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Articolo metodologico

Etichettatura di cancro al seno xenotrapianti derivati ​​da pazienti con tracciabili Reporter per crescita tumorale e metastasi Studi

11.4K visualizzazioni

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DOI:

10.3791/54944

⸱

30 novembre 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, School of Medicine, University of Colorado Anschutz Medical Campus

In questo articolo

Sommario

Descriviamo un metodo per l'etichettatura stabile di xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) con particelle lentivirali che esprimono proteina fluorescente verde e reporter di luciferasi. Questo metodo consente di monitorare la crescita dei PDX nel sito primario, nonché di rilevare metastasi spontanee e sperimentali utilizzando sistemi di imaging in vivo.

Abstract

L'uso di modelli preclinici per studiare la biologia dei tumori e la risposta al trattamento è fondamentale per la ricerca sul cancro. Le linee cellulari umane di lunga data e molti modelli murini transgenici spesso non riescono a ricapitolare gli aspetti chiave delle neoplasie maligne umane. Pertanto, si stanno sviluppando modelli alternativi che rappresentano meglio l'eterogeneità dei tumori dei pazienti e delle loro metastasi. I modelli di xenotrapianto derivati da pazienti (PDX) in cui campioni tumorali resecati chirurgicamente vengono innestati in topi immunocompromessi sono diventati un'alternativa interessante in quanto possono essere trapiantati attraverso più generazioni e riflettono in modo più efficiente l'eterogeneità del tumore rispetto agli xenotrapianti derivati da linee cellulari tumorali umane. Una limitazione all'uso dei PDX è che sono difficili da trasfettare o trasdurre per introdurre reporter tracciabili o per manipolare l'espressione genica. L'attuale protocollo descrive i metodi per trasdurre cellule tumorali dissociate da PDX con un'elevata efficienza di trasduzione e l'uso di PDX marcati per modelli sperimentali di metastasi del cancro al seno. Il protocollo dimostra anche l'uso di PDX marcate in modelli sperimentali di metastasi per studiare il processo di colonizzazione degli organi della cascata metastatica. Le metastasi in diversi organi possono essere facilmente visualizzate e quantificate utilizzando l'imaging bioluminescente in animali vivi o l'espressione di GFP durante la dissezione e negli organi asportati. Questi metodi forniscono un potente strumento per estendere l'uso di più tipi di PDX alla ricerca sulle metastasi.

Introduzione

Lo sviluppo di xenotrapianti derivati da pazienti tumorali (PDXs), in cui i campioni di tumore chirurgicamente asportati vengono innestati direttamente in topi immuno-compromessi, offre diversi vantaggi rispetto ai modelli di xenotrapianto di cellule-linea standard e rappresenta un importante passo avanti nella ricerca sul cancro 1,2. PDXs possono essere mantenuti e ampliati con passaggi successivi con minima alterazione delle caratteristiche genetiche e biologiche del tumore coltivate nel primo passaggio; e riflettere più accuratamente l'eterogeneità del tumore di xenotrapianti derivate da linee cellulari tumorali umane 3-8. Questi modelli sono ora ampiamente utilizzate come piattaforma per la personalizzazione cancro terapeutica 9,10, come piattaforma preclinico nello sviluppo di farmaci 6,11 e come uno strumento sperimentale per lo studio della biologia del cancro 4,12.

La maggior parte dei PDXs vengono impiantati e propagate per via sottocutanea, che permette di tenerne la misurazione della crescita tumorale nel tempo utilizzando pinze. però, La malattia metastatica è stato più difficile da modellare con PDXs. In particolare per il cancro al seno, xenotrapianti con capacità metastatica a diversi organi sono stati descritti 3,5,13, ma la frequenza di diffusione spontanea di siti metastatici è estremamente bassa. Dove riportato, l'identificazione e la quantificazione degli oneri si basa metastatico in esame istologico laboriosa degli organi bersaglio post-mortem. linee cellulari di cancro che esprimono bioluminescente (luciferasi, Luc) o fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP) reporter gene sono comunemente utilizzati in modelli sperimentali di metastasi del cancro al seno a cervello, polmoni, ossa e il fegato dopo intracardiaca, la coda-venosa, intrafemoral e iniezione milza 14-16. Anche se questi modelli bypassare diffusione dei tumori primari, che sono preziosi per studiare i meccanismi di tropismo d'organo e di colonizzazione metastatica. Tuttavia, le cellule derivate da tumori di pazienti primari e PDXs possono avere bassi tassi di trasfezione o trasduzione using procedure standard. Una alternativa è quella di stabilire linee cellulari derivate PDX-17 in vitro, che può essere poi etichettati utilizzando protocolli di coltura dei tessuti convenzionali. Questo approccio tuttavia, non è adatto per l'etichettatura maggior PDXs, per cui linea cellulare derivazione è difficile e può modificare il fenotipo delle cellule. Qui vi presentiamo un protocollo per la trasduzione di cellule tumorali PDX-dissociate con vettori lentivirali adatti per l'imaging in vivo. Inoltre, descriviamo metastasi sperimentale con iniezione intracardiaca delle cellule dissociate PDX luc-GFP etichettati in topi immunocompromessi.

