Articolo metodologico

Cultura della murini embrionali Metatarso: Un modello fisiologico di endocondrale Ossificazione

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DOI:

10.3791/54978

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3 dicembre 2016

 ,  ,  , 
1Developmental Biology, The Roslin Institute and R(D)SVS, The University of Edinburgh

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Presentiamo un protocollo per sezionare e coltivare ossa metatarsali murine embrionali del giorno 15 (E15). Questo modello ex vivo altamente fisiologico di ossificazione endocondrale fornisce condizioni più vicine alla situazione in vivo rispetto alle cellule in monostrato o in coltura 3D ed è uno strumento vitale per studiare la crescita e lo sviluppo osseo.

Abstract

Il processo fondamentale dell'ossificazione endocondrale è sotto stretta regolamentazione nell'individuo sano in modo da prevenire lo sviluppo disturbato e/o la crescita ossea longitudinale. Pertanto, è imperativo approfondire la nostra comprensione dei meccanismi molecolari alla base di tali disturbi in modo da fornire progressi verso il beneficio per i pazienti umani e animali. La coltura di espiantazione di organi metatarsali di topo è un modello ex vivo altamente fisiologico per lo studio dell'ossificazione endocondrale e della crescita ossea poiché il tasso di crescita delle ossa in coltura imita quello osservato in vivo. In modo univoco, la coltura di organi metatarsali consente l'esame dei condrociti in diverse fasi della condrogenesi e mantiene le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice, fornendo quindi condizioni più vicine alla situazione in vivo rispetto alle cellule in monostrato o in coltura 3D. Questo protocollo descrive in dettaglio l'intricata dissezione dei metatarsi embrionali dall'arto posteriore di embrioni murini E15 e le successive analisi che possono essere eseguite per esaminare l'ossificazione endocondrale e la crescita ossea longitudinale.

Introduzione

Lo scheletro è un organo altamente complessa, dinamica e complessa che ha una gamma di funzioni che vanno dalla locomozione, per l'omeostasi di ioni. Composto da ossa e cartilagine, lo scheletro è costituito da popolazioni di cellule funzionalmente distinte che operano per mantenere la propria integrità strutturale, biochimico e meccanica 1. Una delle funzioni primarie dello scheletro è il suo ruolo nello sviluppo e crescita. Questi processi richiedono l'orchestrazione di molteplici popolazioni cellulari che sono regolati attraverso endocrino stretto e controllo genetico.

Con l'eccezione della ossa piatte es scapola, cranio e dello sterno, lo scheletro dei mammiferi è formata attraverso il processo noto come encondrale. Questo processo, regolato sia molecolarmente e spazialmente, inizia con la condensazione di cellule mesenchimali derivate principalmente dal mesoderma 2. Sotto l'influenza del fattore di trascrizione SOX9, cellule in the all'interno degli condensazioni differenziarsi in condrociti, esprimere e secernere componenti cartilagine specifiche matrice extracellulare (ECM) come collagene di tipo II e aggrecano. Le cellule al margine della condensazione, esprimono collagene di tipo I e formo la pericondrio, delineando la prospettiva osso 3. Più tardi, i osteoprogenitors del pericondrio differenziano in osteoblasti, diretto da l'espressione dei fattori di trascrizione, Runx2 e Osterix 4. Questo porta ad una predominanza di osteoblasti e questo strato viene rinominato periostio che forma un collare osseo mineralizzato intorno alla metà sezione dell'osso. La penetrazione vascolare del periostio e l'invasione del ponteggio cartilaginea avviene portando con sé, haematopoetically derivato cellule ossee riassorbimento, osteoclasti, che riassorbono i resti di condrociti e gran parte della matrice cartilaginea 5. Gli spazi formati sono riempiti da osteoprogenitors all'origine della ossificazione primariacentro che occupa progressivamente il nucleo della diafisi e si fonde con il periostio. Altre cellule danno origine al midollo osseo. Intorno nascita, vasi sanguigni e osteoprogenitors penetrano la matrice cartilaginea ricca su entrambi i lati (epifisi) della diafisi sviluppo per formare il centro di ossificazione secondario. Situato tra l'epifisi e diafisi alle due estremità delle ossa lunghe sono un gruppo di cartilagine - la cartilagine di accrescimento epifisaria - che è responsabile del coordinamento crescita lineare di tutte le ossa lunghe 6.

