Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

Sommario

Identificare nuovi bersagli farmacologici che passano dai test preclinici agli studi sull'uomo è una priorità scientifica. A tal fine, qui descriviamo un approccio di genomica funzionale per esaminare l'impatto della deplezione genica sugli sferoidi delle linee cellulari tumorali, che modellano in modo più appropriato i tumori umani in vivo.

Abstract

L'identificazione di eventi conducente funzionali nel cancro è fondamentale per promuovere la nostra comprensione della biologia del cancro e indispensabile per la scoperta della prossima generazione di nuovi bersagli farmacologici. Sta diventando evidente che i modelli più complessi di cancro sono necessari per apprezzare appieno i fattori che guidano tumorigenesi in vivo e aumentare l'efficacia di nuove terapie che rendono la transizione da modelli pre-clinici di sperimentazioni cliniche.

Qui vi presentiamo un metodo per la generazione di sferoidi tumorali uniformi e riproducibili che possono essere sottoposti a controlli siRNA funzionale. Questi sferoidi mostrano molte caratteristiche che si trovano nei tumori solidi che non sono presenti nella cultura tradizionale a due dimensioni. Abbiamo dimostrato che diverse linee di cellule di cancro al seno comunemente usati sono suscettibili di questo protocollo. Inoltre, mettiamo a disposizione una prova di principio i dati utilizzando la linea di cellule di cancro al seno BT474, confermando la lorodipendenza amplificazione del fattore di crescita epidermico recettore HER2 e mutazione del fosfatidilinositolo-4,5-bisfosfato 3-chinasi (PIK3CA) quando coltivata come sferoidi tumorali. Infine, siamo in grado di approfondire e confermare l'impatto spaziale di queste dipendenze utilizzando immunoistochimica.

Introduzione

Tumori solidi mostrano significativi istologici, l'eterogeneità intra-tumorale genetica e micro-ambientale, che presenta i medici con una sfida significativa nel riuscire a curare i pazienti con successo. La maggior parte dei modelli utilizzati per identificare romanzo terapie mirate non incorporano molte di queste caratteristiche. Infatti, gli attuali terapie mirate utilizzati in clinica sono stati sviluppati negli ultimi dieci anni impiegando approcci di screening che si basano su linee cellulari tumorali coltivate in condizioni (2D) cultura bidimensionali. Anche se questo ha portato a vari successi, come gli inibitori del recettore tirosin-chinasi, sta diventando evidente che i modelli più complessi di cancro sono necessari per apprezzare appieno i fattori che guidano tumorigenesi in vivo e aumentare il numero di nuove terapie che rendono il passaggio dalla modelli pre-clinici alla sperimentazione clinica. Inoltre, è ormai ben apprezzato il fatto che sistemi di coltura 2D non riflettono inVIVO comportamento ^1,2. Ad esempio, nei tumori vascolarizzati scarsamente, come la domanda di ossigeno e nutrienti nel microambiente superare l'offerta, regioni di consegne alte e basse sviluppano. La presenza di bassi livelli di ossigeno (ipossia) nei tumori, come rilevato dalla colorazione immunoistochimica di sezioni tumorali per i marcatori di ipossia affermati come anidrasi carbonica IX (CAIX), correla con un esito clinico peggiore nel cancro al seno ^3,4 caratteristiche Così che incorporano come ipossia in modelli di screening può migliorare la nostra capacità di scoprire nuovi bersagli farmacologici che sarà più efficace in vivo. Infatti, rivolti con successo tumori aggressivi che contengono l'ipossia è una priorità clinica ^5.

L'alterazione dello screening tradizionale 2D siRNA, nel tentativo di ricapitolare più accuratamente elementi delle condizioni incontrate dalle cellule tumorali nel microambiente tumorale, ha portato all'identificazione di diversi geni tha sono stati trovati per essere importante per la crescita del tumore in vivo. Questi includono schermi di genomica funzionale eseguite in condizioni di siero basse ^6, condizioni di ipossia ⁷ e ⁸ in combinazione. Ad esempio, il silenziamento di 6-Phosphofructo-2-Kinase / Fruttosio-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), una proteina responsabile della regolazione carbonio che entra glicolisi, indotto solo apoptosi nelle linee di cancro alla prostata derivate da metastasi quando coltivate in basso siero. Silenziamento di PFKFB4 nelle normali linee di cellule della prostata, alle stesse condizioni ha avuto alcun effetto, mentre, l'esaurimento delle PFKFB4 completamente ablated la crescita della linea di cellule di cancro alla prostata xenotrapianti ^6.