Un protocollo di base per la trasduzione di organoidi PDX-dissociate con gene reporter che esprime lentivirus è stato descritto in precedenza 18. Nel protocollo corrente si descrivono metodi aggiuntivi per arricchire per le cellule tumorali umane ed ottenere vicino efficienza di trasduzione 100%, così come l'uso di PDXs etichettati per rilevare il cancro al seno sperimentalemetastasi. Questo protocollo può essere adattato per l'etichettatura più tipi di cancro di PDXs con vari marcatori luminescenti e fluorescenti e la modulazione dell'espressione genica (cioè, shRNA knockdown di geni di interesse).

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Protocollo

Tutte le fasi che richiedono l'uso di animali in questo protocollo seguono le linee guida del comitato etico per la ricerca sugli animali dell'Università del Colorado (IACUC).

1. Preparazione di strumenti, terreni di coltura e altri reagenti

  1. Preparare un terreno mammoferico da 100 ml contenente il terreno Eagle modificato di Dulbecco e il terreno F-12 di Han (DMEM/F12) (1:1), il fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF, 20 ng/ml), il fattore di crescita epidermico (EGF, 10 ng/ml), l'eparina (4 μg/ml), 1x B27, la penicillina (100 U/ml), la streptomicina (100 μg/ml). Preparare il terreno in condizioni sterili e conservarlo a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
  2. Preparare un tampone per l'arricchimento epiteliale (EEB) contenente PBS pH 7,2, 0,5% di albumina sierica bovina (BSA), 2 mM EDTA. Filtrare, sterilizzare e conservare a 4 °C per un massimo di 6 mesi.
  3. Preparare 5 ml di aliquote di tampone digestivo in provette coniche sterili da 15 ml e conservare a -20 °C per mesi. La sera prima della digestione del tumore, scongelare il tampone di digestione (5 ml per 500 mg di tumore) con ghiaccio, a 4 °C. Aggiungere 1x miscela antibiotico-antimicotica prima dell'uso.
  4. Autoclave (121 °C per 30 min) con almeno due pinze, bisturi e forbici per la dissezione dei PDX.
  5. Preparare 500 ml di tampone di lavaggio contenente DMEM:F12 e 5% di siero fetale bovino (FBS). Conservare a 4 °C per mesi. Aliquotare 10 ml per tumore il giorno della dissezione del tumore.
  6. Preparare un brodo di polibrene a 4 μg/μl con acqua sterile. Filtrare e aliquotare in provette da microcentrifuga da 1,5 ml contenenti 100 μl ciascuna, conservare a -20 °C.

2. Generazione di particelle lentivirali ad alto titolo che trasportano marcatori tracciabili

  1. Acquistare o generare particelle lentivirali ad alto titolo che trasportano un gene reporter (ad esempio, GFP e Luc per il monitoraggio in vivo della crescita tumorale) 18,19.
    NOTA: Per il successo della trasduzione dei PDX si raccomanda un titolo lentivirale di >10 8 TU/ml (unità di trasduzione per millilitro). Le particelle lentivirali devono essere pseudotipizzate con una glicoproteina G dell'involucro del virus della stomatite vescicolare (VSV-G), consentendo la trasduzione di un'ampia varietà di cellule di mammifero><. NOTA: Il protocollo qui utilizzato per la generazione e la titolazione di particelle lentivirali ad alto titolo è disponibile all'indirizzo www.kottonlab.com. I vettori utilizzati in questo protocollo sono pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro e il doppio promotore pHAGE-EF1aL-luciferasi-UBC-GFP-W. Questo vettore è stato generato sostituendo dsRed con il gene della luciferasi a valle del promotore EF1aL nel vettore pHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W, un gentile dono di Darrell Kotton, Boston University.

