Articolo metodologico

Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l'analisi TEM

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DOI:

10.3791/54724

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12 ottobre 2016

 , 
1Division of Experimental Hematology and Cancer Biology, Cincinnati Children’s Research Foundation

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo per preparare campioni con un basso numero di cellule per l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM).

Abstract

microscopia elettronica a trasmissione (TEM) fornisce i dettagli della organizzazione cellulare e ultrastruttura. Tuttavia, l'analisi TEM di popolazioni di cellule rare, in particolare le cellule in sospensione come le cellule staminali ematopoietiche (CSE), rimane limitata a causa della necessità di un elevato numero di cellule durante la loro preparazione. Ci sono alcuni approcci cytospin o monostrato per analisi TEM da campioni scarse, ma questi approcci non riescono a ottenere dati quantitativi significativi dal numero limitato di cellule. Qui, un approccio alternativo e innovativo per la preparazione del campione negli studi TEM è descritto per le popolazioni di cellule rare che consente l'analisi quantitativa.

Un numero relativamente basso di cellule, cioè, 10.000 CSE, è stato utilizzato con successo per l'analisi TEM rispetto ai milioni di cellule tipicamente utilizzati per gli studi TEM. In particolare, Evans blu colorazione è stata eseguita dopo paraformaldeide-glutaraldeide (PFA-GA) la fissazione di visualizzare la minuscola cella pellasciare, che ha facilitato l'incorporamento in agarosio. Grappoli di numerose cellule sono stati osservati nelle sezioni ultrasottili. Le cellule hanno una morfologia ben conservato, ei dettagli ultra-strutturali dei mitocondri Golgi complesse e diverse erano visibili. Questo protocollo efficiente, semplice e riproducibile permette la preparazione del campione da un numero di cellule basso e può essere utilizzato per l'analisi qualitativa e quantitativa TEM su popolazioni di cellule rare da campioni biologici limitate.

Introduzione

Dettagli Ultra-strutturali e sub-organelli delle cellule sono stati rivelati principalmente mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) studi da tessuti o pellet cellulari 1,2. pezzi solidi di tessuti possono essere facilmente utilizzati per studi di microscopia elettronica. Tuttavia, TEM analizza 1,3 su cellule in sospensione rimangono una sfida e rendono necessario il numero di cellule alte, vale a dire, milioni di cellule. A causa di questo, analisi ultra-strutturali delle popolazioni cellulari rare in sospensione, ad esempio, cellule staminali ematopoietiche (CSE), non sono facilmente valutati. Molteplici tentativi di analisi TEM da campioni scarse utilizzando cytospin o monostrato approcci non riescono a ottenere dati quantitativi significativi dal limitato numero di celle. Pertanto, il requisito di un elevato numero di cellule limita l'uso di questo potente strumento per comprendere i dettagli ultrastrutturali subcellulari di popolazioni di cellule rare.

Una limitazione fondamentale per studi TEM con un numero limitato di cellules in sospensione è la localizzazione delle cellule per la lavorazione e quindi, studi TEM da cellule limitati con particolare piccole dimensioni rimangono impegnativo. Diversi approcci alternativi sono stati adottati per contrastare questa limitazione: la BSA / bisacrylamide (BSA-BA) polimerizzazione mediata di sospensione cellulare, la colorazione delle cellule con un colorante per renderli visibili su un supporto sottile pellicola tra cui lamelle, e TEM analizza dalle preparazioni cytospin 4-6. Tuttavia, il successo molto limitato è stato raggiunto, come molto poche cellule sono stati trovati in sezioni dopo ultra-sezionamento. La sfida principale di identificare cellule sparse persiste perché il monostrato cellulare rimane per lo più invisibile nel gel solidificato per il sezionamento. Inoltre, la preparazione cytospin delle cellule può alterare la loro organizzazione cellulare dovuta alla diffusione delle cellule e la fragilità della struttura cellulare. Quindi, questi inconvenienti intrinseci giustificano un nuovo approccio per eseguire studi TEM da popolazioni di cellule rare con piùconsistenza. Per superare questo problema, abbiamo descritto un nuovo metodo di preparazione del campione e alternativa a studi TEM da popolazioni di cellule rare 7.