In un pannello esteso di linee cellulari di cancro al seno, il silenziamento di mono-carbossilasi trasportatore 4 (MCT4) preferenzialmente portato alla riduzione della crescita linea cellulare in condizioni di bassa ossigeno. Questa vulnerabilità è stato convalidato in vivo nel cancro al seno linea cellulare ortotropa xenograFTS. Forse la cosa più sorprendente, mettendo a tacere di acetil-CoA sintetasi 2 (ACSS2), un enzima responsabile della conversione di acetato in acetil-CoA, ridotto numero di carcinoma a cellule in condizioni di stress di nutrienti (basso tenore di ossigeno e siero), ma ha avuto poco o nessun effetto in condizioni di coltura normali ^8. Ablazione del ACSS2 influenzato la crescita del seno e alla prostata xenotrapianti che suggeriscono che i gradienti di nutrienti non esistono in isolamento all'interno del microambiente tumorale e che le cellule che si trovano in queste regioni sono essenziali per la progressione del tumore ^8. Inoltre, ACSS2 è stato anche trovato per essere importante nel glioblastoma e carcinomi epatocellulari ^9,10, suggerendo che l'aumento dell'attività ACSS2 nei tumori potrebbe essere un meccanismo fondamentale che sostiene la crescita in condizioni sfavorevoli.

Collettivamente, questi studi dimostrano che riassuntiva delle condizioni incontrate in vivo ed eseguendo schermi siRNA consente l'identificazione di gEnes essenziali per la sopravvivenza del cancro. Così come impattare la crescita delle cellule del cancro 2D in condizioni di stress dei nutrienti, l'esaurimento di geni bersaglio in questi studi ha inibito il cancro linea di cellule crescita sferoide, rispecchiando quello che è stato osservato in xenotrapianti tumorali ^6,8. Così, sferoidi linee cellulari di cancro contengono molte delle condizioni incontrate nel microambiente tumorale che conferiscono la sensibilità al ACSS2 silenziamento. Infatti, sferoidi visualizzare le sfumature di nutrienti (siero e ossigeno), variazioni di pH, tridimensionale (3D) il contatto cellula-cellula, ma anche, alterazioni nella celerità proliferativa con cellule in fase di arresto del ciclo cellulare e l'apoptosi. Questo è esemplificato dalla presenza nel sferoidi tumorali di regioni necrotiche, una caratteristica non trovata in coltura tradizionale 2D.

sferoidi di cellule di cancro sono già stati utilizzati come modelli più biologicamente rilevanti per lo screening di piccole molecole inibitrici, ma questo consente solo per la validazione di efficacia composto o il riutilizzo dei compounds originariamente progettare per altre malattie ^11. Attuali metodi di screening sferoide non consentono l'analisi di esaurimento gene specifico in un alto rendimento di modo alta contenuti. Qui, descriviamo per la prima volta, una conduttura genomica funzionale per scoprire le dipendenze di geni specifici che utilizzano la tecnologia small interfering RNA (siRNA) in sferoidi linee cellulari tumorali. Abbiamo progettato una libreria su misura con siRNA di targeting dei 200 geni più frequentemente mutato nei tumori mammari umani e valutato l'impatto di esaurimento gene sul formato sferoide e l'attività metabolica in BT474 sferoidi di cancro al seno. Siamo stati in grado di robusto e riproducibile di rilevare l'impatto della ERBB2 e PIK3CA tacere nelle culture 3D. Inoltre, si potrebbe valutare l'impatto di esaurimento gene sull'architettura spaziale di sferoidi BT474 con immunoistochimica.

Protocollo

1. Preparazione di 96-pozzetti siRNA

NOTA: I bordi esterni di una piastra a 96 pozzetti sono più inclini all'evaporazione rispetto ad altri pozzi, limitare così la quantità di siRNA a 60 per 96 pozzetti. Riempire i pozzetti esterni con media semplice o PBS per limitare questo. Inoltre, si consiglia una schermata di convalida di colpi per alleviare pregiudizi piastra.