3. Generazione di xenotrapianti derivati da pazienti

  1. Generare xenotrapianti derivati da pazienti (PDX) da carcinoma mammario impiantando tumori mammari primari o metastatici nel cuscinetto adiposo mammario di topi immunocompromessi3,4. Generare tumori con una dimensione massima raccomandata di 1 cm di diametro poiché è probabile che i tumori più grandi contengano nuclei necrotici.
    NOTA: Metodi dettagliati per l'insediamento e il trapianto di xenotrapianti sono descritti in DeRose et al. 18. La crescita di PDX trapiantabili in tumori > 1 cm di diametro richiede tra le 4 e le 24 settimane dopo l'impianto in NOD/SCID/ILIIrg-/- (NSG) immunocompromessi, a seconda dei tassi di crescita intrinseci del tumore. Sebbene questo protocollo descriva la trasduzione dei PDX del cancro al seno, può essere utilizzato per la trasduzione virale di qualsiasi tumore adatto al passaggio in vitro a breve termine. La sensibilità dei PDX alla sopravvivenza in vitro a breve termine (24 - 96 ore) è intrinseca a ciascun tumore e deve essere determinata sperimentalmente.

4. Dissezione tumorale e dissociazione di cellule tumorali derivate da PDX

  1. Eutanasia dei topi portatori di PDX utilizzando l'inalazione di CO2 seguita da lussazione cervicale (seguire le linee guida istituzionali del comitato etico per la ricerca animale). Immergere i topi in una soluzione di clorexidina allo 0,2% per 1 minuto. Posiziona il mouse in posizione supina sopra una tavola di dissezione e usa i perni per fissare gli arti superiori e inferiori estesi alla tavola.
  2. Usando una tecnica asettica, usa un bisturi per tagliare la pelle intorno al tumore. Tirare la pelle con una serie di pinze e separarla dal tumore usando un bisturi pulito fino a quando il tumore non è completamente esposto. Utilizzando una pinza e un bisturi puliti, rimuovere il tumore e metterlo in 5 ml di terreno di lavaggio su ghiaccio.
  3. Portare il tumore sezionato in un armadio BLS2 per un'ulteriore elaborazione. Rimuovere il terreno e sciacquare il tumore con 10 ml di Hank's Balanced Salt Sodium Modified with 10 mM Hepes (HBSS/Hepes), due volte.
  4. Immergere il tumore in una piastra sterile pre-pesata di coltura tissutale da 60 cm. Pesare la piastra contenente il tumore per stimare la massa tumorale.
  5. Usando un bisturi, tagliare il tumore a metà, quindi tagliare un disco di 3 mm da una metà e metterlo in un contenitore con il 10% di formalina per 24 ore. Utilizzare questo tessuto per verificare l'eterogeneità del campione tumorale (PDX parentale). Aggiungere 200 μl di HBSS/Hepes (sufficienti per evitare che il tessuto si secchi) e tritare il tumore rimanente nei pezzi più piccoli possibili utilizzando una pinza e un bisturi pulito.
  6. Trasferire il tumore tritato in una provetta conica sterile da 50 ml. Aggiungere almeno 1 ml di tampone digestivo contenente 1x antibiotico antimicotico per 100 mg di tumore.
    NOTA: L'aggiunta di antibiotici/antimicotici previene la contaminazione delle cellule tumorali in vitro.
  7. Digerire il tumore per 3 ore a 30 °C, agitando a 125 - 200 giri/min.
    NOTA: L'aumento della temperatura fino a 37 °C aumenta l'efficienza della digestione (più singole cellule nel tempo) ma di solito è accompagnato da un aumento della morte cellulare. Per la maggior parte dei tumori, la digestione a 30 °C per 3 ore produce un numero sufficiente di cellule dissociate vitali per procedere alla fase di marcatura.
  8. Interrompere la digestione aggiungendo 35 ml di terreno di lavaggio (DMEM/F12 con il 5% di FBS). Filtrare attraverso una rete di nylon da 70 μm in un tubo conico pulito da 50 ml per rimuovere il tessuto non digerito. Centrifugare il terreno filtrato contenente cellule digerite a 400 x g per 5 minuti.
  9. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di tampone di lisi dei globuli rossi. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
  10. Aggiungere 10 ml di tampone di lavaggio (DMEM:F12, 5% FBS) per interrompere la lisi. Far passare le celle attraverso una rete di nylon da 40 μM per rimuovere i grumi. Centrifugare a 400 x g per 5 min e rimuovere il surnatante, mettere sul ghiaccio.
  11. Risospendere le cellule digerite in 5 ml di tampone di lavaggio e contare sia le cellule vitali che quelle non vitali utilizzando l'esclusione del blu di tripano. In breve, miscelare 50 μl di cellule e 50 μl di blu di tripano e contare il tripano-blu escluse le cellule utilizzando un emocitometro.
    NOTA: Questo prodotto per la digestione grezza conterrà cellule tumorali umane derivate dal PDX, nonché cellule stromali di topo (fibroblasti, cellule del sangue, ecc.). Le cellule digerite possono ora essere processate per la marcatura (fase 6), oppure le cellule tumorali umane possono essere arricchite utilizzando una delle procedure descritte in Rif. 5.

