Qui, presentiamo un protocollo per preparare campioni con un basso numero di cellule per l'analisi al microscopio elettronico a trasmissione (TEM).
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Articolo metodologico
Un approccio alternativo per la preparazione del campione con un basso numero di cellule per l'analisi TEM
In questo articolo
Sommario
Abstract
microscopia elettronica a trasmissione (TEM) fornisce i dettagli della organizzazione cellulare e ultrastruttura. Tuttavia, l'analisi TEM di popolazioni di cellule rare, in particolare le cellule in sospensione come le cellule staminali ematopoietiche (CSE), rimane limitata a causa della necessità di un elevato numero di cellule durante la loro preparazione. Ci sono alcuni approcci cytospin o monostrato per analisi TEM da campioni scarse, ma questi approcci non riescono a ottenere dati quantitativi significativi dal numero limitato di cellule. Qui, un approccio alternativo e innovativo per la preparazione del campione negli studi TEM è descritto per le popolazioni di cellule rare che consente l'analisi quantitativa.
Un numero relativamente basso di cellule, cioè, 10.000 CSE, è stato utilizzato con successo per l'analisi TEM rispetto ai milioni di cellule tipicamente utilizzati per gli studi TEM. In particolare, Evans blu colorazione è stata eseguita dopo paraformaldeide-glutaraldeide (PFA-GA) la fissazione di visualizzare la minuscola cella pellasciare, che ha facilitato l'incorporamento in agarosio. Grappoli di numerose cellule sono stati osservati nelle sezioni ultrasottili. Le cellule hanno una morfologia ben conservato, ei dettagli ultra-strutturali dei mitocondri Golgi complesse e diverse erano visibili. Questo protocollo efficiente, semplice e riproducibile permette la preparazione del campione da un numero di cellule basso e può essere utilizzato per l'analisi qualitativa e quantitativa TEM su popolazioni di cellule rare da campioni biologici limitate.
Introduzione
Dettagli Ultra-strutturali e sub-organelli delle cellule sono stati rivelati principalmente mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM) studi da tessuti o pellet cellulari 1,2. pezzi solidi di tessuti possono essere facilmente utilizzati per studi di microscopia elettronica. Tuttavia, TEM analizza 1,3 su cellule in sospensione rimangono una sfida e rendono necessario il numero di cellule alte, vale a dire, milioni di cellule. A causa di questo, analisi ultra-strutturali delle popolazioni cellulari rare in sospensione, ad esempio, cellule staminali ematopoietiche (CSE), non sono facilmente valutati. Molteplici....
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Protocollo
Tutte le procedure sperimentali sono state approvate dal comitato animale istituzionale a Research Foundation dei bambini di Cincinnati. Per questo studio, le cellule staminali ematopoietiche sono state isolate dal midollo osseo di topi C57BL / 6 inbred invecchiato 2 - 4 mesi. Separazione delle cellule usando FACS dopo colorazione di BM con diversi produttori di superficie tra Lineage, c-Kit, Sca-1, Flt3 e CD34 è stato utilizzato per la depurazione delle HSC in base a Lin- Sca-1 + Flt3 c-Kit + - strategia di gating - CD34 come protocollo standard descritto prima delle 8.
ATTEN....
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Risultati
Un protocollo efficace e coerente per la preparazione dei campioni per effettuare analisi TEM dal basso numero di cellule è descritto. Post-fissazione colorazione con blu di Evans e il trasferimento di cellule in una provetta da 0,5 ml microcentrifuga ha aiutato a visualizzare la minuscola pellet cellulare 7. Osmification con tetrossido di osmio in agarosio ha portato ad un rilevamento facile del pellet cellulare buio durante la disidratazione e incorporamento.
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Discussione
Questo metodo consente l'analisi TEM sul numero di cellule bassi, utilizzando Evans colorazione blu e agarosio l'incorporamento di localizzare un piccolo pellet di cellule durante la disidratazione, embedding resina e sezionamento processi. Importante, mantiene raggruppamenti cellulari insieme e conserva la ultra-struttura cellulare, che è opportuno esaminare più celle per la quantificazione dei dati.
