Questo manoscritto descrive una procedura per monitorare il rimodellamento del cerebrovasculature durante accumulo di placca amiloide in vivo utilizzando longitudinale microscopia a due fotoni. Una preparazione assottigliato-teschio consente la visualizzazione di coloranti fluorescenti per valutare la progressione del danno cerebrale in un modello murino della malattia di Alzheimer.
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Rimodellamento del sistema vascolare cerebrale è un tratto comune di patologie cerebrali. In vivo tecniche di imaging sono fondamentali per rilevare la plasticità cerebrale o danni che si verificano straordinari e in relazione alle attività neuronale o il flusso di sangue. In vivo microscopia a due fotoni permette lo studio della plasticità strutturale e funzionale di grandi unità cellulari nel cervello vivente. In particolare, la preparazione finestra assottigliato-teschio permette la visualizzazione delle regioni corticali di interesse (ROI) senza indurre fenomeni significativi infiammazione cerebrale. sessioni di imaging ripetitivi di ROI corticale sono fattibili, che fornisce la caratterizzazione dei tratti distintivi della malattia nel tempo durante la progressione di numerose malattie del sistema nervoso centrale. Questa tecnica accedere alle strutture piale entro 250 micron del cervello si basa sul rilevamento di sonde fluorescenti codificati da marcatori cellulari genetici e / o coloranti vitali. Questi ultimi (ad esempio, destrani fluorescenti) vengono utilizzati per mappare la luminal comparto delle strutture cerebrovascolari. Germane al protocollo qui descritto è l'uso di un marcatore in vivo di depositi amiloidi, metossi-O4, per valutare il morbo di Alzheimer progressione (AD). Abbiamo anche descrivere l'elaborazione delle immagini post-acquisizione utilizzato per tenere traccia delle modifiche vascolari e deposizioni amiloidi. Pur concentrandosi attualmente su un modello di AD, il protocollo descritto è rilevante per altri disturbi del sistema nervoso centrale in cui si verificano cambiamenti patologici cerebrovascolari.
Introduzione
Il vascolare cerebrale è una struttura multi-cellulare, che è anatomicamente e funzionalmente accoppiato ai neuroni. Un rimodellamento dinamica dei vasi si verifica durante lo sviluppo del cervello e durante la progressione di patologie del sistema nervoso centrale (CNS) 1,2. E 'ampiamente accettato che il danno cerebrale è una caratteristica di molte malattie del sistema nervoso centrale, tra cui l'epilessia, il morbo di Alzheimer (AD), trauma cranico e encefalite 3,4. Pertanto, il rilevamento delle modifiche cerebrovascolari in vivo diventa significativo quando si modellano le malattie del sistema nervoso centrale, dall'esordio e in fasi croniche. Come modifiche cerebrovascolari si verificano spesso in concomitanza con un danno neuronale o la plasticità, l'imaging del neuro-vascolare rappresenta un punto di ingresso chiave per decifrare le malattie del sistema nervoso centrale fisiopatologia.
Questo protocollo descrive una procedura basata due fotoni longitudinale per monitorare il rimodellamento della cerebrovasculature in un modello murino diDC, una patologia progressiva caratterizzata da difetti cerebrovascolari su grandi e piccoli vasi di calibro a causa di deposizione della placca amyloidogenic 5-7. Questa procedura permette la visualizzazione dei depositi amiloidi e inseguimento della loro posizione e della crescita rispetto al rimodellamento neurovascolari tutto il corso della malattia. Coloranti fluorescenti vitali vengono iniettati prima di ogni sessione di imaging per la visualizzazione delle cerebrovasculature e amiloide placche in topi transgenici AD 8. Sessioni di imaging ripetute di un ROI attraverso una finestra cranio transcranica assottigliata è non invasiva e il metodo di scelta per valutare il rimodellamento neurovascolare nel cervello di topo vivente 2,5,9,10.
La procedura che segue illustra il protocollo chirurgico, acquisizione ed elaborazione delle immagini. La progressione precoce di angiopatia amiloide cerebrale (CAA) per lo più in generale leptomeningeo e arteriole penetranti è caratterizzata.