Qui riportiamo un efficiente protocollo di preparazione del campione per eseguire TEM da campioni biologici scarse con risultati qualitativi e quantitativi consistenti. Evans blu colorazione è stata eseguita dopo la fissazione di localizzare un piccolo pellet di cellule dalle cellule basso numero, cioè, staminali emopoietiche del midollo osseo 10.000 e le cellule progenitrici che altrimenti sarebbero rimaste invisibili, e il pellet è stato incorporato in agarosio prima processi di disidratazione e resina embedding. Questo metodo raggruppa insieme le cellule e permette l'analisi efficiente della ultrastruttura e l'organizzazione subcellulare di cellule staminali ematopoietiche (identificato come Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 -, HSC), un 0.2 rara - popolazione di cellule 0,5% nel midollo osseo. Questo pro sperimentaleprotocollo può essere utile per effettuare studi ultra-strutturali e di ottenere risultati quantitativi in ​​molte popolazioni rari ma molto importanti.

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Protocollo

Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato animale istituzionale a Research Foundation dei bambini di Cincinnati. Per questo studio, le cellule staminali ematopoietiche sono state isolate dal midollo osseo di topi C57BL / 6 inbred invecchiato 2 - 4 mesi. Separazione delle cellule usando FACS dopo colorazione di BM con diversi produttori di superficie tra Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 e CD34 è stato utilizzato per la depurazione delle HSC in base a Lin- Sca-1 + Flt3 c-Kit + - strategia di gating - CD34 come protocollo standard descritto prima delle 8.

ATTENZIONE: Diverse sostanze chimiche altamente tossiche vengono utilizzati durante questa procedura. Questi sono tossico per inalazione e contatto con la pelle. Si prega di indossare guanti ed indumenti protettivi. Lavori in cappa mentre si lavora con queste sostanze chimiche.

1. cellule, la fissazione, colorazione e pre-embedding

  1. Ordina 10.000 cellule staminali ematopoietiche (utilizzando Lin - Sca-1 + c-Kit + Flt3 - CD34 - gating strategia; LT-HSC popolazione) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga contenente 600 microlitri di Iscove Modified Dulbecco Medium (IMDM) con il 10% di siero fetale bovino usando FACS.
  2. Spin down CSE smistate a 1000 xg per 10 min in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga utilizzando una centrifuga con benne oscillanti. Rimuovere medio aspirando delicatamente e lasciare 200 microlitri di media nei tubi ad ogni passo. In questa fase, il pellet cellulare rimane invisibile nel tubo.
  3. Fissare le cellule aggiungendo 0,2 ml di soluzione di fissativo 2x a temperatura ambiente (RT) per 1 ora 1,9.
    1. Rendere la soluzione fissativa fresca prima dell'uso. Al 1x, la soluzione è composta da 3% paraformaldeide e 2,5% glutaraldeide in 0,1 M tampone cacodilato.
  4. Centrifugare le cellule a 1.000 xg per 10 min a 30 ° C utilizzando una centrifuga con secchi swing-out.
  5. Lavare le cellule con 600 ml di buffer di 0,1 M cacodilatomediante centrifugazione e lasciare tampone 200 microlitri nel tubo dopo centrifugazione.
  6. Macchiare le cellule fissate aggiungendo 200 ml di 2 mg / ml soluzione di Evans blu in tampone cacodilato e incubare per 20 minuti a RT. Le cellule saranno di colore blu.
  7. Lavare le cellule 3 volte con 600 ml di 0,1 M tampone cacodilato mediante centrifugazione e lasciare tampone 200 microlitri nel tubo ogni volta.
  8. Risospendere le cellule in 200 microlitri di buffer e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 0,5 ml. Centrifugare a 1000 xg per 10 minuti usando una centrifuga da tavolo. Rimuovere tampone delicatamente senza disturbare l'ora visibile minuscola pellet cellulare, e lasciare tampone 50 microlitri nel tubo.
  9. Aggiungere 200 mg bassa fusione agarosio a 5 ml di 0,1 M tampone cacodilato nel tubo 15 ml di una soluzione di agarosio al 4%. Sciogliere l'agarosio trasferendo il tubo di acqua bollente in una bottiglia di vetro da 100 ml e mantenere tiepida fino all'uso.
  10. Aggiungere 200 ml di 4% basso punto di fusione agarosio sciolti in 0,1 M cacodylaTE buffer per la sospensione di cellule in provetta da 0,5 ml e subito centrifugare a 1000 xg per 10 min a 30 ° C utilizzando una tabella centrifuga superiore.
  11. Dopo la conferma che le cellule in pellet al fondo del tubo 0,5 ml in agarosio semi-solido dopo la centrifugazione, trasferire immediatamente il tubo a 4 ° C o ghiaccio per 20 minuti per solidificare l'agarosio. Questo passaggio è molto critica, come un piccolo pellet di cellule visibile in questa fase si ottiene una buona ammasso di cellule al microscopio elettronico.
  12. Trasferire accuratamente l'agarosio solidificato contenente il pellet dal tubo di plastica Petri 35 millimetri contenente tampone con un 27 ago G 3,10.
  13. Tagliare le agarosio solidificati contenenti il ​​pellet cellulare in un unico pezzo di circa 1 - 2 mm con un bisturi. Trasferire il pezzo agarosio contenente il pellet di cellule in una nuova provetta da 1,5 ml.
  14. Lavare 2 - 3 volte con 600 ml di tampone 0,1 M cacodilato aggiungendo e rimuovendo buffer utilizzando pipetta senza centrifugazione. Utilizzare questo pezzo agarosio contenente il pellet di cellule per il passaggio successivo. In questa fase, il campione può essere conservato a 4 ° C per una notte prima di passare alla fase successiva.

