Rapida acquisizione di immagini 3D utilizzando ad alta risoluzione Episcopica Microscopia

Sommario

Descriviamo un protocollo dettagliato utilizzando la microscopia episcopica ad alta risoluzione per acquisire immagini tridimensionali (3D) di embrioni di topo. Questo protocollo migliorato utilizza un metodo di preparazione dei tessuti modificato per migliorare la penetrazione del colorante fluorescente, consentendo così l'analisi morfometrica di campioni sia di piccole che di grandi dimensioni.

Abstract

La tecnologia di microscopia episcopica ad alta risoluzione (HREM) consente l'acquisizione rapida di dati morfometrici digitali volumetrici e tridimensionali (3D) ad alta risoluzione. Qui, descriviamo il protocollo dettagliato per visualizzare l'intero embrione di topo. Il protocollo è composto da quattro sezioni principali: preparazione del campione, inclusione, acquisizione di immagini e, infine, visualizzazione 3D. La tecnologia richiede che i campioni siano colorati con un colorante fluorescente, che può essere problematico per campioni grandi o densi. Per superare questa limitazione, abbiamo migliorato il protocollo esistente per migliorare la penetrazione tissutale del colorante pretrattando il campione con una soluzione contenente urea e dodecil solfato di sodio. Il protocollo utilizza solo apparecchiature di laboratorio e reagenti di routine per un facile adattamento in ambienti di laboratorio standard. Dimostriamo che le immagini 3D ad alta risoluzione risultanti riassumono fedelmente le caratteristiche morfologiche dettagliate degli organi interni degli embrioni di topo, consentendo così analisi morfometriche. Insieme, presentiamo un protocollo dettagliato e migliorato utilizzando apparecchiature di laboratorio standard per acquisire immagini 3D ad alta risoluzione di campioni di piccole e grandi dimensioni.

Introduzione

L'avvento delle tecnologie di imaging 3D ha aperto la possibilità di analisi sistemica di caratteristiche morfologiche dettagliate durante lo sviluppo fetale. È ora disponibile una varietà di modalità di imaging 3D, tra cui la risonanza micromagnetica (micro-MRI), la micro tomografia computerizzata, l'ecografia ad alta frequenza, la tomografia a coerenza ottica, la tomografia ottica a progetto e la microscopia episcopica^1-4. Ogni modalità ha le sue caratteristiche uniche in termini di risoluzione, contrasto, velocità, costo, capacità in utero e disponibilità.

L'acquisizione di immagini a fluorescenza episcopica (EFIC) e la microscopia episcopica ad alta risoluzione (HREM) sono metodi di imaging per microscopia episcopica⁴. In questo caso, le immagini seriali ad alta risoluzione vengono acquisite in modo continuo dalla faccia del blocco anziché dalle sezioni di tessuto. Le immagini risultanti riflettono fedelmente le caratteristiche morfologiche dettagliate con una distorsione tissutale minima o nulla. I dati volumetrici acquisiti vengono prontamente convertiti in immagini 3D ad alta risoluzione adatte per un'accurata analisi morfometrica. A causa del costo relativamente basso e dell'alta risoluzione, HREM ed EPIC sono diventate le alternative superiori per la valutazione sistemica di modelli murini di difetti congeniti umani^2,4-8.

Sia il metodo EFIC che quello HREM richiedono che i campioni siano incorporati nel mezzo adatto. EFIC rileva l'autofluorescenza emessa dal tessuto incorporato. Per questo motivo, è limitato ai campioni che emettono alti livelli di autofluorescenza, ma non a quelli con autofluorescenza relativamente debole come gli embrioni in fase iniziale⁹. Per superare la dipendenza dall'autofluorescenza, i campioni vengono colorati con un colorante fluorescente come l'eosina per l'imaging HREM. La scelta dei coloranti e dei metodi di colorazione rende anche HREM più compatibile per rilevare i segnali molecolari nel contesto dell'architettura e della morfologia dei tessuti^4,10.