5. Arricchimento di cellule tumorali epiteliali umane

  1. Esaurire le cellule stromali di topo utilizzando un kit per la deplezione delle cellule di linea (Lin+)20.
    NOTA: Raccomandato per tumori altamente vascolarizzati e/o tumori con alto contenuto stromale in cui l'espressione di EpCAM è sconosciuta o persa).
    1. Prelevare fino a10-7 cellule vitali in una provetta di polipropilene pulita da 5 ml, aggiungere 2 ml di EEB e centrifugare a 300 x g per 5 minuti. Pipettare completamente il surnatante.
    2. Pellet di risospensione in 40 μl di EEB ghiacciato per 107 cellule.
    3. Aggiungere 10 μl di cocktail di biotina-anticorpi per 10-7 cellule, mescolare pipettando delicatamente e incubare a 4 °C per 10 minuti (il cocktail contiene anticorpi contro le cellule di topo Lin+).
    4. Aggiungere 30 μl di EEB freddo per 107 cellule, mescolare pipettando delicatamente.
    5. Aggiungere 20 μl di microsfere anti-biotina per 107 cellule, mescolare pipettando delicatamente e incubare a 4 °C per 15 minuti.
    6. Lavare le celle con 3 ml di EEB freddo, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare accuratamente il surnatante. Risospendere il pellet in 500 μl di EEB e metterlo su ghiaccio.
    7. Posizionare la colonna nel campo magnetico di un separatore magnetico. Sciacquare la colonna con 0,5 ml di tampone per arricchimento epiteliale e lasciarlo gocciolare. Non lasciare che la colonna si asciughi.
    8. Posizionare una nuova provetta di raccolta in polipropilene sotto la colonna. Lentamente, aggiungere i 500 μl contenenti le cellule marcate sulla colonna (le cellule marcate con Lin+ verranno trattenute nella colonna magnetica). Raccogliere l'effluente come frazione con cellule non marcate, che rappresentano la frazione di cellule negative (tumore) di lignaggio arricchito.
    9. Sciacquare la colonna 3 volte con 500 μl di EBB e raccogliere l'effluente nella stessa provetta dell'effluente del passaggio 5.1.8. Mantenere l'effluente sul ghiaccio e procedere alla fase di etichettatura (6).
    10. Opzionale: portare la colonna al di fuori del campo magnetico. Posizionare una nuova provetta in polipropilene sotto ed eluire la frazione LIN+ aggiungendo 500 μl di EEB, tre volte e utilizzando lo stantuffo in dotazione.
  2. Arricchimento di cellule tumorali epiteliali umane EpCAM+ (raccomandato per tumori noti per esprimere CD326+ e contenere un alto contenuto stromale di topo).
    1. Prelevare fino a10-7 cellule vitali in una provetta di polipropilene pulita da 5 ml, aggiungere 2 ml di EEB freddo e centrifugare a 300 x g per 5 minuti. Pipettare completamente il surnatante.
    2. Pellet di risospensione in 60 μl di EBB ghiacciato per 107 cellule.
    3. Aggiungere 20 μl di microsfere EpCAM per 10-7 cellule, mescolare pipettando delicatamente e incubare a 4 °C per 30 minuti.
    4. Lavare le celle con 3 ml di EEB freddo, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Aspirare accuratamente il surnatante. Risospendere il pellet in 500 μl di EEB e mettere in ghiaccio.
    5. Posizionare la colonna nel campo magnetico di un mini separatore. Sciacquare la colonna con 0,5 ml di EEB e lasciarla sgocciolare. Non lasciare che la colonna si asciughi.
    6. Posizionare una nuova provetta di raccolta in polipropilene sotto la colonna. Lentamente, aggiungere i 500 μl contenenti le cellule marcate sulla colonna (le celle marcate con EpCAM+ verranno trattenute nella colonna magnetica). Raccogliere l'effluente come frazione con cellule non marcate, che rappresentano le cellule stromali di topo.
    7. Sciacquare la colonna 4 volte con 500 μl di tampone ME e raccogliere l'effluente nella stessa provetta dell'effluente della fase 5.1.8.
    8. Portare la colonna al di fuori del campo magnetico. Posizionare una nuova provetta in polipropilene sotto ed eluire la frazione EpCAM+ aggiungendo 500 μl di tampone ME, tre volte. Lavare le celle marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna. Raccogliere gli effluenti contenenti la frazione di cellule tumorali arricchita di EpCAM+ e mantenerli in ghiaccio. Procedere al passaggio 6.

