Descriviamo un protocollo dettagliato utilizzando la microscopia episcopica ad alta risoluzione per acquisire immagini tridimensionali (3D) di embrioni di topo. Questo protocollo migliorato utilizza un metodo di preparazione dei tessuti modificato per migliorare la penetrazione del colorante fluorescente, consentendo così l'analisi morfometrica di campioni sia di piccole che di grandi dimensioni.
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Articolo metodologico
Rapida acquisizione di immagini 3D utilizzando ad alta risoluzione Episcopica Microscopia
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In questo articolo
Sommario
Abstract
La tecnologia di microscopia episcopica ad alta risoluzione (HREM) consente l'acquisizione rapida di dati morfometrici digitali volumetrici e tridimensionali (3D) ad alta risoluzione. Qui, descriviamo il protocollo dettagliato per visualizzare l'intero embrione di topo. Il protocollo è composto da quattro sezioni principali: preparazione del campione, inclusione, acquisizione di immagini e, infine, visualizzazione 3D. La tecnologia richiede che i campioni siano colorati con un colorante fluorescente, che può essere problematico per campioni grandi o densi. Per superare questa limitazione, abbiamo migliorato il protocollo esistente per migliorare la penetrazione tissutale del colorante pretrattando il campione con una soluzione contenente urea e dodecil solfato di sodio. Il protocollo utilizza solo apparecchiature di laboratorio e reagenti di routine per un facile adattamento in ambienti di laboratorio standard. Dimostriamo che le immagini 3D ad alta risoluzione risultanti riassumono fedelmente le caratteristiche morfologiche dettagliate degli organi interni degli embrioni di topo, consentendo così analisi morfometriche. Insieme, presentiamo un protocollo dettagliato e migliorato utilizzando apparecchiature di laboratorio standard per acquisire immagini 3D ad alta risoluzione di campioni di piccole e grandi dimensioni.
Introduzione
L'avvento delle tecnologie di imaging 3D ha aperto la possibilità di analisi sistemica di caratteristiche morfologiche dettagliate durante lo sviluppo fetale. È ora disponibile una varietà di modalità di imaging 3D, tra cui la risonanza micromagnetica (micro-MRI), la micro tomografia computerizzata, l'ecografia ad alta frequenza, la tomografia a coerenza ottica, la tomografia ottica a progetto e la microscopia episcopica1-4. Ogni modalità ha le sue caratteristiche uniche in termini di risoluzione, contrasto, velocità, costo, capacità in utero e disponibilità.
L'acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) e ....
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Protocollo
Tutti gli usi animali sono approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali all'ospedale dei bambini Boston.
Preparazione 1. Esempio
- accoppiamento temporizzata
- Inserire un C57Bl6 tipo selvaggio maschio e una femmina insieme nella stessa gabbia.
- Controllare per la formazione di una spina di accoppiamento mattina successiva. La spina di accoppiamento (aka, vaginale o la spina copula) è una deposizione gelatinosa indurito che blocca la vagina.
- Impostare la data presa come giorno embrionale 0,5 (E0.5).
- Isolamento di embrioni di topo
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Risultati
Abbiamo riportato le immagini HREM di alta qualità di embrioni di topo tra E9.5 e E13.5 8. La qualità dell'immagine degli embrioni fine scena, tuttavia, è notevolmente compromessa a causa della penetrazione tissutale limitata del eosina colorante fluorescente. Per aumentare l'efficienza di colorazione, abbiamo testato diversi metodi di pretrattamento che sono compatibili all'imaging fluorescente 11. In particolare, gli embrioni di topo E15.5 sono stati t.......