I condrociti all'interno della cartilagine di accrescimento inizialmente proliferano e successivamente progressi attraverso le zone morfologicamente distinte, coordinati da espressione sequenziale di fattori di trascrizione e di crescita. Il culmine di questa sequenza di eventi è l'uscita dal ciclo cellulare e l'ipertrofia dei condrociti al centro di questa cartilagine precursore. condrociti ipertrofici esprimono fortemente tipo X collagene e metalloproteinasi della matrice-13 (MMP13) e la loro notevole allargamento volume nella direzione della crescita longitudinale fornisce il maggior contributo alla crescita delle ossa nei mammiferi 7,8. Inoltre, condrociti ipertrofici mineralizzano loro ECM circostante attraverso il rilascio di vescicole matrice, strutture a membrana delimitata specializzati per la produzione di fosfato di calcio amorfo attraverso la loro inclusione di fosfatasi (tessuto non specifico fosfatasi alcalina (TNAP) e PHOSPHO1) e di calcio canalizzazione proteine ​​(annexins ) 9-11. Questa cartilagine calcificata è invasa da vasi sanguigni dal midollo sottostante con conseguente reclutamento degli osteoclasti e matrice di riassorbimento. Questa è seguita da migrazione degli osteoblasti e l'allineamento alla superficie dei resti cartilagine calcificata dove stabiliscono uno strato di osteoide che è rapidamente mineralizzato. Il tessuto osseo del spugnoso è poi ristrutturato per osso lamellare della spongiosa secondario 12. risultati di fusione epifisari nelcessazione di encondrale 13.

Encondrale è sotto stretta regolamentazione da molti ormoni endocrini e paracrini e fattori di crescita, in modo da prevenire lo sviluppo disturbato e / o la crescita delle ossa longitudinale 14. Una migliore comprensione dei meccanismi molecolari e cellulari alla base di questi processi è quindi indispensabile nella nostra ricerca di progressi clinici verso beneficio umano. Precedenti ricerche sulle somiglianze e le differenze tra le cartilagini di accrescimento di differenti età, luoghi e specie hanno notevolmente migliorato la nostra comprensione dei meccanismi fisiologici che circondano dinamiche cartilagine di accrescimento 15,16. Tuttavia, lo studio dei condrociti isolati è difficile, come la rimozione dei condrociti dal loro ambiente può portare a dedifferentiation, accompagnato da perdita di espressione di marcatori chiave come COL2A1 17.

Il mouse metatarso espianto di organi, pioneered dal Prof. Elisabeth Burger ei suoi colleghi nei Paesi Bassi, è un ex vivo modello altamente fisiologico per lo studio encondrale e la crescita delle ossa, come il tasso di crescita delle ossa nella cultura imitano quello visto in vivo 18. Unicamente, la cultura organo metatarso consente l'esame dei condrociti in diverse fasi di condrogenesi e mantiene cellula-cellula e cellula-matrice interazioni, fornendo quindi condizioni più prossime alla situazione in vivo di cellule in coltura 19-21. Inoltre, questo modello consente esame diretto della crescita ossea lineare che non è possibile in colture di condrociti primari. Esso permette anche la separazione dei fattori sistemici e locali permettendo quindi l'analisi specifica degli effetti locali sulla piastra di crescita.

La cultura del metatarsi permette lo studio di numerosi parametri. misurazioni giornaliere di lunghezza totale e delle regioni di mineralizzatii rudimenti possono essere eseguite con microscopio a contrasto di fase di serie e il software di analisi delle immagini. Istologica, ibridazione in situ e la colorazione immunoistochimica può essere facilmente eseguita su sezioni metatarsali, che permette la risoluzione spaziale di entrambe le entità cellulari e molecolari, un importante vantaggio rispetto ai metodi tradizionali di coltura cellulare. L'approccio immunoistochimica include il rilevamento e la quantificazione di 5-bromo-2'-deossiuridina (BrdU) assorbimento da proliferazione condrociti 22. Inoltre, ulteriore trattamento di tessuti metatarsali può essere effettuato per consentire un'analisi valle di mRNA (RT-qPCR), proteine ​​e analisi segnale intracellulare (Western blotting) o la composizione lipidica (spettrometria di massa). La maggior parte degli studi fino ad oggi utilizzano metatarsi embrionali in coltura piuttosto che metatarsi da animali post-natale. Mentre entrambi i modelli possono essere informativo, lo studio delle ossa embrionali ha diversi vantaggi: crescono più velocemente e può essere exploited per studiare l'inizio e la progressione del 23-25 processo di mineralizzazione.

Questo protocollo descrive in dettaglio la dissezione intricata di metatarsi embrionali dalla dell'arto posteriore di giorno embrionale 15 (E15) embrioni murini. Inoltre, viene mostrato la crescita e la mineralizzazione dei metatarsi anatomicamente distinte.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono stati condotti in conformità con gli animali del Regno Unito (Procedure Scientifiche) Act del 1986 e gli animali sono stati mantenuti in accordo con il Ministero dell'Interno pubblicato Codice di condotta per l'alloggiamento e la cura degli animali allevati, Fornito o utilizzati a fini scientifici.

NOTA: Gli esperimenti effettuati utilizzando wild-type C57Bl / 6J topi sono ben stabiliti e descritti di seguito. Metatarsi embrionali provenienti da diversi ceppi di topi possono allo stesso modo essere coltivate in vitro, anche se i loro tassi di crescita e di mineralizzazione possono essere diverse a quelle descritte nel presente documento.