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Protocollo
I topi è consentito l'accesso ad libitum a cibo, acqua, e mantenuti in un ciclo luce-buio di 12 ore. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali da laboratorio conformi alle leggi nazionali ed europee e sono stati approvati dal Ministero dell'Istruzione e della Ricerca Scientifica (CEEA-LR-00.651-01) francese. Un totale di 6 transgenici 5xFAD e topi di controllo 4 littermate tipo selvatico (WT) sono stati utilizzati per questa procedura.
Preparazione 1. Pre-operatorio
- Intraperitoneale (IP) iniettare Metossi-X04 (10 mg / kg) 48 ore prima dell'intervento chirurgico per etichettare depositi Ap 11.
- Preparare sterile del liquido artificiale cerebrospinale (aCSF) (120 mM NaCl, 26,2 mM NaHCO 3, 2,5 mM KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 1,3 mm MgCl2, 10 mM glucosio, bolla con il 95% O 2/5% di CO 2 prima aggiungendo 2.5 mM CaCl 2).
- Sterilizzare strumenti chirurgici (forbici, pinze, lama di rasoio e bit trapano), con autoclave o uno sterilizzatore a caldo tallone prima asetticachirurgia.
- Pulire la panca e il microscopio piastra chirurgica con il 70% di etanolo e coprire con un panno assorbente pulito.
- Iniettare ketamina / xilazina (75 mg / kg e 10 mg / kg, rispettivamente) e il ketoprofene analgesico (2,5 mg / kg) IP.
- Controllare il livello adeguato di anestesia con la zampa o di coda pizzichi.
- Applicare sterili pomata oftalmica per gli occhi e accorciare il pelo (naso per le orecchie), evitando i baffi. Una crema depilatoria può essere utilizzato fintanto che è seguito da risciacquo con acqua accuratamente per evitare irritazioni della pelle. Accorciare il pelo rimanente con una lama di rasoio. Sterilizzare la pelle con soluzione antisettica iodopovidone.
- Posizionare il mouse sotto il microscopio binoculare e fare una incisione cutanea dalle orecchie al naso. Tirare la pelle lateralmente per esporre il cranio. Incidere il periostio e ripetutamente lavare il cranio con sterili aCSF per fermare eventuali sanguinamenti.
2. Vasculature Etichettatura e diluito SkullFinestra Preparazione (40 min)
- Rimuovere l'unguento occhio con una punta di cotone. Applicare una goccia di anestetico topico oftalmico (tetracaina 1%) e la pressione delicatamente la pelle intorno alla cavità oculare per raggiungere la sporgenza.
- Iniettare fluoresceina isotiocianato (FITC) coniugata con destrano (70 kDa) (100 mg / kg o 50 ml di una soluzione 50 mg / ml; ipodermico insulina) nel plesso retro-orbitale seguendo la procedura descritta da Yardeni e colleghi 12. Applicare sterili pomata oftalmica per gli occhi.
- Assicurarsi che la pelle è ritratto e il cranio è pulita e secca intorno l'area di esposizione selezionata. Applicare una piccola quantità di colla cianoacrilato attorno alla finestra della testa montare il dispositivo (comprensivi di lamette impilati, vedi Figura 1), e colla intorno alla regione bersaglio applicando una leggera pressione per alcuni secondi 10.
- Tirare le estremità della pelle al bordo della finestra della testa montare il dispositivo, assicurandosi che la zonasecco. Fissare la pelle e il bordo della finestra con una piccola quantità di colla grado cianoacrilico veterinario e attendere secco (Figura 1).
- Fissare l'animale in fase di utilizzo del dispositivo head-mount. Risciacquare con aCSF sterile e assicurare che il pozzo tra la pelle e il dispositivo di testa di montaggio è perfettamente sigillato. Avvolgere il mouse in una coperta di sopravvivenza per mantenere normotermia.
- Eseguire assottigliamento del cranio in soluzione aCSF come descritto in precedenza 10. Si noti che il cuoio capelluto non viene completamente rimosso. Regolarmente cambiare il aCSF per eliminare i residui di osso e per evitare il surriscaldamento dei tessuti. Qualsiasi detriti osso residuo può essere rimosso con sbuffi d'aria brevi. La soluzione aCSF attenua le vibrazioni create dalla foratura.