In studi TEM, un pellet di cellule contenente milioni di cellule è spesso necessari.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Nucleo di Ricerca Patologica per l'assistenza con gli studi di analisi al microscopio elettronico presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Il lavoro è stato sostenuto dal NIH (American Society of Hematology Bridge award to-MDF; R01 DK102890 a MDF).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Paraformaldeide 20% Microscopia elettronica acquosa Soln | Scienze | 15713 | CAUTION Tossico per inalazione, contatto con la pelle. Indossare guanti, utilizzare la cappa aspirante. |
| Gluteraldeide 70% Microscopia elettronica acquosa Soln | Scienze | 16350< | strong>CAUTION Tossico per inalazione, contatto con la pelle. Indossare guanti, utilizzare la cappa aspirante. |
| Tampone cacodiladato | Microscopia elettronica Sciences | 12300 | Preparare un tampone cacodeladato 0,1 M (pH 7,4) in acqua distillata, conservare a 4 °C. ATTENZIONE Irritante per inalazione o contatto con la pelle, indossare guanti e lavorare in cappa aspirante. |
| Evans Blue | Sigma | E-2129 | |
| Agarosio a basso punto di fusione | Sigma Aldrich | A-5030 | |
| Microscopia elettronica | tetraossido di osmio | Scienze 19130 | 1 g in 50 ml di tampone cacodeladato 0,1 M per fare il 2% di OsO4 stock, ATTENZIONE Molto tossico per inalazione o contatto con la pelle, forte ossidante, indossare indumenti protettivi, protezione per gli occhi, utilizzare cappa aspirante. |
| Kit di inclusione LX-112 (LADD®) | |||
| DDSA (anidride dodecenilsuccinica) | LADD | 21340 | Mescolare 16% DDSA; 30% NMA; 54% LX-112 insieme e poi aggiungere 1,4% DMP-30 |
| NMA (anidride metilica nadica) | LADD | 21350 | |
| Resine epossidiche Epon 812 (LX-112) | LADD | 21310 | ATTENZIONE Tossico per inalazione, contatto con la pelle. Indossare guanti, indumenti protettivi, utilizzare una cappa aspirante. |
| DMP-30 (2,4,6-Tri(dimetilamminometil)fenolo) | LADD | 21370 | |
| Citrato di piombo Reynolds (EM Stain II) | Leica | ATTENZIONE Tossico per inalazione, evitare il contatto con la pelle o gli occhi. | |
| Acetato di uranile (EM Stain I) | Leica | 8072820 | ATTENZIONE Tossico per inalazione, evitare il contatto con la pelle o gli occhi. |
| Mezzo di Dulbecco modificato di Iscove (IMDM) | ATCC | 30-2005 | composizione: NaCl, NaHCO3, HEPES, glucosio, Ca, Mg, zolla piruvato ecc. Per dettagli https://www.atcc.org/~/media/Attachments/E/9/7/E/4893.ashx |
| stampo a punta piramidale | Ted Pella | 10585 | |
| cilindri di montaggio | Ted Pella | 10580 | |
| Ultra-microtomo | (Leica EM UC7) | ||
| 200 griglie mesh (nikil) | Microscopia elettronica Sciences | G-200 Ni | |
| Microscopio elettronico | Hitachi modello H-7650 | ||
| Software del motore di acquisizione delle immagini | AMT-600 | ||
| Piastre di Petri in plastica da 35 mm | Fisher scientific | ||
| Quick Bond Super colla Cianoacrilato | Microscopia elettronica Scienze | 72588 | |
| Lamette da | |||
| Fiale di scintillazione in vetro | Fisher scientifico | 03-337-14 | |
| Vetrini | |||
| Strumento | |||
| Strumento per anello in metallo |
Riferimenti
- Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol Biol. 369, 1-18 (2007).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr Opin Neurobiol. 14, 591-5....
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Ristampe e permessi
