Articolo metodologico

Imaging di cellule di figura alterazione e la cella in Movimento Drosophila gastrulation Utilizzando DE-caderina Reporter mosche transgeniche

DOI:

10.3791/54764

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29 dicembre 2016

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1Biotechnology and Genetic Engineering Department, Jahangirnagar University, 2JT Biohistory Research Hall, 3Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University, 4Graduate School of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 5Institute of Genetics and Animal Breeding of the Polish Academy of Sciences

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo una procedura per catturare immagini dal vivo della gastrulazione di Drosophila. Questo ci ha permesso di comprendere meglio la costrizione apicale coinvolta nello sviluppo precoce e di analizzare ulteriormente i meccanismi che regolano i movimenti cellulari durante la modificazione della struttura tissutale.

Abstract

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Gastrulation è la prima serie di eventi morfologicamente dinamici che si verificano durante lo sviluppo embrionale di animali multicellulari come Drosophila. Questa alterazione morfologica è anche riconosciuto come epiteliale di transizione mesenchimale (EMT). Disregolazione di EMT è associata a fibrosi e metastasi del cancro. Vi è evidenza emergente che EMT è controllato da una serie di meccanismi molecolari. Come sono noti anche questi, molti geni chiave che controllano la costrizione apicale di essere fattori importanti nella EMT osservato in metastasi del cancro. Come EMT durante Drosophila gastrulazione, le cellule epiteliali possono essere indotte a cambiare la loro forma e essere riprogrammati per reindirizzare il destino della cellula verso diversi altri tipi di cellule. Qui forniamo un metodo di imaging affidabile di Drosophila gastrulazione per saggiare l'avvio di movimenti cellulari morfogenetici e l'identificazione destino delle cellule durante questa fase di sviluppo embrionale. Utilizzando questo metodo, identifichiamo cell riarrangiamento al momento della gastrulazione e dimostrare l'importanza della costrizione apicale durante la gastrulazione usando GFP etichettati DE-caderina.

Introduzione

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Gastrulation è la prima serie di eventi morfologicamente dinamici che si verificano durante lo sviluppo embrionale di animali multicellulari come Drosophila 1,2. È interessante notare che, prove emergenti suggerisce che questo processo è regolato attraverso l'interazione tra i meccanismi meccanici e molecolari 3. Inoltre, la transizione epitelio mesenchimale (EMT), che è un processo fondamentale gastrulation, è anche implicato in processi patologici umani come metastasi 4-8. Come sono noti anche questi, molti geni che controllano costrizione apicale di essere fattori chiave per la EMT osservata in metastasi del cancro 9. Così, costrizione apicale al momento della gastrulazione è un ottimo modello per studiare i suddetti meccanismi di regolazione e di migliorare la nostra comprensione delle metastasi del cancro. Il vantaggio di questa tecnica è che si può osservare il movimento delle cellule al momento della gastrulazione in tempo reale e, quindi, saremogrado di schermo geni coinvolti nel gastrulation così come metastasi del cancro.

Anche se relativamente sconosciuto, cella-a-cella di adesione è pensato di svolgere un ruolo centrale nella costrizione apicale 1. La genetica della Drosophila è adatto per le indagini livello di singola cellula che esplorano i meccanismi molecolari di regolazione. Questo modello ci permetterà di scoprire l'importanza della costrizione apicale durante la gastrulazione. Inoltre, questo metodo può essere utilizzato per lo screening geni coinvolti nella metastasi del cancro. Cattura di immagini in diretta di Drosophila gastrulation ci ha ulteriormente permesso di comprendere in modo più approfondito i meccanismi molecolari che governano riarrangiamento dei tessuti. Qui, forniamo una descrizione completa di un metodo semplice per raggiungere questo obiettivo.

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Protocollo

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NOTA: Le mosche transgenici utilizzati in questo studio sono i seguenti: DE-cad :: GFP 10.

1. Preparazione del piatto mela

  1. Preparare una miscela di 12,5 g di agar, 125 mL 100% disponibile in commercio succo di mela, 12,5 g di glucosio, e 375 ml di H 2 O. scaldare la miscela in un forno a microonde e versarlo in un 3 centimetri piatto di coltura cellulare. Conservare la miscela a 4 ° C per un uso futuro.
  2. Dopo aver preparato la piastra mela, aggiungere un sottile strato di pasta di lievito impastata su di esso per consentire le mosche depongono uova.