1. Diluire i siRNA a 250-500 ng / ml in media di siero ridotto (secondo le raccomandazioni del costruttore) e un'aliquota di 10 microlitri nei rispettivi pozzetti della piastra a bassissimo attacco. Eseguire tutte le schermate in triplice copia.
   NOTA: Incorporare appropriate non-targeting (negativo) e l'abbattimento (positivo, come UBB e Plk1) controlli siRNA nella progettazione piatto per garantire l'efficienza di trasfezione può essere valutata. L'utilizzo di piastre bassa fissaggio per il lavoro siRNA è critica, come saranno aggiunti alla miscela di trasfezione le cellule. Non possiamo escludere che alcuni produttori di ultra-basso di attaccopiastre possono avere effetti sottili sulla crescita sferoide. Come tale si consiglia di questi sono testati da parte dell'utente finale.
2. piastre di copertura con guarnizioni adesive e conservare a -20 ° C.

2. inverso Trasfezione di linea cellulare

1. Il giorno della schermata, sbrinare le piastre a temperatura ambiente e girare per 5 minuti a 1000 xg utilizzando una centrifuga da banco. Aggiungere 10 ml di media siero ridotto contenenti il ​​reagente ottimizzato-trasfezione in ciascun pozzetto con una pipetta multicanale. Lasciare le piastre per 15 minuti per complessi trasfezione contenenti siRNA per formare.
   NOTA: Questo studio ha utilizzato la linea di cancro al seno cellule BT474 per lo screening genomico funzionale (coltivate in alta DMEM glucosio (Dulbecco Modified Eagle Medium) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e antibiotici).
2. Trypsinize le cellule essere schermati (0,05% tripsina e 0,53 mM EDTA) finché non staccano dal pallone, neutralizzare con volume appropriato di linea cellulare specifmedia ic e centrifuga per 5 minuti a 1000 xg in una centrifuga da banco per rimuovere tripsina. Risospendere le cellule con un volume adeguato di medie e determinare il numero di cellule accurata utilizzando un contatore di cellule.
   NOTA: in genere 5.000 cellule per pozzetto sono sufficienti per la formazione sferoide nella maggior parte delle linee cellulari testate. È importante contare con precisione le celle come una sospensione singola cella per la comparazione taglie accurate.
3. Diluire le cellule a 5.000 cellule per 180 ml di mezzo freddo (4 ° C).
   NOTA: L'aggiunta dei componenti della matrice della membrana basale ricostituita influirà negativamente l'efficienza di trasfezione e si raccomanda che non viene utilizzato. linea di ottimizzazione cellulare per confermare la formazione sferoide la capacità e l'efficacia atterramento deve essere eseguita prima della schermata.
4. Trasferire la sospensione cellulare ad un serbatoio, pipetta per mescolare e aggiungere 180 microlitri in ciascun pozzetto della piastra di fissaggio 96 pozzetti ultra-bassa, contenente la siRNA preparato precedentemente (2.1).
5. Centrifuge la piastra a 1000 xg in una pre-raffreddata a 4 ° C centrifuga per 10 minuti e poi tornare a una cultura incubatore 37 ° C tessuto.
6. NOTA: Le cellule appaiono come un mosaico nel fondo dei pozzetti. Nel corso dei prossimi 12 - 24 ore le cellule saranno aggregare insieme per formare una singola sfera.
7. Dopo 24 h, osservare le cellule formano un singolo sferoide nel centro del pozzo. Aggiungere 100 ml di terreno completo a ciascun pozzetto per favorire la crescita.
8. Rifornire media dopo tre giorni. Rimuovere delicatamente 100 ml di media da ciascun pozzetto e aggiungere 100 ml di terreno fresco.
9. Il giorno 7, quantificare l'entità sferoide automatizzato su un lettore di piastre in grado di monitorare la crescita quantitativamente sferoide nel tempo (vedi sezione 3).
10. In seguito, determinare la vitalità delle cellule utilizzando un colorante luminescenti vitalità cellulare (vedi sezione 4).