In questo articolo, presentiamo un protocollo HREM migliorato adatto per la valutazione di tutto il corpo degli embrioni di topo in fase avanzata. Per facilitare la colorazione, includiamo una fase di pretrattamento per aumentare la penetrazione nei tessuti, consentendo così l'imaging HREM di embrioni di topo più vecchi.

Protocollo

Tutti gli usi animali sono approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali all'ospedale dei bambini Boston.

Preparazione 1. Esempio

1. accoppiamento temporizzata
   1. Inserire un C57Bl6 tipo selvaggio maschio e una femmina insieme nella stessa gabbia.
   2. Controllare per la formazione di una spina di accoppiamento mattina successiva. La spina di accoppiamento (aka, vaginale o la spina copula) è una deposizione gelatinosa indurito che blocca la vagina.
   3. Impostare la data presa come giorno embrionale 0,5 (E0.5).
2. Isolamento di embrioni di topo
   1. Eutanasia femmine gravide da CO ₂ asfissia.
   2. Mettere topi supina su un tampone assorbente e spruzzare regione addominale con il 70% di etanolo.
   3. Sollevare la pelle e rendere una prima incisione 5 mm per la regione addominale caudale con le forbici chirurgiche. Tagliare e rimuovere la pelle addominale per esporre completamente gli organi interni
   4. Tagliare vicino vagina per rimuovere l'intero utero.
   5. Tagliare tra i siti di impianto lungo il corno uterino. Ogni segmento o concepito dovrebbe avere un solo embrione dentro.
   6. Mantenere i segmenti uterine a 1x fosfato ghiacciata salina tamponata (PBS).
3. embrione dissezione
   1. Luogo ogni conceptus in un piatto a parte con PBS ghiacciato sotto uno stereoscopio.
   2. Rimuovere i tessuti uterini, placenta e poi membrane fetali in modo sequenziale utilizzando dissettore sottili.
   3. Trasferire l'embrione sezionato ad un tubo da 50 ml con 1x freddo ghiaccio PBS utilizzando una pipetta di trasferimento di grandi dimensioni. Evitare di raccogliere embrione direttamente con una pinza per ridurre al minimo i danni ai tessuti.
4. Fissazione
   1. Fissare gli embrioni sezionati a 10% soluzione neutra formalina tamponata a 4 ° C per più di 24 ore con almeno 10 volumi di campione di fissativo.
5. Pretrattamento
   1. Preparare la Soluzione Clearing: 4M urea, 10% glicerolo, 4% di sodio dodecilsolfato (SDS) in acqua bidistillata.
   2. Sostituire il fissativo con la soluzione Clearing.
   3. Ruotare delicatamente il campione su un rocker a temperatura ambiente per 1 - 2 settimane. Sostituire la soluzione compensazione una volta al secondo e al terzo giorno. Il campione diventa lentamente chiaro e traslucido.
   4. Sostituire la soluzione di compensazione con formalina al 10% e lasciare su una sedia a dondolo per 2 giorni.
6. Disidratazione
   1. Lavare i campioni pretrattati con 1x PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno.
   2. Disidratare i campioni in una serie di etanolo ascendente a temperatura ambiente su una sedia a dondolo gentile. Per embrioni E15.5, utilizzare una serie ascendente di etanolo incluso il 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% e 100% etanolo, 2 hr ogni passo. Per embrioni più vecchi, il tempo di incubazione deve essere aumentata.
7. colorazione
   1. Preparare la colorazione Soluzione: aggiungere 0.1375 grammi di eosina Y Disodium Salt e 0,0275 grammi di arancio di acridina emi (cloruro di zinco) sale a 50 ml di etanolo al 100%. Mescolare per 2 ore. Filtro con una carta da filtro. Conservare a temperatura ambiente ed evitare la luce coprendo con un foglio di alluminio.
   2. Trasferire esemplare per la soluzione colorante per 1 ora.
   3. Sostituire con soluzione colorante fresco e macchia durante la notte.
8. Infiltrazione
   1. Preparare infiltrazione Soluzione: coniugare 100 ml di soluzione A di JB-4 kit di embedding, 1,25 g di catalizzatore C, 0,275 g di eosina Y Disodium Salt e 0,055 g di acridina arancio emi (cloruro di zinco) sale. Mescolare per mescolare (200 rpm) in un secchio di ghiaccio per 2 ore, e poi filtrare con la carta da filtro.
   2. Conservare la soluzione di infiltrazione a 4 ° C per evitare la luce coprendo con un foglio di alluminio.
   3. Trasferire gli embrioni per infiltrazione Soluzione: La colorazione Soluzione (1: 1), e incubare per almeno 3 ore su una sedia a dondolo a 4 ° C.
   4. Trasferire gli embrioni per infiltrazione Solution e incubare per 3 orer su un bilanciere in una camera fredda.
   5. Sostituire infiltrazione soluzione una volta al giorno, e lasciare in una stanza fredda su una sedia a dondolo dolce per altri tre giorni.

