Semplici metodi per rilevare l'attivazione selettiva delle proteine G da parte dei recettori accoppiati a proteine G rimangono una sfida eccezionale nella segnalazione cellulare. Qui, i biosensori per il trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sono stati sviluppati legando a coppie un GPCR a peptidi proteici G per sondare i cambiamenti conformazionali a concentrazioni controllate in cellule vive.
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Articolo metodologico
Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fӧrster trasferimento di energia di risonanza (FRET) a base di studi sono diventati sempre più comuni nelle indagini di segnalazione GPCR. Il nostro gruppo di ricerca ha sviluppato un sensore intra-molecolare FRET per rilevare l'interazione tra subunità Gα e GPCR in cellule live che seguono la stimolazione agonista. Qui, abbiamo dettaglio il protocollo per rilevare i cambiamenti nella FRET tra il β 2 del recettore adrenergico ed il Gαs C-terminale del peptide in seguito al trattamento con 100 micron isoproterenolo cloridrato come precedentemente caratterizzati 1. Il nostro sensore FRET è un singolo polipeptide che consiste in serie di un GPCR full-length, un fluoroforo FRET accettore (mCitrine), un ER / K SPASM (sistematica di proteine affinità la forza di modulazione) linker, un fluoroforo FRET donatore (mCerulean), e un Gα C peptide -Terminal. Questo protocollo sarà la preparazione delle cellule dettaglio, le condizioni di trasfezione, installazione di apparecchiature, l'esecuzione del test, e analisi dei dati. Questo disegno sperimentale rileva piccolo changes in FRET indicativi di interazioni proteina-proteina, e può anche essere utilizzato per confrontare la forza di interazione tra ligandi e abbinamenti di proteine GPCR-G. Per migliorare il rapporto segnale-rumore nelle nostre misurazioni, questo protocollo richiede precisione accresciuto in tutte le fasi, ed è presentato qui per consentire l'esecuzione riproducibile.
Introduzione
recettori G-proteina-accoppiati (GPCR) sono recettori sette transmembrana. Il genoma umano contiene solo circa 800 geni codificanti per GPCR, attivati da una varietà di ligandi compresi luce, odoranti, ormoni, peptidi, farmaci e altre piccole molecole. Quasi il 30% di tutti i farmaci attualmente sul GPCR bersaglio mercato perché svolgono un ruolo importante in molti stati di malattia 2. Nonostante decenni di intenso lavoro svolto su questa famiglia di recettori, rimangono significative questioni in sospeso in materia, in particolare per quanto riguarda i meccanismi molecolari che guidano le interazioni GPCR-effettrici. Ad oggi, solo una struttura cristal....
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Protocollo
1. Preparazione del DNA
- Sensore di design costruisce utilizzando uno schema di clonazione modulare. Si prega di fare riferimento al design del sensore β 2 -AR descritto in precedenza 1.
- Preparare DNA secondo il protocollo kit miniprep commerciale ed eluire in 2 soluzione mM Tris-HCl, pH 8, a concentrazione ≥ 750 ng / ml, A 260 / A 280 di 1,7-1,9, A 260 / A 230 di 2,0-2,29.
2. colture cellulari Preparazione
- cellule Culture HEK-293T-Flp-n in DMEM contenente 4,5 g / L D-glucosio, supplementato con 10% FBS (inattivato con il calore) (v / v)....
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Risultati
Uno schema generalizzato dell'esperimento allestimento e l'esecuzione è illustrato dalla Figura 3.
Per rilevare un cambiamento FRET nella gamma dinamica stretta del sensore, è fondamentale per rispettare le sfumature di sistema da rispettare. Qualità cellulare è indispensabile per l'espressione della proteina e coerenza campionamento. Figura 1 Caratteristiche immagini di cellule coltivate crescono in un monostrato coerente (10X) che è ottimale pe.......
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Discussione
La gamma dinamica stretta di misurazioni FRET in questo sistema accentua la necessità di controllo di qualità sensibile in ogni fase di questo protocollo. I passi più importanti per assicurare un esperimento riuscito FRET sono 1) la coltura delle cellule, 2) trasfezione 3) l'espressione della proteina e 4) puntuale, preciso coordinamento durante l'esecuzione del test.
la salute delle cellule e la qualità di manutenzione / placcatura possono avere un impatto significativo sul rumore r.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione.
Ringraziamenti
RUM è stato finanziato dalla Compagnia americano Heart Association Pre-dottorato (14PRE18560010). La ricerca è stata finanziata dalla American Heart Association Scientist Development Grant (13SDG14270009) e NIH (1DP2 CA186752-01 & 1-R01-GM-105.646-01-A1) alla SS
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sensore di peptidi B2-AR-10 nm-Gas | Addgene | 47438 | Kit |
| di miniprep plasmidico | GeneJET Fermentas/Fisher Sci | FERK0503 | Eluire in 2 mM tampone di eluizione Tris |
| Cellule HEK-293T-Flp-n | Life Technologies | R78007 | |
| Tripsina (0,25%) | Life Technologies | 25200056 | |
| DMEM- alto glucosio | Life Technologies | 11960-044 | Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| FBS, certificato, inattivato a caldo, di origine statunitense | Life Technologies | 10082147 | |
| Glutamax I 100x | Life Technologies | 35050061 | |
| HEPES | Corning MT25060CL | ||
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Terreni sierici ridotti; Portare a RT prima dell'uso |
| XtremeGene HP trasfezione reagenet | Roche | 6366236001 | Altamente raccomandato per la sua consistenza. Portare a RT prima dell'uso |
| FluoroMax 4 | Horiba | software FluorEssence V3.8 | |
| cuvetta al quarzo con percorso di 3 mm | Starna | NC9729944(16.45F-Q-3/z8.5) | Potrebbe richiedere un supporto/adattatore per cuvette per l'uso in Fluorimetro, disponibile da Starna |
| Sc100-S3 Pompa a bagnomaria a circolazione riscaldata | Fisher Scientific | 13-874-826 | Caldo a 37 ° C prima dell'uso |
| Thermomixer Heat Block | Eppendorf | 22670000 | Caldo a 37 gradi C prima dell'uso |
| Acqua ultrapura priva di DNA/RNAsi | Life Technologies 10977015 | Utilizzare a RT | |
| D(+)-glucosio, anidro | Sigma | G5767 | |
| aprotinina dal polmone bovino | Sigma | A1153 | |
| leupeptina emisolfato | EMD | 10-897 | |
| acido L-ascorbico, grado reagente | Sigma | A0278 | |
| (-)- isoproterenolo (+)-bitartrato | Sigma | I2760 | Utilizzare aliquote fresche ad ogni esperimento |
Riferimenti
- Malik, R. U., et al. Detection of G Protein-selective G Protein-coupled Receptor (GPCR) Conformations in Live Cells. J. Biol. Chem. 288, 17167-17178 (2013).
- Oldham, W. M., Hamm, H. E. Heterotrimeric G protein activation by G-protein....
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Ristampe e permessi