3. Immagine automatiche di acquisizione

1. Scansione le piastre su un banco, l'imaging micro-pozzetti citometro il giorno 7.
   1. Aprire il software, selezionare la seguente: '96 be 'piatto', selezionare il tipo di piatto appropriata e immettere un nome dell'esperimento. NOTA: Ogni ulteriore informazione può anche essere aggiunto nel software.
   2. Selezionare l'applicazione 'Tumorsphere'. Modificare la messa a fuoco in modo che la sferoide è a fuoco e ha un contrasto ottimale.
      NOTA: Si consiglia di 'messa a fuoco basata immagine' come variazioni significative nei formati sferoidali sono attesi.
   3. Selezionare i pozzi che richiedono la scansione e 'scan Start'.
   4. Utilizzando il software dello scanner piatto, in modo che la maschera oggetto rappresenta con precisione le dimensioni sferoide. A tale scopo, la regolazione delle impostazioni del diametro colonia, dilatazione confine, spessore minimo e di precisione, specifico per ogni linea cellulare testati ^11,12.
      NOTA: L'area sferoide sarà quindi calcolato utilizzando l'algoritmo software. Ad esempio, per calcolare con precisione l'area di sferoidi BT474 coltivate per sette giorni regolare precisione di 'alta' und impostare il diametro minimo colonia a 200 pM. Questo dovrebbe produrre un adeguato rappresentante maschera sferoide dell'area sferoide.
      NOTA: Questi dati possono poi essere esportati dalla macchina, utilizzando la funzione di esportazione, in sotto forma di un file di dati con annotazioni. Data è piatto mediana normalizzata, combinati e analizzati sia da z-score o strettamente differenza media standardizzata (SSMD) per identificare siRNA che hanno avuto un effetto statisticamente significativo sulla zona sferoide.

4. Determinazione vitalità cellulare

1. Dopo zona sferoide è stato calcolato, determinare la fattibilità utilizzando un colorante vitalità cellulare luminescenti. Preparare il reattivo secondo le istruzioni del produttore.
2. Rimuovere con cautela 100 ml di media da ciascun pozzetto e aggiungere 100 ml di colorante vitalità. Incubare le piastre per 15 minuti poi eseguire la scansione utilizzando un lettore di piastre luminescenti.
   NOTA: Questi dati possono poi essere esportati dalla macchina, utilizzando la funzione di esportazione, in ala forma di un file di dati con annotazioni. Data è piatto mediana normalizzata, combinati e analizzati sia da z-score o strettamente differenza media standardizzata (SSMD) per identificare siRNA che hanno avuto un effetto statisticamente significativo sulla vitalità sferoide.

Risultati

Saggi sferoide in ultra-bassi di fissaggio piastre a 96 pozzetti forniscono una valutazione fenotipica high-throughput per il potenziale di oncogenesi in un contesto che riassume più facilmente le condizioni fisiologiche si trovano in tumori in vivo. In effetti, le linee di cellule di cancro MCF10DCIS.com e strutture sferoidali stretti forma BT474 (Figura 1A) e di indagine immunoistochimica di sezioni sferoidali hanno mostrato cambiamenti spaziali distinti nella morfologia cellulare e nucleare. Nel corso del tempo, alcuni sferoidi, come sferoidi BT474 sviluppano regioni necrotiche, una caratteristica comune dei tumori solidi aggressivi (Figura 1B). Alcuni sferoidi non sviluppano nuclei necrotiche, come la linea cellulare MDA-MB-231, ma fanno visualizzazione marcata variazione marcatore proliferativo Ki67, che correla inversamente con spaccati caspsase-3 espressione, un marker di apoptosi (Figura 1C). Per stabilire che le linee cellulari multiple sono infatti Receptiva di siRNA-mediato silenziamento genico BT474, MCF10DCIS.com, le cellule JIMT1 MDA-MB-231 e sono stati inverso trasfettate con siRNA per sette giorni. La presenza di trasfezione reagenti (finto) o transfezione di siRNA di controllo ha avuto alcun effetto sulla vitalità sferoide, mentre il silenziamento del gene essenziale ubiquitina B (UBB) ha ridotto significativamente la vitalità sferoide in tutte le linee cellulari testate (Figura 1D).

Abbiamo progettato una libreria siRNA umano che comprendeva i geni più frequentemente mutato in non selezionata, ER +, HER2 + e triple tumori al seno negativi. Questa libreria è costituito da geni di funzione conosciuta, come MYC, PIK3CA e TP53 e coloro il cui contributo alla carcinogenesi non è stabilito. La schermata contiene anche diversi siRNA di controllo-targeting non (Control # 1, # 2 di controllo) e siRNA mira geni essenziali, come ad esempio Plk1 e UBB, che agiscono come l'uccisione di controllo (Tabella 1). Abbiamo scelto di utilizzare il CANC senoer linee cellulari BT474 quanto facilmente formare sferoidi senza aggiunta di membrana basale ricostituita, vengono stabilite linee cellulari cavallo di battaglia e hanno una nota architettura genomico. Ad esempio, le cellule BT474 sono positivi per il recettore degli estrogeni (ER +), overexpress il recettore del fattore di crescita epidermico umano 2 (HER2 +) e le mutazioni porto di TP53 (E285K) e PIK3CA (K111N) ^13.

