Articolo metodologico

La tecnica del rene perfusi mouse isolato

DOI:

10.3791/54712

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17 novembre 2016

 ,  , 
1Institute of Anatomy, Swiss National Centre of Competence in Research Kidney, University of Zürich, 2Department of Physiology, University of Regensburg

In questo articolo

Sommario

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L'isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. I buffer e tecnica chirurgica sono descritte in dettaglio.

Abstract

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L'isolato rene perfuso mouse (MIPK) è una tecnica per mantenere un rene mouse sotto ex vivo condizioni perfusi e funzionali per 1 ora. Questo è un prerequisito per lo studio della fisiologia dell'organo isolata e per molte applicazioni innovative che possono essere possibile in futuro, tra perfusione decellularization per la bioingegneria reni o la somministrazione di anti-rigetto o droghe genoma-editing in dosi elevate per innescare il rene per il trapianto. Durante il tempo della perfusione, il rene può essere manipolato, funzione renale può essere valutata, e vari farmaci somministrati. Dopo la procedura, il rene può essere trapiantato o trasformati per la biologia molecolare, l'analisi biochimica, o al microscopio.

Questo articolo descrive il perfusato e la tecnica chirurgica necessaria per la perfusione ex vivo di reni mouse. Dettagli dell'apparato perfusione sono date e dati sono presentati mostra la vESPONSABILITÀ di preparazione del rene: il flusso ematico renale, la resistenza vascolare, e delle urine dati come, microscopio elettronico di trasmissione funzionali dei diversi segmenti del nefrone come letture morfologiche, e le macchie occidentali di proteine ​​di trasporto dei diversi segmenti del nefrone come lettura molecolare.

Introduzione

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La perfusione isolata di organi è stato oggetto di uno sforzo continuo tra fisiologi per molti decenni 1. La tecnica consente la funzione dell'organo, senza influenze sistemiche come la pressione sanguigna, ormoni, o nervi, da studiare. Carl Eduard Loebell è considerato il primo ad aver descritto la perfusione successo di un rene isolato, nel 1849 2. Da allora, l'apparato perfusione ha subito notevole raffinatezza. Frey e Gruber ha introdotto un polmone artificiale per le pompe di ossigenazione e pulsatile per continua perfusione 2. Mentre i primi ricercatori hanno studiato principalmente i reni di grandi mammiferi, cioè, maiali e can....

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Protocollo

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Tutte le procedure che coinvolgono gli animali descritti in questo manoscritto sono stati condotti secondo il diritto svizzero e approvati dall'amministrazione veterinario del Cantone di Zurigo, Svizzera.

1. Preparazione Buffer

  1. Preparare soluzioni 1 - 4 e la soluzione ormone antidiuretico (ADH) (Tabella 1).
  2. Preparare il tampone di dialisi (Tabella 1).
    NOTA: Questo è il buffer utilizzato come tampone di dialisi durante la perfusione. Successivamente, gli eritrociti vengono diluiti in questo tampone per formare il perfusato finale.
  3. preparazione degli eritrociti.
    1. ....

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Risultati

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Con il metodo descritto, isolati reni mouse possono rimanere vitali per almeno 1 ora. Abbiamo testato la vitalità del tessuto dopo 1 ora di perfusione continua con funzionale (flusso ematico renale e la resistenza vascolare, analisi dei gas del sangue del deflusso venoso, velocità di filtrazione glomerulare, urinario frazionata Na + e K + escrezione, e nelle urine osmolalità) e morfologica (elettronico a trasmissione microscopia, TEM) metodi in quattro reni di tipo .......

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Discussione

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Il mouse isolato rene perfuso è uno strumento per lo studio della funzione renale in un ambiente controllato ex-vivo per 1 ora, colmando il divario tra esperimenti in vivo su animali intatti, che può essere viziata da l'impatto di numerosi fattori sistemici, e in esperimenti in vitro in nefrone isolati o cellule in coltura, che necessariamente trascurare l'impatto della struttura dell'organo intatta sulla funzione. C'è, alla conoscenza degli autori, non tecnica alterna.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti e nient'altro da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare Hans-Joachim Schurek per l'inestimabile consiglio scientifico. Gli autori ringraziano Monique Carrel e Michèle Heidemeyer per l'eccellente assistenza tecnica, David Penton Ribas e Nourdine Faresse per la lettura critica del manoscritto e Carsten Wagner e Jürg Biber per l'anticorpo NaPi-2a. Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro nazionale svizzero di competenza per la ricerca "Kidney.CH" e da una sovvenzione per il progetto (310030_143929/1) del Fondo nazionale svizzero per la ricerca scientifica.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Circuito di perfusione:
Camera umida 834/8Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2901
Cannulare con cestello e porta lateraleHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2947
Termostato TC120-ST5 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-4544
ISM 827/230V Pompa a rulli Reglo AnalogueHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-0114
Serbatoio rivestito per soluzione tampone 1 LHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3438
Serbatoio rivestito per soluzione tampone 0,5 LHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3436
Trasduttore di pressione APT300 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3862
TAM-D Plugsys TransducerHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-1793
SCP Plugsys servo controllerHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-2806
Windkessel Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3717
Acquisizione dati HSE-USBHarvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH73-3330
Dializzatore a basso flusso Diacap PolysulfoneB.Braun7203525
Tubo in PE per incannulamento dell'aorta 1,19 mm D.I. x 1,70 mm O.D.Materie prime scientifiche Inc.BB31695-PE/8
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Reagenti tampone:
Aminoplasmatico 10%B.Braun134518064
Piruvato di sodioSigma-AldrichP2256-25G
Acido L-glutammico sale monosodico idratoSigma-AldrichG1626-100G
L-(-)-Acido malico sale sodicoSigma-AldrichM1125-25G
Sodio-L-LattatoSigma-AldrichL7022-10G
acido alfa-chetoglutarico sale sodicoSigma-AldrichK1875-25G
NaClSigma-Aldrich31434-1KG-R
NaHCO3Sigma-AldrichS5761-5KG
KClSigma-Aldrich60130-1KG
UreaSigma-AldrichU5378-500G
CreatininaSigma-AldrichC4255-10G
AmpicillinaRoche10835242001
MgCl2 * 6H2OSigma-AldrichM2393-500G
D-glucosioSigma-AldrichG8270-1KG
CaCl2 * 6H2O Riedel-de-Haë n12074
NaH2PO4Sigma-AldrichS9638-500G
Na2HPO4Sigma-AldrichS0876-500G
Ormone antidiuretico dDAVPSigma-AldrichV2013-1MG
FITC-InulinaSigma-Aldrich
Filtro utilizzato per la filtrazione degli eritrocitiMacherey-NagelMN 615
BGA Analisi:
ABL 80 flexRadiometro medico ApS
Microscopio elettronico:
Philips CM100 TEMFEI
...

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
  2. Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
  3. Nizet, A.

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Perfusione del rene di topoPerfusione ex vivoFlusso sanguigno renaleResistenza vascolareAnalisi dell urinaMicroscopia elettronica a trasmissioneAnalisi Western BlotVelocit di filtrazione glomerulareEscrezione frazionata

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