2. Embedding

1. Mantenere Soluzione B e l'infiltrazione soluzione su ghiaccio.
2. Fare Embedding Solution (01:25 di soluzione B e infiltrazione Solution) immediatamente prima di incorporamento.
3. Orientare il campione in uno stampo embedding, poi versare freddo Solution Incorporare nello stampo embedding delicatamente. Ri-orientare con uno spillo, se necessario.
4. Utilizzare un perno per esaminare se la soluzione Embedding è solidificato. Spingere il blocco del campione, e tagliare, se necessario.
5. Riorientare il blocco del campione usando lo stampo separata per ottenere un orientamento trasversale.
6. Mettere un titolare di blocco sulla parte superiore dello stampo embedding. Delicatamente versare Integrazione Soluzione nello stampo fino a quando lo stampo e il titolare del blocco sono sommersi da Incorporare Solution.
7. Conservare il campione in un contenitore secondario e lasciarein ghiaccio per 3 - 4 ore in una cappa aspirante.
8. Conservare i campioni solidificati in un 4 ° C.
9. Sbucciare via lo stampo embedding. Mettere il blocco con lo stereomicroscopio con illuminazione obliqua per ispezionare la posizione del campione nel blocco. Sulla faccia del blocco, le linee della griglia marchio in tutto il campione.
10. Tagliare il blocco per rimuovere quantità accesso di incorporare materiale utilizzando le linee della griglia indicati come riferimenti.

3. Acquisizione di immagini

1. Bloccare il blocco del campione al microtomo e ottenere una superficie di taglio fresco. Impostare lo spessore della sezione (ad esempio, e9.5-10.5, 1,5 micron; e11.5-12.5, 2,0 micron; e13.5-15.5, 2,5 micron; E16.5-anziani, 3 micron). Mantenere il campione / blocco alla posizione iniziale del microtomo.
2. Montare il stereo microscopio con zoom fronte orizzontalmente la superficie del blocco di campione.
3. Accendere il computer e il microscopio, e avviare il software di acquisizione delle immagini.
4. Visualizzare e mettere a fuoco l'ottica al blocco facciain modalità "live view" del software di imaging.
5. Allineate microscopio e microtomo se necessario in modo che il blocco faccia è al centro del mirino.
6. Regolare zoom in modo che l'intero blocco-faccia è nel mirino.
7. Selezionare verde filtro proteina fluorescente (GFP) (eccitazione 470 ± 20 nm, dicroiche 495 nm, emissione di 525 ± 25 nm) e riorientare, se necessario.
8. Misurare e impostare il tempo di esposizione manualmente (ad esempio, 80-400 mini sec).
9. Acquisire le immagini del blocco faccia dopo ogni taglio fresco e salvare automaticamente le immagini, se possibile.
10. Registra parametri importanti, tra cui la risoluzione, spessore della sezione e lo zoom.
11. Dopo aver terminato l'intero campione, l'esportazione e convertire tutti i file di immagine in formato JPEG, se necessario.
12. Invertire tutte le immagini originali che utilizzano un software di elaborazione delle immagini, e regolare la luminosità e il contrasto.
13. Salvare tutte le immagini elaborate in una cartella separata.