6. Trasduzione di cellule tumorali derivate da PDX

  1. Centrifugare le cellule tumorali dissociate a 300 g x 5 min e risospendere in 2 ml di terreno mammosferico. Contare le cellule vitali utilizzando l'esclusione del blu di tripano come in 4.11.
  2. Preparare 10 ml di terreno mammostatico contenente 8 μg/ml di polibrene (2 μl di polibrene madre per ml di terreno).
  3. Determinare il volume necessario per 2 x 105 cellule tumorali vitali. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti e risospendere il pellet in 2 ml di terreno contenente polibrene. Piastra 2 x 105 cellule tumorali vitali per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti a bassissima aderenza.
    NOTA: Questo è il numero ottimale di cellule necessarie per la trasduzione con un vettore lentivirale.
    cautela! Le particelle lentivirali e tutti i materiali di consumo utilizzati con le particelle lentivirali devono essere maneggiati seguendo le procedure istituzionali per i rischi biologici del DNA ricombinante><. NOTA: La trasduzione lentivirale delle cellule mammarie primarie favorisce fortemente le cellule mioepiteliali che possono portare a una scarsa marcatura delle cellule luminali e alla selezione di sottopopolazioni di cellule tumorali durante la marcatura21.
  4. Incubare il virus con 200 mU/ml di neuraminidasi a 37 °C per 1 ora prima della trasduzione per aumentare il legame delle particelle virali a diverse sottopopolazioni di cellule primarie e correggere questa potenziale distorsione21.
  5. Aggiungere particelle lentivirali a 10 MOI (2 x 106 TU per 2 x 105 cellule vitali) se le cellule dissociate da PDX vengono esaurite da cellule di topo Lin+ o arricchite in cellule EpCam+. Aggiungere particelle lentivirali a 30 MOI (6 x 106 TU per 2 x 105 cellule vitali) se si utilizzano cellule dissociate PDX non arricchite.
    NOTA: L'aumento del MOI consente una trasduzione efficiente anche in presenza di grandi quantità di detriti e cellule morte negli estratti grezzi. Conservarne uno con cellule non marcate per fungere da controllo della vitalità e dell'efficienza di trasduzione.
  6. Agitare per mescolare il virus con le cellule. Incubare a 37 °C, 5% CO2 per un massimo di 96 ore. Aggiungere 500 μl di terreno mammostatico fresco 24 ore dopo la trasfezione. Le cellule non si attaccano alle piastre, non aspirano i mezzi.

