Qui, descriviamo la preparazione e l'uso di una sonda per attività (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] carbammato) che consente la rilevazione e quantificazione del forma attiva dell'enzima proinfiammatorie N amidasica acido -acylethanolamine (NAAA), sia in vitro ed ex vivo.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
profiling proteine Activity-based (ABPP) è un metodo per l'identificazione di un enzima di interesse in un proteoma complessa attraverso l'uso di una sonda chimica che bersaglia siti attivi dell'enzima. Un tag giornalista introdotto nella sonda permette di rilevare dell'enzima etichettati da in-gel fluorescenza scansione, proteine blot, microscopia a fluorescenza o spettrometria cromatografia-massa liquida. Qui, descriviamo la preparazione e l'uso del ARN14686 composto, una sonda a base di attività di clic chimica (CC-ABP) che riconosce selettivamente l'enzima N amidasi acido -acylethanolamine (NAAA). NAAA è una idrolasi cisteina che promuove l'infiammazione disattivando endogeni agonisti del recettore-alfa proliferazione dei perossisomi attivato (PPAR), come palmitoiletanolamide (PEA) e oleoylethanolamide (OEA). NAAA viene sintetizzato come full-length inattiva proenzyme, che viene attivato dal autoproteolysis nel pH acido del lisosoma. studi di localizzazione have dimostrato che NAAA è prevalentemente espressa in macrofagi e altre cellule derivate da monociti, nonché in B-linfociti. Forniamo esempi di come ARN14686 può essere utilizzato per rilevare e quantificare NAAA attiva ex vivo nei tessuti di roditori da proteine macchia e microscopia a fluorescenza.
Introduzione
Comunemente utilizzati metodi per indagare i pattern di espressione, le interazioni e le funzioni delle proteine, comprese le piattaforme di spettrometria di cromatografia-massa liquida per l'analisi fucile 1,2, lievito metodi doppio ibrido 3,4, e in vitro, sono limitati nel senso che sono in grado di valutare l'attività delle proteine nel loro stato nativo. Attività a base di proteine profiling (ABPP) può essere utilizzato per colmare questa lacuna. In questo approccio, piccola molecola sonde in grado di legare covalentemente al sito attivo di un enzima di interesse vengono coniugati ad un gruppo giornalista che consente il....
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Protocollo
Attenzione: Tutte le reazioni di chimica devono essere eseguite in una cappa ventilata e con l'uso di un camice, guanti e occhiali protettivi. Le reazioni dovrebbero essere effettuate anche in un ambiente di azoto.
Dichiarazione etica: Le nostre procedure che coinvolgono gli animali vengono eseguite in conformità con la normativa italiana in materia di protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri scientifici (DM 116192), e dei regolamenti della Comunità economica europea (GU L 358/1 del CE 1986/12/18 ).
NOTA: Sintesi di [(3 S) -2-oxoazetidin-3-il] acetato di ammonio è descritto ad rese grandi (50 g di N -Cbz-L-serina), ma può es....
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Risultati
ARN14686 è stato progettato sulla base del patibolo dell'inibitore ARN726 NAAA. Il gruppo 4-butil-cicloesil di ARN726 stato sostituito con una catena alifatica C9 saturo recanti un tag alchino terminale (Figura 1). Il tag alkyne stato introdotto per permettere l'uso di una procedura di etichettatura in due fasi per aggiungere un fluoroforo o una molecola di biotina via CC. Questa caratteristica rende ARN14686 uno strumento molto versatile per sondare NAAA in .......
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Discussione
L'attività enzimatica è finemente regolata a diversi livelli, tra cui l'RNA di trascrizione, la sintesi proteica, traslocazione di proteine, modificazione post-traslazionale, e l'interazione proteina-proteina. Spesso, l'espressione dell'enzima da solo non tiene conto per la sua attività. ABPP stato sviluppato per studiare l'attività delle proteine nel loro stato nativo. Sono necessarie due funzioni: una sonda chimica che si lega covalentemente al sito attivo di un enzima di interesse e un tag g.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Nikon Imaging Center presso l'Istituto Italiano di Tecnologia, Genova, Italia (NIC@IIT).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,1'-sulfonildiimidazolo | Sigma Aldrich | 367818 | Nocivo |
| 2-dipiridilcarbonato | Fluorochem | 11331 | Dannoso |
| 2-metilbutano | Sigma Aldrich | M32631 | Infiammabile, tossico, pericoloso per l'ambiente acquatico |
| 4-(Dimetilammino)piridina | Sigma Aldrich | 107700 | |
