportato da sovvenzioni NIH EY013811, EY022228 e da una sovvenzione Vision Core EY002520. C-KC è la cattedra Alice R. McPherson Retina Research Foundation presso il Baylor College of Medicine.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Microscopio fluorescente a stadio fisso conOlympusBX51-WI
SutterMP-225
A-M SystemAM2400
AD convertitoreNational InstrumentNI-USB-6221
Controller riscaldatoreWarner InstrumentTC-324B
Inline riscaldatoreWarner InstrumentSC-20
Pompa peristalticaEstrattoreRainin Dynamax
Sutter InstrumentP-1000
Tubo di vetro con filamentoKing Precision GlassStimolatore personalizzato
A.M.P.I.Master-8
BiocitinaSigmaB4261
NaClSigmaS6191
KClSigmaP5405
NaHCO3FisherBP328-1
Na2HPO4SigmaS0876
Na2HPO4SigmaS5011
CaCl2SigmaC5670
MgSO4SigmaM1880
D-glucosioSigmaG6152
K-gluconatoSigmaG4500
ATP-MgSigmaA9187
Li-GTPSigmaG5884
EGTASigmaE0396
HEPESSigmaH4034
KOHSigmaP5958
Cs-metansolfonatoSigmaC1426
CsOHSigma232041
Filtro siringaNalgene171
1 ml siringaRainin
10 μ l puntale per pipettaGenesee Scientific24-130RL
Streptavidina-488ThermoFisherS-11223
10x PBSLonza17-517Q
micromanipolatori DIC Amplificatore patch clamp per pipette 17013002

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, H., et al. Intrinsic bursting of AII amacrine cells underlies oscillations in the rd1 mouse retina. J Neurophysiol. 112 (6), 1491-1504 (2014).
  2. Gregg, R. G., et al.

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Ristampe e permessi

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Tag

Patch clamp in configurazione whole cellneurobiologia retinicafluorescenza tdTomatostrato delle cellule gangliaristrato nucleare internocircuitazione retinica

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