7. Valutazione dell'efficienza di trasduzione e del reimpianto di cellule marcate in topi immunocompromessi

  1. Monitorare l'espressione del marcatore tracciabile (GFP) ogni 24 ore utilizzando un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 10X.
    NOTA: L'espressione di GFP può essere osservata già 24 ore dopo l'infezione, ma nella maggior parte dei PDX l'espressione di GFP è chiaramente visibile dopo 72 ore (Figura 1).
  2. Stimare l'efficienza della trasduzione valutando la percentuale di cellule GFP+ all'interno del pozzetto totale.
    NOTA: Poiché le colture contengono cellule tumorali, cellule stromali residue e cellule morte a vari livelli, in un topo ospite possono essere impiantati pozzetti con un minimo del 10% di cellule GFP+.
  3. Trasferire le cellule trasdotte da piastre a 6 pozzetti in una provetta conica da 15 ml. Aggiungere 1 ml di terreno mammostatico al pozzetto per raccogliere tutte le cellule rimaste. Mettere sul ghiaccio.
  4. Aggiungere 10 ml di HBSS/hepes alle cellule trasdotte e centrifugare a 300 x g per 5 min, 4 °C. Aspirare con cautela il surnatante e risospendere in 50 μl di estratto della matrice basale (BME) su ghiaccio.
    NOTA: Le aliquote BME devono essere scongelate con ghiaccio, 1 - 2 ore prima dell'uso. Il BME si solidificherà a temperatura ambiente; Rimani sempre sul ghiaccio.
  5. Caricare le cellule incorporate in BME in una siringa da insulina da 0,5 ml, tenerle in ghiaccio e portarle alla struttura per animali per il reimpianto nei topi NSG.
  6. Anestetizzare topi NSG femmina di 4-8 settimane, utilizzando isoflurano al 5%, ossigeno al 95% per 5 minuti, seguito da isoflurano al 2%, ossigeno al 98% o secondo il protocollo approvato dall'etica della ricerca animale.
  7. Quando l'animale non risponde agli stimoli dolorosi (pizzicamento delle dita), pulire l'area di iniezione con betadina seguita da salviette all'etanolo e iniettare i 50 μl di cellule nel 4° cuscinetto adiposo mammario. Fornire ai topi analgesia per alleviare il disagio dell'iniezione come indicato nel protocollo approvato.
  8. Consentire alle cellule di formare tumori (2 - 12 settimane) e monitorare l'attività della GFP e/o della luciferasi utilizzando un sistema di luce sintonizzabile e/o un sistema di imaging della luciferasi in vivo (Figura 2).
    NOTA: Seguire le linee guida per l'anestesia, l'analgesia, le misurazioni del carico tumorale e i criteri di eutanasia approvati dal comitato etico istituzionale per la ricerca sugli animali.

8. Controllo di qualità dei PDX etichettati

  1. Determinare l'efficienza della marcatura valutando l'espressione della luciferasi e della GFP nei tumori marcati.
    NOTA: Seguire le procedure approvate dal comitato etico per la ricerca animale istituzionale per l'imaging in bioluminescenza in vivo (Figure 2, 3).
    1. Sezionare i tumori da topi soppressi quando le dimensioni del tumore hanno raggiunto 1,0 - 1,5 cm di diametro (o prima secondo i protocolli approvati, come descritto in 4). La dissezione deve essere eseguita con un sistema a luce sintonizzabile (o un sistema equivalente che consenta la valutazione della fluorescenza GFP).
    2. Da ciascun tumore, stimare qualitativamente la percentuale di tumore GFP+ utilizzando la microscopia. Se inferiore al 100%, sezionare solo la porzione GFP+. Sezionare un disco da 3 mm e fissarlo in formalina al 10% per l'inclusione di paraffina e l'analisi istologica, conservare un piccolo pezzo per l'RNA o altre analisi desiderate e conservare la maggior parte possibile del tumore in singole provette criogeniche da 1,5 ml contenenti il 90% di FBS/10% di DMSO per la crioconservazione.
  2. Reimpiantare pezzi di tumore marcato in nuovi topi NSGriceventi 18 per espanderli e utilizzarli in studi sperimentali di metastasi.
  3. Eseguire la colorazione immunoistochimica standard del tessuto incluso in paraffina ottenuto da tumori prima della trasduzione e ad ogni generazione successiva per verificare che i PDX marcati rimangano istologicamente simili ai PDX originali.
    NOTA: I marcatori utilizzati per il controllo qualità variano a seconda dei PDX. Per il carcinoma mammario PDX, l'espressione del recettore degli estrogeni, del recettore del progesterone, del recettore del fattore di crescita epidermico 2 (HER2), del recettore del fattore di crescita epidermico 1 (HER1 o EGFR), della pan-citocheratina (pan-CK) sono raccomandati per lo screening iniziale.