2. Embryo Preparazione e protocollo Immagini dal vivo

  1. Mettere circa 50 mosche (25 maschi e 25 femmine) in una bottiglia per accoppiarsi e deporre le uova in seguito durante la notte su un piatto mela ricoperta di lievito impastata. Regolare la piastra succo di mela alla bocca della bottiglia. Mantenere la bottiglia a testa in giù in un incubatore. Avvolgere le bottiglie di plastica Drosophila azionari con un foglio di alluminio per richiedere °e vola a deporre più uova.
  2. La mattina seguente, sostituire la piastra vecchio succo di mela con uno nuovo.
  3. Lasciate che le mosche depongono le uova per 3 o 4 ore avvolgendo la bottiglia con un foglio di alluminio.
  4. Tre o quattro ore più tardi, raccogliere gli embrioni in un colino embrione dalla piastra succo di mela con un pennello o di cotone cattivo e lavarli con PBS. Lavare gli embrioni da 2 a 3 volte di più con PBS in piastre di coltura da 12 pozzetti.
  5. Dechorionate gli embrioni con il 50% di candeggina per 5 min in piastre di coltura da 12 pozzetti.
  6. Dopo il processo dechorionation, lavare gli embrioni 2 o 3 più volte con PBS.
  7. Trasferire gli embrioni per un piatto di coltura cellulare 3 centimetri contenente PBS e selezionare fase 5 embrioni sotto il microscopio in base al livello di trasparenza alle loro frontiere. Pipettare gli embrioni in scena utilizzando una punta della pipetta 200 microlitri.
  8. Quindi, posizionare due embrioni selezionati su un vetrino di vetro, e rimuovere l'eccesso di PBS con carta velina fino ritorto. Orientare gli embrioni lato dorsale suil vetrino utilizzando una carta velina fino ritorto. Dopo di che, fissare gli embrioni al vetrino di vetro con grasso al silicone con un ago sottile e carta velina contorto.
  9. Aggiungere una piccola goccia di olio alocarburi 700 sugli embrioni e posizionare il vetrino contenente gli embrioni capovolta sul vetrino frastagliata, lasciando spazio nella parte inferiore della slitta.
  10. Esaminare gli embrioni con un sistema di imaging confocale, un / laser Argon 488, e un obiettivo ad immersione in olio (63X).
    NOTA: Identificare l'embrione allo stadio di sviluppo adeguato è importante per catturare le immagini della manifestazione gastrulazione. In queste condizioni, osservano quasi tutti gli embrioni si sviluppano normalmente fino ad almeno fase 14. L'embrione analizzato può essere coltivato sviluppare ulteriormente come un adulto.

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Risultati

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Qui vi mostriamo gli eventi gastrulazione dell'embrione Drosophila e una panoramica generale della procedura di preparazione degli embrioni (Figura 1). Le membrane cellulari sono etichettati con DE-caderina :: GFP e immagini dal vivo dei movimenti delle cellule è effettuata al momento della gastrulazione in Drosophila (Figura 2). Dal momento che le mosche DE-caderina GFP ci permettono di visualizzare giunzioni di aderenza delle cellule, siamo in...

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Discussione

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Sebbene abbiamo precedentemente riportato una procedura simile per catturare immagini dal vivo del processo di gastrulazione in Drosophilla1, il metodo che descriviamo qui è dettagliato e facile da tracciare nell'espressione endogena della caderina e quindi è molto utile per lo screening genetico dei fattori chiave coinvolti nella gastrulazione. Per massimizzare il successo di questa procedura di imaging, è essenziale utilizzare un vetrino rientrato. La pressione meccanica a volte provoca la morte emb...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato dalla Fondazione Astellas per la Ricerca sui Disturbi Metabolici (HT), dalla Fondazione Scientifica Takeda (HT) e dal Programma supportato da MEXT per la Fondazione di Ricerca Strategica presso le Università Private (HT).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Olio alocarbonico 700SigmaMKBH 5726
Grasso per vuoto SiliconeBeckman335148
Vetrino coprioggetti Vetro MatsunamiSpessore No124 - 36 mm
Embryo starinerCorning Corning3477
Bottiglie di plastica Drosophilla Stock HitecMKC-100
DE-Cadherin knock-in moscheREF (10)

Riferimenti

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  1. Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
  2. Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
  3. Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
  4. Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3(2013).
  5. Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
  6. Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
  7. Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
  8. Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
  9. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
  10. Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).

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Costrizione apicaleImaging confocaleImaging time lapseTransizione epitelio mesenchimaleSviluppo embrionaleMarcato con GFP

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