Utilizzando il protocollo descritto sopra, abbiamo monitorato l'esaurimento gene impatto dovuto alla taglia sferoide e vitalità dopo sette giorni di siRNA trasfezione inversa (Figura 1E). È interessante notare che la maggior parte dei geni non hanno un effetto significativo sulla zona sferoidale o vitalità (Figura 2A). Silenziamento del foxo3, PIK3CA, ERBB2 e SF3B1 provocato la più significativa riduzione riproducibile in formato sferoide. Questa riduzione è stata osservata anche in vitalità sferoide dopo ERBB2 e SF3B1 silenziamento. È incoraggiante, abbiamo CONFirmed l'impatto di PIK3CA, ERBB2 e SF3B1 silenziamento dimensioni sferoide utilizzando campo chiaro microscopia (Figura 2B). Abbiamo precedentemente identificato come un gene SF3B1 essenziale in numerosi modelli della linea cellulare e quindi siSF3B1 rappresenta un buon controllo uccisione in aggiunta a UBB ^14. È interessante notare che, di tutti i 200 geni solo il silenziamento di E-caderina determinato un significativo aumento della redditività sferoide (Figura 2A). Investigation della morfologia sferoidale mostrato che E-caderina silenziamento determinato una ripartizione completa dell'architettura sferoide, con cellule vitali appoggiato sul fondo della bassa attaccamento ben (Figura 2B). inchiesta manuale dei dati schermata del volume sferoide ha dimostrato che questo era stato anche osservato, ma era stato eliminato dalla zona quantificazione causa l'oggetto essere al di sopra dei limiti di dimensioni set. Come già evidenziato, le cellule BT474 overexpress il recettore tirosin-chinasi HER2 e porto una mutazione oncogeno nel PIK3CA (K111N). Abbiamo confermato che il silenziamento di ERBB2 e PIK3CA provocato ridotta vitalità sferoide, mentre trasfezione con controlli non-targeting non ha avuto effetto (Figura 2C).

Avanti abbiamo studiato l'impatto di esaurimento siRNA sulla istologia sferoide. sferoidi BT474 sono stati inverso trasfettate con i non-targeting siRNA controllo e siRNA mira PIK3CA, ERBB2 e UBB. Silenziamento di ERBB2 e UBB ha comportato una riduzione del marcatore pro-proliferativo Ki67 rispetto al controllo siRNA (Figura 2D). L'attivazione del marker pro-apoptotico spaccati caspasi-3 è stata osservata solo dopo UBB silenziamento, suggerendo che la deplezione di HER2 e PIK3CA non ha comportato l'apoptosi, ma erano citostatici piuttosto che citotossico. Infatti, silenziamento di HER2 e PIK3CA ha determinato un aumento dell'espressione della proteina p27 della proteina arresto del ciclo cellulare rispetto al controllo sferoidi transfettate.

ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Presi insieme, questi risultati mostrano che le cellule BT474 sono guidati da oncogeno HER2 e PIK3CA segnalazione, se coltivate come sferoidi 3D Ancora più importante, questi risultati dimostrano che è possibile. progettare e implementare una libreria su misura di screening siRNA di centinaia di geni in sferoidi linee cellulari di cancro solidamente e riproducibile.