4. 3DVisualizzazione

1. Carica tutte le immagini elaborate da un software di visualizzazione 3D seguendo le istruzioni.
2. Risoluzione e spessore della sezione per convertire tutte le immagini a dati volumetrici (ad esempio, le dimensioni voxel) e salvare il file 3D.
3. Allineare tutte le immagini utilizzando la modalità automatica. Regolare le singole immagini manualmente, se necessario.
4. Salvare l'immagine allineata a un nuovo nome file.
5. Analizzare le caratteristiche morfometriche del campione utilizzando il software di visualizzazione 3D.

Risultati

Abbiamo riportato le immagini HREM di alta qualità di embrioni di topo tra E9.5 e E13.5 ^8. La qualità dell'immagine degli embrioni fine scena, tuttavia, è notevolmente compromessa a causa della penetrazione tissutale limitata del eosina colorante fluorescente. Per aumentare l'efficienza di colorazione, abbiamo testato diversi metodi di pretrattamento che sono compatibili all'imaging fluorescente ^11. In particolare, gli embrioni di topo E15.5 sono stati trattati con ...

Discussione

Qui, vi presentiamo un protocollo modificato utilizzando attrezzature di laboratorio di routine per acquisire immagini HREM seriali che sono compatibili per la visualizzazione 3D rapida e analisi morfometrica di strutture complesse. Perché le immagini ad alta risoluzione sono presi direttamente dalla faccia blocco, invece di singole sezioni, le caratteristiche morfologiche pregiati sono conservati e rapidamente ricostruito digitalmente in un programma di visualizzazione 3D.

imaging 3D offre ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Topi	The Jackson Laboratory	C57BL6
Alcool etilico	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS / USP / Kosher Grade
Formalina	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Soluzione di chiarificazione
Glycerol Fisher scientific G33-4Sodio Dodecil Solfato	Invitrogen	15525-017	Soluzione di pulizia
Eosina Y Sale disodico	Fisher scientific	BP241925	Soluzione di infiltrazione
Acridina Orange hemi (cloruro di zinco) sale	Sigma	A6014	Soluzione di infiltrazione
Whatman carta	GE	3030-153
JB-4 Kit di inclusione - Soluzione A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Soluzione di infiltrazione
JB-4 Kit di inclusione - Soluzione B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Soluzione di inclusione
JB-4  Kit di inclusione - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Soluzione di infiltrazione
Stampi per incorporamento	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Stampi	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm quadrato, troncato a 12 mm x 12 mm
JB-4  Supporti per blocchi in plastica	Polysciences, Inc.	15899
Tubi di trasferimento graduati monouso	VWR	414004-014
Piatto Petrl	VWR	25384-088	Pinze per dissezione embrionale
Punta in acciaio	ROBOZ	RS-5015	Dissezione embrionale
Graefe Pinza tissutale	ROBOZ	RS-5153	Dissezione embrionale
Forbice operativa delicata	ROBOZ	RS-6700	Dissezione embrionale
14 ml Polipropilene Provette a fondo tondo	Falcon	352059
50 ml Provette coniche	in polipropilene Falcon	352098
Secchiello per il ghiaccio	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 once) Pese in polistirene antistatico Barche	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Pesa Polistirene Antistatico VWR		89106-770
Cloruro di Sodio	MP Biomedicals	102892	Soluzione PBS
Cloruro di Potassio	Sigma	P0662	Soluzione PBS
Fosfato di Potassio monobasico	Sigma	P5405	PBS
Fosfato di sodio eptaidrato Bibasico	Sigma-Aldrich	S9390	PBS
Fotocamera digitale	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtomo	Leica	RM2265
Illuminatore	Carl Zeiss	HXP 200C
Microscopio stereo zoom a fluorescenza	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereomicroscopio	Olympus	SZX16
Sorgente luminosa in fibra ottica	Leica	KL 1500 LCD
monouso microtomo lama	VWR	95057-832
bordo	dispenser Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2 dischi rigidi SAS da 900 GB e 64 GB di memoria
Agitatori a piattaforma oscillante	VWR	40000-304
Agitatore con piastra riscaldante standard	VWR	12365-382
Bilancia analitica	Mettler Toledo	AB54-S