| Tossico Acido acetico | Sigma Aldrich | 695092 | Infiammabile, corrosivo |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | Carbone attivo infiammabile, tossico |
| Sigma Aldrich | 161551 | ||
| Cloruro di ammonio | Sigma Aldrich | A9434 | Dannoso |
| Azide-PEG3-Biotina | Jena Biosciences | CLK-AZ104P4 | |
| Azide-PEG3-Fluor 545 | Jena Biosciences | CLK-AZ109 | |
| Kit di analisi delle proteine BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Colonne di bio-spin | Biorad | 732-6204 | |
| Biotina | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Tampone bloccante | Li-Cor Biosciences | 927-40000 | |
| β-mercaptoetanolo | Sigma Aldrich | M6250 | Albumina sierica Bovin altamente tossica |
| (BSA) | Sigma Aldrich | A7030 | |
| Blu di bromofenolo | Sigma Aldrich | B0126 | |
| Bruker Avance III 400 | Bruker | ||
| Celite | Sigma Aldrich | 419931 | Pericolo per la salute |
| Nitrato di ammonio cerico | Sigma Aldrich | 22249 | Ossidante, dannoso |
| idrato di cloralio | Sigma Aldrich | C8383 | |
| CuSO4.5H2O | Sigma Aldrich | 209198 | Tossico |
| Cicloesadiene | Sigma Aldrich | 125415 | Infiammabile, Pericolo per la salute |
| Cicloesano | Sigma Aldrich | 34855 | Infiammabile, Nocivo, Pericolo per la salute, Pericolo per l'ambiente |
| Diclorometano | Sigma Aldrich | 34856 | Nocivo, Pericolo per la salute |
| Etere etilico | Sigma Aldrich | 296082 | Infiammabile, Dannoso |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Acros Organics | 348441000 | |
| Dimetilsolfossido d6 (DMSO-d6) | Sigma Aldrich | 175943 | |
| Etanolo | Sigma Aldrich | 2860 | Infiammabile, Nocivo |
| Acetato di etile | Sigma Aldrich | 34858 | Infiammabile, Glicerolo nocivo |
| Sigma Aldrich | G5516 | ||
| Irdye 680-LT Streptavidin | Li-Cor Biosciences | 925-68031 | |
| IRDye680-LT Streptavidin | Licor | 925-68031 | Centrifugare brevemente prima dell'uso per precipitare complessi proteici |
| Metanolo | Sigma Aldrich | 34966 | |
| Metanolo | altamente tossico Sigma Aldrich | 34860 | Infiammabile, tossico, pericoloso per la salute |
| N-(3-Dimetilamminopropil)-N′ -etilcarbodiimmide cloridrato | Sigma Aldrich | E7750 | nocivo, corrosivo |
| N-diisopropiletilammina | Sigma Aldrich | D125806 | infiammabile, corrosivo, tossico |
| N-dimetilformammide | Sigma Aldrich | 227056 | infiammabile, nocivo, pericolo per la salute |
| N-Cbz-L-Serine | fluorochem | M03053 | Microscopia |
| confocale Nikon A1 dannosa | Nikon | Leggere il manuale utente | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel | Thermo Fisher Scientific | NP0335BOX | |
| Palladio su carbonio | Sigma Aldrich | 330108 | |
| p-anisidina | Sigma Aldrich | A88255 | Tossico, Pericolo per la salute, Pericolo |
| per l'ambienteParaformaldeide | sigma Aldrich | 441244 | Tossico, respiratorio nocivo, corrosivo, falsificabile |
| Poli(glicole etilenico) | Montante antisbiadimento Sigma Aldrich | P3265 | |
| ProLong Gold con DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | Evitare la formazione di bolle |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Sigma Aldrich | P8340 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma Aldrich | S6014 | |
| Sodio dodecil solfato (SDS) | Sigma Aldrich | L3771 | tossico, corrosivo, falsificabile |
| Sigma Aldrich | 452912 | ||
| Solfato di sodio | Sigma Aldrich | 239313 | |
| Starion FLA-9000 | scanner di immagini FUJIFILM | Leggi il manuale dell'utente | |
| Streptavidina agarosio | Thermo Fisher Scientific | 20349 | |
| Saccarosio | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Tert-butanolo | Sigma Aldrich | 360538 | Tossico, infiammabile |
| Tetraidrofurano | Sigma Aldrich | 186562 | Infiammabile, nocivo, pericoloso per la salute |
| Thiourea | Acros Organics | 424542500 | Tossico, caldo a 50 ° C per sciogliere |
| Tris | Sigma Aldrich | RDD008 | |
| Tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | |
| Tris[(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il)metil]ammina (TBTA) | Sigma Aldrich | 678937 | |
| Triton-x100 | Sigma Aldrich | X100 | Toxic |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P9416 | |
| Tween-80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ultra turrax IKA T18 omogeneizzatore di tessuti di base | IKA | ||
| Undec-10-yn-1-ol | Fluorochem | 13739 | Urea dannosa |
| Sigma Aldrich | U5378 | Tossico, caldo a 50 ° C per sciogliere |
Riferimenti
- Gygi, S. P., Han, D. K., Gingras, A. C., Sonenberg, N., Aebersold, R. Protein analysis by mass spectrometry and sequence database searching: tools for cancer research in the post-genomic era. Electrophoresis. 20, 310-319 (1999).
- Washburn, M. P., Wolters, D., Yates, J. R.
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Ristampe e permessi