Figura 1: Linea cellulare Ottimizzazione per la crescita dimensionale 3. A. Le linee di cellule di cancro al seno, MCF10DCIS.com e BT474 sono state coltivate in piastre di fissaggio basse per 7 giorni. Immagini rappresentative Brightfield sono state scattate con un microscopio invertito. Barre di scala = 100 micron. B. MCF10DCIS.com e BT474 sferoidi sono stati coltivati per 28 giorni. 100 ml di mezzi freschi era rifornito ogni 3 - 4 giorni. Sferoidi sono stati fissati in 3,8% di formaldeide, embedded, sezionati e colorati con ematossilina ed eosina (H & E). Immagini rappresentative sono mostrati a basso e alto ingrandimento. Barre di scala rappresentano 100 micron e 33 micron rispettivamente. C. MDA-MB-231 sferoidi sono state coltivate per 21 giorni. 100 ml di mezzi freschi era rifornito ogni 3 - 4 giorni. Sferoidi sono stati fissati in 3,8% di formaldeide, incorporati, sezionati e colorati con Ki67 e spaccati caspasi-3. Immagini rappresentative sono mostrate. Barre di scala = 100 micron. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231, e JIMT1 linee cellulari sono stati inverso trasfettate con (solo reagente di trasfezione) finto e le siRNA di controllo e UBB, piastre di fissaggio ultra-bassi sono stati poi filate per formare sferoidi. mezzo fresco (100 ml) è stato aggiunto nei giorni 1 e 4. Dopo 7 giorni, la vitalità cellulare è stata quantificata. I dati rappresentano la media ± DS di due repliche biologiche indipendenti eseguiti in triplice copia normalizzata per il controllo # 1. La significatività statistica è stata calcolata utilizzando un APNUStudenti IRED t-test (p <0.05). E. Un diagramma di flusso che riassume il protocollo di trasfezione inverso utilizzato per interrogare funzionalmente dipendenza gene in sferoidi linee cellulari tumorali. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: funzionale indagine genomica di BT474 Spheroids rivela un oncogenici dipendenze. Cellule A. BT474 sono stati inverso trasfettate con la libreria siRNA siGENOME umano 200-gene in triplice copia. è stata osservata dimensioni sferoidale e la vitalità. I valori dei dati grezzi erano piastra mediana normalizzati e z-score sono stati calcolati per identificare valori anomali significativi superiori a 1.7x la deviazione standard della piastra mediana ^15. Nota geni periferici ERBB2, SF3B1, Plk1 e UBB unND E-cad. siRNA che aumentate o ridotte zona sferoidale e la vitalità sono di colore blu e rosso, dove il rosso rappresenta i siRNA di controllo di. B. Le cellule sono state trasfettate con inversione di controllo non-targeting, E-caderina (E-Cad), PIK3CA, ERBB2 o UBB siRNA e poi filata in una piastra a bassissimo attacco per formare sferoidi. Dopo 7 giorni, campo chiaro immagini rappresentative sferoidali sono state scattate con un microscopio invertito. Barre di scala = 100 micron. C. Le cellule sono state trasfettate con inversa non-targeting di controllo, PIK3CA, ERBB2 o UBB siRNA e poi filata in una piastra a bassissimo attacco per formare sferoidi. Dopo 7 giorni, la vitalità cellulare è stata quantificata. I dati rappresentano la media ± DS di due repliche biologiche indipendenti eseguiti in triplice copia normalizzata per il controllo # 1. La significatività statistica è stata calcolata utilizzando un studenti spaiati t-test (p <0.05). D. Dopo 7 giorni, sferoidi sono state fissate, incorporati, sezionati e coloratiper H & E, Ki67, Cleaved caspasi-3, e P27. Immagini rappresentative sono mostrate. Barre di scala = 100 micron. Nota la H & E di sferoidi siControl appaiono più piccoli a causa di un artefatto di sferoidi di lavorazione e dei singoli intatto scelti per la colorazione. Tuttavia, questo non sminuisce i cambiamenti osservati con le immagini acquisite ei risultati vitalità cellulare. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	Non-targeting 1	TP53	DST	KMT2C	non trattato 1	FCGBP	ARID1B	FBXM7	TTC40	Non-targeting 2
	GATA3	TTN	MUC12	MUC4	AHNAK	HUWEI1	DNAH11	ITPR2	ABCA13	CREBBP
	MAP2K4	PIK3CA	F5	APOB	ANKRD30A	MUC17	DNAH17	LAMA2	ASSO	CSMD2
	STARD9	USH2A	FAT3	LPR2	CSMD3	MYO18B	DNAH5	MDN1	ARHGAP5	DNAH9
	CXCR3	MUC16	RB1	PKHD1L1	DNAH2	SYNE2	DYNC1H1	PCLO	CACNA1B	ERBB2
	Plk1	SYNE1	LYST	PTEN	SPTA1	non trattata 2	VHL	RYR1	COL6A3	UBB
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	Non-targeting 1	ENAM	RYR2	BRCA2	non trattato 1	FMN2	HECW1	LAMB4	SI	Non-targeting 2
	FHOD3	MACF1	RyR3	C2ORF16	DMD	FRG1	HERC2	MYH11	STAB1	ZDBF2
	GOLGA6L2	NEB	SMG1	CACNA1E	DNA14	GCC2	HIVEP2	NIPBL	TANC1	ZNF536
	HMCN1	NF1	UBR5	CACNA1F	DYNC2H1	GON4L	HYDIN	PKD1L1	TF	ANK3
	HRNR	OBSCN	USP34	CYMA5	FAM208B	GPR112	ITSN2	RNF213	TPR	ASPM
	PCDH15	XIRP2	COL7A1	FLG2	non trattata 2	VHL	SAGE1	UNC80	UBB
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	Non-targeting 1	DCHS2	MUC5B	ZFHX4	non trattato 1	MYO9A	SPHKAP	CXORF22	NCOR1	VPS13D
		DMXL2	MXRA5	ANK2	KIAA1210	PRUNE2	TCHH	DANH6	NOTCH2	ANKRD12
	BIRC6	DNAH10	TENM1	ATM	LRP1	SCN10A	VPS13C	DNAH7	SPEN	C5ORF42
	CDH1	DNAH3	PEG3	DIDO1	MAP1A	SCN2A	IPTR3	ERBB3	SRRM2	CCDC88A
	CUBN	NOCK11	RELN	DNAH8	MED12	SHROOM2	CEP350	FAT4	SZT2	CHD4
	Plk1	EYS	SACS	KIAA1109	MED13	non trattata 2		KMT2A	VPS13A	UBB
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
	Non targeting	QSER1	ARID1A	WDFY3	non trattato 1	sdk1	TEX15	LAMA1		Non-targeting 2
	COL14A1	SHROOM3	ATRX	EFCAB5	SF3B1	CBFB	AHNAK2
	CSMD1	TBX3	KIAA0947	FOXA1	ITPR1	DDX3X	KIF4A
	MEFV	UBR4	MYCBP2	INPPL1	FLG	HECTD4	FAT2
	MGAM	VCAN	NBEAL1	MAP3K1	AKAP9	GPR98	foxo3
	Plk1	ZNF462	SETX	NRP1	HERC1	non trattata 2	VHL			UBB