NOTA: Lo spessore del mouse cranio varia da 80 a 150 micron a seconda dell'età dell'animale e la regione di interesse. - Utilizzando un trapano dentale (a velocità media e una fresa 0,7 mm) avviare diradamento la superficie del cranio in un'area 1.0 mm di diametro con un normale movimento verticale parallelo al cranio e rimuovere la maggior parte dell'osso spugnoso (primo 40 - 70 micron). ricordarsi di sostituire aCSF ogni 20-30 secondi e limitare la perforazione ininterrotta a 3-4 sec. Si noti che l'osso vicino a punti di sutura è altamente vascolarizzato. Applicare aCSF presoaked Gelfoam per fermare eventuali emorragie.
- Utilizzare una lama di microchirurgia oftalmica usa e getta tagliente per continuare con l'assottigliamento del cranio, facendo attenzione a non applicare una pressione eccessiva. La regione finale è di circa 0,5 mm di diametro, con uno spessore di 20 - 35 micron.
NOTA: A causa di ricrescita ossea e cicatrici, è necessario ulteriormente sottile finestra ad ogni sessione di imaging.
3. microscopia a due fotoni (45 min)
- Se necessario, iniettare con 19 mg / kg di ketamina per mantenere un'adeguata anestesia.
- Trasferire il mouse (fissato alla fase headmount) al microscopio laser a due fotoni. Utilizzando un immersione in acqua obj 20Xcace con un'apertura numerica di 1,0, individuare la finestra del cranio assottigliata al centro del campo ottico utilizzando la lampada epi-fluorescenza. Assicurarsi che l'obiettivo è sempre immerso in aCSF.
- Inizia scansione laser con una modalità bloccata laser pulsato (Ti-zaffiro 680-1040nm). Impostare lunghezza d'onda di eccitazione a 750 nm rispettivamente per rilevare la fluorescenza emessa del metossi-XO4 e FITC-destrano nei canali blu e verde.
NOTA: Il microscopio è dotato di due divisori di fascio a 506 nm e 555 nm. La luce blu viene catturato da un rivelatore NDD dotata di filtro 470 ± 12 nm. La luce verde è catturata da un rivelatore GaAsP alta sensibilità dotato di filtro nm 525 ± 25. La potenza del laser massima emessa dal obiettivo non deve superare i 10 mW per evitare danni ai tessuti indotta da laser. - Acquisire una pila basso ingrandimento (500 micron x 500 micron, 512 x 512 pixel; 2 micron) a passo uno zoom 0,7X numerica per creare una mappa 3D per la precisa rilocalizzazione del ROIin momenti successivi.
- Acquisire un mosaico di 4 immagini digitali ad alta ingrandimento con uno zoom 2X numerico (200 micron x 200 micron, 512 x 512 pixel; 1 micron passo). Utilizzando il software di imaging spostare la finestra in 200 micron passi per catturare tutte le regioni. Profondità di pile è tipicamente di 250 micron, a partire dalla superficie piale in ogni immagine del mosaico.
- Prima di rimuovere il mouse dal microscopio, scattare una foto o fare una mappa 2D del sistema vascolare piale per il futuro rilocalizzazione del campo dell'imaging disegnati a mano.
4. Recupero e Re-Imaging
- Rimuovere il dispositivo head-montaggio applicando una trazione mentre si tiene il cranio sotto. Se la colla rimane attaccato al cranio o la pelle, raschiare fuori con attenzione con una pinza sottile. Suturare la cute e posizionare il mouse in una gabbia riscaldata per monitorare il recupero dall'anestesia prima di tornare alla gabbia a casa. Applicare crema antibiotica topica alla sutura e iniettare ketoprofene (2,5 mg / kg) IP i seguenti 2 giorni.
- Ripetere i passaggi 1,1-2,5 per le sessioni di imaging ripetuti. Se necessario, radere l'osso con una lama microchirurgica per garantire la qualità ottimale dell'immagine.
NOTA: assottigliamento supplementare con il trapano dentale può essere necessaria quando l'intervallo tra le sessioni di imaging è più di un mese. - Posizionare il mouse sotto il microscopio a luce epifluorescente secondo la mappa 2D del sistema vascolare piale preso dalla sessione precedente (punto 3.6).
- Inizia scansione laser a due fotoni e regolare palco microscopio per raggiungere l'allineamento su scala micrometrica utilizzando la mappa 3D ottenuto nel passaggio 3.4. Procedere al immagini dettagliate come descritto al punto 3.5.