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Discussione
Qui, vi presentiamo un protocollo modificato utilizzando attrezzature di laboratorio di routine per acquisire immagini HREM seriali che sono compatibili per la visualizzazione 3D rapida e analisi morfometrica di strutture complesse. Perché le immagini ad alta risoluzione sono presi direttamente dalla faccia blocco, invece di singole sezioni, le caratteristiche morfologiche pregiati sono conservati e rapidamente ricostruito digitalmente in un programma di visualizzazione 3D.
imaging 3D offre .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i dottori Yichen Huang, Chunming Guo e Zhenfang Zhou per il loro supporto tecnico. Questa ricerca è stata finanziata da NIH/NIDDK (1R01DK091645-01A1, XL) e American Heart Association (AHA, 13GRNT16950006, XL).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Topi | The Jackson Laboratory | C57BL6 | |
| Alcool etilico | Pharmco-Aaper | 111000200 | 200 Proof, Absolute, ACS / USP / Kosher Grade |
| Formalina | Sigma | HT501128-4L | |
| Urea | Sigma | U5128 | Soluzione di chiarificazione |
| Glycerol Fisher scientific G33-4Sodio Dodecil Solfato | Invitrogen | 15525-017 | Soluzione di pulizia |
| Eosina Y Sale disodico | Fisher scientific | BP241925 | Soluzione di infiltrazione |
| Acridina Orange hemi (cloruro di zinco) sale | Sigma | A6014 | Soluzione di infiltrazione |
| Whatman carta | GE | 3030-153 | |
| JB-4 Kit di inclusione - Soluzione A | Polysciences, Inc. | 0226A-800 | Soluzione di infiltrazione |
| JB-4 Kit di inclusione - Soluzione B | Polysciences, Inc. | 0226B-30 | Soluzione di inclusione |
| JB-4 Kit di inclusione - Catalyst | Polysciences, Inc. | 02618-12 | Soluzione di infiltrazione |
| Stampi per incorporamento | Polysciences, Inc. | 23185-1 | 16 x 8 mm |
| Peel-A-Way Sharp Embedding Stampi | Polysciences, Inc. | 18986-1 | 22 mm x 22 mm quadrato, troncato a 12 mm x 12 mm |
| JB-4 Supporti per blocchi in plastica | Polysciences, Inc. | 15899 | |
| Tubi di trasferimento graduati monouso | VWR | 414004-014 | |
| Piatto Petrl | VWR | 25384-088 | Pinze per dissezione embrionale |
| Punta in acciaio | ROBOZ | RS-5015 | Dissezione embrionale |
| Graefe Pinza tissutale | ROBOZ | RS-5153 | Dissezione embrionale |
| Forbice operativa delicata | ROBOZ | RS-6700 | Dissezione embrionale |
| 14 ml Polipropilene Provette a fondo tondo | Falcon | 352059 | |
| 50 ml Provette coniche | in polipropilene Falcon | 352098 | |
| Secchiello per il ghiaccio | Magic Touch Iceware International Corp. | R19-343 | |
| 100 ml (3.4 once) Pese in polistirene antistatico Barche | VWR | 89106-766 | |
| 330 ml (11.2 oz.) Pesa Polistirene Antistatico VWR | 89106-770 | ||
| Cloruro di Sodio | MP Biomedicals | 102892 | Soluzione PBS |
| Cloruro di Potassio | Sigma | P0662 | Soluzione PBS |
| Fosfato di Potassio monobasico | Sigma | P5405 | PBS |
| Fosfato di sodio eptaidrato Bibasico | Sigma-Aldrich | S9390 | PBS |
| Fotocamera digitale | Hamamatsu Photonics | C11440-10C | |
| Microtomo | Leica | RM2265 | |
| Illuminatore | Carl Zeiss | HXP 200C | |
| Microscopio stereo zoom a fluorescenza | Carl Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Stereomicroscopio | Olympus | SZX16 | |
| Sorgente luminosa in fibra ottica | Leica | KL 1500 LCD | |
| monouso microtomo lama | VWR | 95057-832 | |
| bordo | dispenser Personna | 62-0330-0000 | |
| ZEN | Carl Zeiss | pro 2012 | |
| Photoshop | Adobe | CS6 v13.0 | |
| Amira 3D Software | Visage Imaging | 5.4 | |
| Computer | Dell T7600, 2 dischi rigidi SAS da 900 GB e 64 GB di memoria | ||
| Agitatori a piattaforma oscillante | VWR | 40000-304 | |
| Agitatore con piastra riscaldante standard | VWR | 12365-382 | |
| Bilancia analitica | Mettler Toledo | AB54-S |
Riferimenti
- Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizi....
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Ristampe e permessi