Plk1

Tabella 1: layout delle piastre e siRNA umana Biblioteca De-convoluzione. La tabella contiene il contenuto di ciascuna delle piscine siRNA e il layout per le piastre di attacco bassi utilizzati nella schermata.

Discussione

modelli tridimensionali di cancro sono sempre più utilizzati per valutare l'efficacia di composti noti e nuovi che sono stati progettati per uccidere selettivamente le cellule tumorali. Sferoidi di cellule di cancro sono strutture che presentano condizioni più simili a quelle incontrate nei tumori in vivo, così composti che hanno aumentato l'efficacia in 3D sono più probabilità di avere un effetto in vivo. Tuttavia, queste modalità non consentono l'identificazione di potenziali nuovi bersagli che non sono stati oggetto di disegno farmaco che potrebbe avere una notevole efficacia nel trattamento del cancro.

Abbiamo sviluppato un approccio di genomica funzionale siRNA che ha permesso di lunga durata silenziamento genico fino a sette giorni di sferoidi linee cellulari tumorali. Ci sono diversi passaggi critici al protocollo che richiedono l'ottimizzazione prima di uno schermo siRNA può essere eseguita. La capacità di formare sferoidi vitali riproducibili su larga scala è essenziale. Inoltre, uncondizioni di trasfezione ppropriate devono essere rigorosamente ottimizzate. Vi proponiamo di trialing diversi reagenti di trasfezione differenti con adeguate non-targeting e uccidendo i controlli prima di tentare lo schermo. Siamo stati in grado di dimostrare che le diverse linee di cellule di cancro al seno di uso comune, vale a dire BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 e JIMT1 erano suscettibili di siRNA trasfezione. Inoltre, mettiamo a disposizione una prova di principio i dati di screening dei 200 geni più frequentemente mutato nel cancro al seno in sferoidi BT474, confermato la loro dipendenza da amplificazione del HER2 e la mutazione oncogenica di PIK3CA. È interessante notare, silenziamento del fattore di trascrizione foxo3 comportato una riduzione delle dimensioni sferoide ma nessun effetto significativo sulla vitalità. Foxo3 è noto regolare la risposta all'ipossia, alterando la capacità metabolica delle cellule tumorali permettendo loro di adattarsi più facilmente al loro ambiente ^16. Questo ruolo potrebbe potenzialmente interferire con la lettura vitalità cellulare in quanto rileva ATP abbondanza, Uno dei principali prodotti del metabolismo cellulare.