9. Modelli sperimentali di metastasi con PDX marcati

  1. Seguendo i passaggi descritti nella sezione 4, dissociare le cellule tumorali da un PDX marcato. Se il tumore è altamente vascolarizzato o ricco di stroma di topo, eseguire l'arricchimento delle cellule tumorali come descritto in 4.5 o 4.6.
  2. Contare le cellule vitali utilizzando l'esclusione del blu di tripano e diluire 250.000 cellule in 100 μl di PBS (Ca2+, Mg2+ libero) per topi. Mantieni le celle sul ghiaccio. Per l'iniezione di più topi, regolare i numeri di conseguenza (e preparare un eccesso di almeno un'iniezione in più per tenere conto degli errori di pipettaggio).
  3. Portare le cellule su ghiaccio nell'apposita sala operatoria per animali e procedere all'iniezione intracardiaca secondo il protocollo IACUC approvato.
    NOTA: Protocolli dettagliati per l'iniezione intracardiaca di cellule tumorali sono stati descritti altrove22,23.
  4. Traccia e quantifica la diffusione metastatica nel tempo utilizzando l'imaging bioluminescente. Visualizzare le metastasi macroscopiche in diversi organi utilizzando la bioluminescenza e/o l'imaging GFP di organi isolati alla necroscopia24 (Figura 6).

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Risultati

Questo metodo descrive la trasduzione di cellule tumorali del seno dissociate da PDX mediante vettori lentivirali ad alto titolo pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro e pHAGE-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Questi vettori esprimono un marcatore fluorescente che consente di stimare l'efficienza di trasduzione in vitro, già 24 ore dopo l'infezione (Figura 1a). Per la maggior parte dei PDX, l'espressione di GFP sarà ritardata fino a 72 ore dopo l'infezione (Figura 1b

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Discussione

Passaggi critici all'interno del protocollo:

L'uso di particelle lentivirali ad alto titolo (>108 TU/ml) è un passo fondamentale per il successo di questo protocollo, in quanto consente un attento controllo della composizione del terreno durante la trasduzione in vitro . Mentre sono stati ben descritti diversi metodi per la produzione di particelle virali ad alto titolo18,19; Questo protocollo utilizza particelle lentivirali prodotte come descrit...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Dr. Darrel Kotton della Boston University per aver fornito il vettore pHAGE-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W e i protocolli per la produzione di lentivirali ad alto titolo utilizzati in questi studi. Questo lavoro è stato finanziato da DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) e R01 CA140985 (CAS). La sovvenzione dell'NCI P30CA046934 Center ha sostenuto l'imaging in vivo e i nuclei di coltura tissutale presso l'Università del Colorado AMC.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
DMEM/F12 (1:1)HycloneSH30023.01
bFGFBD Biosciences354060
EGFBD Biosciences354001
EparinaSigmaH4784
B27Gibco/Thermo Fisher17504-44
Anti-funghi-antibioticiHycloneSV30010
AccumaxInnovative Cell TechnologiesAM-105-500Tampone di digestione
FBSAtlanta BiologicalsS11550
HBSS Rosso Ca2+/Mg2+ liberoHycloneSH30031.02
Hepes
10x PBSHycloneSH30258.01
CultrexCultrex3433-005-01Estratto di matrice basamentale (BME)
30 ° Agitatore a CNewBrunswick Scientific CO. INCSerie 25 Agitatore
70 μ m filtriFalconbisturi 7352350
Fisher22079690
Disinfettante alla clorexidinaDurvetNDC# 30798-624-35
Reagente per lisi cellulare del sangue rossoSigmaR7757
NeuraminidasiSigmaN7885-1UN
EpCAM (CD326+) microsfere*Miltenyil Biotec130-061-101
Kit di deplezione delle cellule di lignaggio, topo*Miltenyil Biotec130-090-858
Separatore MiniMACS Miltenyil Biotec130-042-102
Mini MACS Supporto magneticoMiltenyil Biotec130-042-303
Colonne MS ÈMiltenyil Biotec130-042-201MS o LS, regolare in base al numero di celle.
Illumatool Sistema di luce sintonizzabileLightools researchVariPer l'imaging a fluorescenza in vivo
Dispositivo di imaging IVIS200 xenogenoXenogeno VariPer l'imaging della luminiscenza in vivo
Clone di citocheratina umana MNF116 Anticorpo monoclonaleDAKOM0821Pan-citocheratina 
Anticorpo del recettore del fattore di crescita epidermicoSegnalazione cellulare4267SEGFR
per incubatrici possibile utilizzare colonne

Riferimenti

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