5. post-acquisizione tridimensionale ricostruzione e Image Analysis
- Ottenere ricostruzioni tridimensionali del sistema vascolare e le deposizioni amiloide utilizzando il software di analisi delle immagini 3D, come Imaris (versione usata 8.0 e 7.7.2).
- Utilizzare il plug strato Normalize dal menu di elaborazione delle immagini e il cambiamento sottomenu contrasto per ottenere contrasto ideale dei due canali in tutta la profondità della pila.
- Aprire le immagini dalla stessa regione in tutti i tempi e allo stesso tempo sempre elaborarli in parallelo al fine di confrontare i diversi punti di tempo.
- vasi traccia utilizzando il modulo filamento tracciante.
- Fare clic sull'icona del filamento di creare un nuovo filamento, salta il tracciante automatico e scegliere il metodo di auto-percorso.
- Assicurarsi che il canale selezionato corrisponde all'immagine vascolare e utilizzando la funzione di selezione del puntatore, cliccare una biforcazione vaso che si conserva attraverso le sessioni di imaging Tenendo premuti i tasti Maiusc + Ctrl per stabilire un punto di partenza. Utilizzare la funzione di selezione del puntatore e fare clic tenendo premuto il tasto shift per selezionare i punti finali dei filamenti.
NOTA: Il confronto del ottescheletri NED mostreranno cambiamenti strutturali del sistema vascolare.
- Eseguire piano dall'analisi aereo per tracciare nuove placche. Applicare modulo di superficie per il canale blu per il monitoraggio della crescita delle placche Ap. Fare clic sull'icona di superficie per creare una nuova superficie e procedere con la creazione di superfici automatizzato. Utilizzare il metodo soglia per impostare e sottrarre il segnale di fondo. Il menu delle statistiche fornisce dati relativi alla superficie dei singoli depositi di amiloide.
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Risultati
Questo protocollo descrive un metodo per la visualizzazione del cerebrovasculature e depositi di amiloide straordinari. Coloranti fluorescenti sono state iniettate per etichettare deposizioni amiloide (metossi-XO4) 11 e per riempire il lume cerebrovascolari (FITC-destrano) 1. I moduli software di analisi delle immagini in 3D sono stati usati per creare immagini in 3D di un campo costante di vista catturati in momenti successivi. Immagini rappresentative ottenute nel...
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Discussione
La tecnica aperta cranio in vivo microscopia a due fotoni offre il vantaggio di sessioni di imaging illimitate di grandi campi di imaging 13,14. Tuttavia, questa tecnica produce anche infiammazione nella regione di interesse 14, spesso incompatibili o impatto neuro-vascolari read-outs 15. Al contrario, la tecnica cranio transcranial assottigliata non comporti neuro-infiammazione, permettendo l'imaging affidabile delle strutture cerebrovascolari e accumulo di placca 10,1...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Gli autori vorrebbero riconoscere la Ligue Francaise contre l'épilepsie (a MA-L), Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale di Grant AVENIR R12087FS (a FJ), concedere presso l'Università di Montpellier (a FJ) e Grant dalla Federazione pour la Recherche sur le Cerveau (a NM). Riconosciamo l'assistenza tecnica di Chrystel Lafont al IPAM in impianto piattaforma di base imaging in vivo di Montpellier. Ringraziamo anche Mary Vernov (Weill Cornell Medical College) per la correzione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| metossi-X04 | tocris | 4920 | uso 10 mg/kg |
| FITC-Dextran 70 Kda | sigma | 46945 | uso 100 mg/kg |
| gelfoam/Bloxang | Bausch e Lomb | ||
| lama micorchirurgica | surgistar | 6900 | deve essere affilato e non ammaccato |
| povidone-iodio | betadine | soluzione antiscettica | |
| binoculare stereomicroscopio | olympus | SX10 | contrasto ottimale dell'immagine è fondamentale per questa procedura |
| microscopio a 2 fotoni | zeiss Zeiss | LSM 710mp | |
| forbici fini-toughcut | Strumenti per la scienza fine | 14058-09 | queste forbici sono ottimizzate per il taglio della pelle e dei tessuti molli |
Riferimenti
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