2. Osmification, disidratazione, Embedding

  1. Rimuovere il tampone cacodilato dal tubo 1,5 ml con il pellet cellulare contenente agarosio usando una pipetta. Aggiungere 1,0 ml di 1% tetrossido di osmio (OSO 4), soluzione in una cappa aspirante, e incubare per 1 ora a 4 ° C.
  2. Lavare tre volte con 600 ml di 0,1 M tampone cacodilato e trasferire il campione di 20 ml di vetro scintillazione fiala con un tappo.
  3. Elaborare il campione per la disidratazione, l'infiltrazione e l'inclusione in resina (per esempio, LX-112) con modifiche di serie dei seguenti soluzioni in un piatto 6 bene. Spostare il pezzo agarosio cellula-pellet con pinze.
    1. Immergere il campione in 25% di etanolo a temperatura ambiente per 15 min.
    2. Immergere il campione in 50% di etanolo a temperatura ambiente per 15 min.
    3. Immergere il campione nel 75%etanolo a temperatura ambiente per 15 min.
    4. Immergere il campione in 95% di etanolo a temperatura ambiente per 15 min.
    5. Immergere il campione in 100% di etanolo a temperatura ambiente per 15 minuti, due volte.
    6. Immergere il campione in etanolo: resina (3: 1) a temperatura ambiente per 30 min.
    7. Immergere il campione in etanolo: resina (1: 1) a temperatura ambiente per 30 min.
    8. Immergere il campione in etanolo: resina (1: 3) a temperatura ambiente per 30 min.
    9. Immergere il campione in resina pura a temperatura ambiente per 60 minuti, due volte.
  4. Trasferire il campione al fondo della punta piramidale stampo di gomma a forma di indicatori accuratamente pinza e aggiungere resina più pura sulla parte superiore del campione per riempire lo stampo. Incubare il campione a 60 ° C per 72 ore per la polimerizzazione della resina.
  5. Rimuovere la piramide di resina polimerizzata dagli stampi torcendo lo stampo in gomma. Un piccolo gruppo di cellule nero dovrebbe essere visibile nella piramide di resina polimerizzata, come descritto in precedenza 7. Fissare la piramide di resina polimerizzata sul cilindro di montaggio con cianoacrilato.

3. Sezioni e microscopia elettronica a trasmissione

  1. Tagliare il blocco piramide con una lama di rasoio e un coltello di diamante dopo il montaggio del blocco un ultra-microtomo. Effettuare un breve forma trapezoidale larga con la parte superiore e la parte inferiore del blocco paralleli tra loro e con i lati uniformemente angolati. Questa forma della piramide aiuta per sezionamento seriale.
  2. Inoltre, tagliare il blocco di tutto il pellet cellulare con il coltello diamante e rimuovere le sezioni di plastica attorno al pezzo agarosio pellet cellulare.
  3. Tagliare 1 sezioni micron utilizzando un ultra-microtomo. Spostare il 1 sezioni micron dalla barca acqua per un vetrino utilizzando uno strumento ciglia e uno strumento ciclo metallo come precedentemente riportato 7. sezioni di trasferimento su scivoli e scivoli di trasferimento al piatto caldo (37 ° C) per l'asciugatura.
  4. Aggiungere una goccia di soluzione di blu di toluidina per le sezioni usando una siringa dotata di 0,22 micron filtro e incubare per 3 min. Sciacquare i vetrini con acqua distillata e let sezioni asciugare. Verificare con un microscopio ottico per identificare la posizione delle celle.
  5. Tagliare sezioni ultrasottili (70-100 nm) utilizzando un coltello di diamante. Spostare 2 - 3 sezioni su griglie di 200 maglia dalla barca acqua ad una piastra di Petri di vetro utilizzando uno strumento di ciglia.
  6. Trasferire il piatto di vetro Petri contenenti griglie con sezioni ad una piastra calda a 30 ° C per asciugare sezioni per 30 min.
  7. Macchiare le griglie con gocce di 1% acetato di uranile a temperatura ambiente per 10 minuti e poi sciacquare in acqua distillata 6 - 8 volte. Colorazione con Reynolds citrato di piombo, a temperatura ambiente per 5 minuti e sciacquare in acqua distillata 6 - 8 volte. Trasferire il piatto di vetro Petri contenente le griglie ad una piastra calda a 37 ° C per asciugare sezioni.
  8. Analizzare sezioni con un microscopio elettronico, a 80 kV 7.