A sostegno di osservazione di una riduzione delle dimensioni sferoide, è stato dimostrato che il silenziamento di foxo3 in HeLa eterotrapianti compromessa la crescita tumorale e l'apoptosi indotta ^17. E 'importante notare che alcuni geni possono influenzare la capacità delle cellule tumorali di mantenere la loro architettura 3D, che potrebbe causare falsi positivi. Per esempio, l'abbattimento di E-caderina ha provocato la dissoluzione della struttura BT474 sferoide. Questo era stato precedentemente segnalato tramite E-caderina anticorpi ¹⁸ di mira. Come con qualsiasi piattaforma di screening, i potenziali obiettivi dovrebbero essere nuovo controllo per valutare la riproducibilità dell'effetto osservato. Esistono limitazioni alla tecnica, cioè la natura transitoria del silenziamento genico siRNA-mediata. Sostenuta tacere più di sette giorni non era realizzabile con siRNA.

Il vantaggio di questo approccio è che può essere accoppiato con vari altri biomecoloranti Tric non solo quelli che valutano sferoide viabilità, per esempio, dare informazioni spaziali di ipossia sferoide o monitorare le cellule in fase di apoptosi. Inoltre, poiché le scansioni Plate Reader sono relativamente rapido e non invasivo, l'impatto di siRNAs sulle dimensioni sferoide può essere valutata nel tempo piuttosto che nel punto finale sperimentale. In effetti, stiamo attualmente esplorando alcuni di questi viali all'interno della nostra pipeline di screening. Un approccio alternativo che utilizza colture 3D per identificare nuovi dipendenze è l'uso di librerie chimiche che inibiscono sia un'ampia gamma di obiettivi o determinate famiglie di proteine. Infatti, Bitler et al. utilizzato questo approccio mirato per identificare l'interazione letalità sintetica tra lo stato e gli inibitori ARID1A EZH2 in ovarico carcinomi a cellule chiare ^19. La scoperta della tecnologia di editing gene CRISPR-Cas9 ha anche permesso lo sviluppo di schermi genetiche in culture organoide e in vivo. Tuttavia, til suo approccio è dipendente dotato di adeguate strutture per animali e possono essere costi proibitivi ^20.

In conclusione, riteniamo che abbiamo delineato un protocollo che più precisamente i modelli ossigeno e nutrienti sfumature, che sono caratteristiche del microambiente tumorale in vivo, per consentirne l'identificazione di bersagli tumorali nuovi prodotti o la convalida robusta degli obiettivi stabiliti. Inoltre, il protocollo può essere applicato a qualsiasi tipo di linea di cellule che forma sferoidi e quindi può essere utilizzato di routine nella comunità di ricerca cancro per schermi siRNA alto rendimento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ninna	nanna Oz Bioscienze	LL70500	reagente di trasfezione a base lipidica
Viromer	Lipocalyx	VB-01LB-01	reagente di trasfezione di polimeri simili a virus
Piastra di fissaggio ultra-bassa Piastra di fissaggio	Corning	CLS7007	96 pozzetti
Guarnizioni per piastre	in lamina ThermoFisher	AB-0626
Colorante luminescente per la vitalità cellulare	Promega	G7570	CellTitre-Glo
Puntali per pipette (200 μ L)	Starlab	S1111-0806
Puntali per pipette (10 μ L)	Starlab	S1111-3800
Puntali per pipette (1.000 μ L)	Starlab	S1122-1830
Pipette sierologiche (5 mL)	Sarstedt	86.1253.025
Pipette sierologiche (10 mL)	Sarstedt	86.1254.025
Pipette sierologiche (25 mL)	Sarstedt	86.1685.020
RPMI Media	GIBCO	11875-093
DMEM Media	GIBCO	11965-084
Opti-MEM	GIBCO	31985070
Feta siero bovino	GIBCO	16140063
siRNA	Dharmacon	Libreria
Countess Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000
Vetrini per camera di conteggio cellulare	ThermoFisher Scientific	C10312
Celigo S		Contattare l'azienda
Victor X5	Perkin Elmer	contattare l'azienda
Centrifuga da banco	Vari
Axiovert Microscopio invertito a campo chiaro	Zeiss	contattare l'azienda
Coltura tissutale CO2; Incubatrice	Vari
Pipetta multicanale	Vari