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Risultati

Un protocollo efficace e coerente per la preparazione dei campioni per effettuare analisi TEM dal basso numero di cellule è descritto. Post-fissazione colorazione con blu di Evans e il trasferimento di cellule in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga ha aiutato a visualizzare la minuscola pellet cellulare 7. Osmification con tetrossido di osmio in agarosio ha portato ad un rilevamento facile del pellet cellulare buio durante la disidratazione e incorporamento.

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Discussione

Questo metodo consente l'analisi TEM sul numero di cellule bassi, utilizzando Evans colorazione blu e agarosio l'incorporamento di localizzare un piccolo pellet di cellule durante la disidratazione, embedding resina e sezionamento processi. Importante, mantiene raggruppamenti cellulari insieme e conserva la ultra-struttura cellulare, che è opportuno esaminare più celle per la quantificazione dei dati.

In studi TEM, un pellet di cellule contenente milioni di cellule è spesso necessari...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo il Nucleo di Ricerca Patologica per l'assistenza con gli studi di analisi al microscopio elettronico presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Il lavoro è stato sostenuto dal NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 a MDF).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Paraformaldeide 20% Microscopia elettronica acquosa SolnScienze15713CAUTION Tossico per inalazione, contatto con la pelle. Indossare guanti, utilizzare la cappa aspirante.
Gluteraldeide 70% Microscopia elettronica acquosa SolnScienze16350<strong>CAUTION Tossico per inalazione, contatto con la pelle. Indossare guanti, utilizzare la cappa aspirante.
Tampone cacodiladatoMicroscopia elettronica Sciences12300Preparare un tampone cacodeladato 0,1 M (pH 7,4) in acqua distillata, conservare a 4 °C. ATTENZIONE Irritante per inalazione o contatto con la pelle, indossare guanti e lavorare in cappa aspirante.
Evans Blue SigmaE-2129
Agarosio a basso punto di fusione Sigma AldrichA-5030
Microscopia elettronicatetraossido di osmioScienze 191301 g in 50 ml di tampone cacodeladato 0,1 M per fare il 2% di OsO4 stock, ATTENZIONE Molto tossico per inalazione o contatto con la pelle, forte ossidante, indossare indumenti protettivi, protezione per gli occhi, utilizzare cappa aspirante.
Kit di inclusione LX-112 (LADD®)
DDSA (anidride dodecenilsuccinica)LADD21340Mescolare 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 insieme e poi aggiungere 1,4% DMP-30
NMA (anidride metilica nadica)LADD21350
Resine epossidiche Epon 812 (LX-112)LADD21310ATTENZIONE Tossico per inalazione, contatto con la pelle. Indossare guanti, indumenti protettivi, utilizzare una cappa aspirante.
DMP-30 (2,4,6-Tri(dimetilamminometil)fenolo)LADD21370
Citrato di piombo Reynolds (EM Stain II)LeicaATTENZIONE Tossico per inalazione, evitare il contatto con la pelle o gli occhi.
Acetato di uranile (EM Stain I)Leica8072820ATTENZIONE Tossico per inalazione, evitare il contatto con la pelle o gli occhi.
Mezzo di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM)ATCC30-2005composizione: NaCl, NaHCO3, HEPES, glucosio, Ca, Mg, zolla piruvato ecc. Per dettagli https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx
stampo a punta piramidaleTed Pella10585
cilindri di montaggioTed Pella10580
Ultra-microtomo (Leica EM UC7)
200 griglie mesh (nikil)Microscopia elettronica SciencesG-200 Ni
Microscopio elettronicoHitachi modello H-7650 
Software del motore di acquisizione delle immaginiAMT-600 
Piastre di Petri in plastica da 35 mmFisher scientific
Quick Bond Super colla CianoacrilatoMicroscopia elettronica Scienze72588
Lamette da
Fiale di scintillazione in vetro Fisher scientifico 03-337-14
Vetrini
Strumento
Strumento per anello in metallo 
barbaper ciglia

Riferimenti

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