1. dissezione Condizioni e preparazione degli strumenti

  1. Eseguire tutta la preparazione dei media, tessuti dissezioni e il lavoro della cultura in una cappa a flusso laminare per garantire la sterilità dei media e rudimenti embrionali.
  2. Consentire terreni di coltura e dissezione per equilibrare per almeno 1 ora a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore prima dell'uso.
  3. sterilizzare dissezioneforbici, Dumont # 5 e # 4 Dumont pinzette accanto a un paio di Superfine Vännäs micro forbici (8 cm rette, 3 mm lame) in autoclave. Dopo la sterilizzazione in autoclave, immergere l'apparecchiatura dissezione in etanolo al 70% prima dell'uso.

2. Preparazione di dissezione e di cultura dei media

  1. Preparare mezzo di dissezione
    1. Diluire media Essential α-minimo (senza nucleosidi, αMEM) in tampone fosfato (PBS) (1,13) e risospendere albumina sierica bovina (BSA) a 2 mg / m l prima filtro sterilizzante attraverso una siringa diametro di 0,22 micron, 33 millimetri filtro.
      NOTA: media dissezione può essere fatta, filtro sterilizzato e conservato in aliquote a -20 ° C a tempo indeterminato.
  2. Preparare terreno di coltura
    1. Cultura metatarsi embrionali in 300 ml di terreno di coltura (in ciascun pozzetto di una piastra di coltura da 24 pozzetti). Preparare il terreno di coltura con l'aggiunta di 0,2% w / v BSA; 5 ug / ml di L-ascofosfato acido di rbic; 1 mM β-glicerofosfato (βGP; opzionale - vedi sezione risultati); 0,05 mg / ml di gentamicina e 1,25 mg amfotericina B a αMEM e filtro sterilizzare attraverso un filtro di diametro siringa da 0,22 micron, 33 mm.

3. murino embrionale metatarso Dissection e cultura

  1. Abbattere il mouse in stato di gravidanza, l'ospitare 15 giorni di età embrioni, da dislocazione cervicale in conformità con le linee guida home office nel Regno Unito
  2. Posizionare la supina animale e disinfettare la pelle a spruzzo con il 70% di etanolo. Utilizzando forbici dissezione fare una grande incisione sulla linea mediana, penetrando sia la pelle e il peritoneo per esporre la cavità addominale.
  3. Individuare le due corna uterine dell'animale nella regione dorsale della cavità del corpo. Rimuovere le corna uterine da un lato liberando ogni uterino dal mesometrio da attenti incisioni con le forbici dissezione e infine il taglio delle corna uterine libera alla loro base. Place corna uterine in media dissezione.
  4. Separare ogni embrione, tagliando tra i siti di impianto lungo il corno uterino e rimuovere gli embrioni dalle loro singole sacche con pinze. embrioni da riforma per decapitazione, in conformità con le linee guida home office nel Regno Unito
  5. Dopo la disinfezione della pelle a spruzzo con il 70% di etanolo, usare le forbici Vannas micro per rimuovere gli arti posteriori da embrioni incidendo intorno al femore prossimale. Questo assicura tanto degli arti posteriori possibile è rimosso. Posizionare gli arti posteriori in una capsula di Petri sommerso nel mezzo di dissezione prima metatarso dissezione.
  6. Sotto un microscopio da dissezione, cominciare a rimuovere la pelle che circonda il piede embrionale, pizzicando e tirando fuori con il # 5 pinzette, mentre tenendo premuto il arto posteriore costante con il # 4 pinzette. Questo è più efficace eseguita afferrando la pelle a circa il livello della tibia e tirando verso le falangi. L'uso di forbici in questa fase per tagliare ilpelle molto sottile non è necessaria.
  7. tenere attentamente le tarso del piede embrionale con # 4 pinzette e rimuovere il primo e il quinto metatarso pizzicando fuori vicino alle tarso usando # 5 pinzette e scartare.
  8. Con il piede tenuto nella stessa posizione, utilizzare il # 5 pinzette per distruggere il tessuto connettivo tra i tre falangi rimanenti e metatarsi. Inserire la punta di # 5 pinzette in corrispondenza del giunto tra le falangi e metatarsi per rimuovere le falangi dei metatarsi.
  9. Infine, usare # 5 pinzette per distruggere il tessuto connettivo tra le tarso e metatarso. Anche in questo caso posizionare la punta del # 5 pinzette nello spazio articolare tra le tarso e metatarso e delicatamente liberi metatarsi dai tarso.
  10. Delicatamente raccogliere i metatarsi ora liberi con # 4 pinzette e posto in media dissezione fresco.
    NOTA: la dissezione attenta dovrebbe fornire 6 metatarsi da ogni embrione.
  11. Quando tutti i metatarsi richiesti sono stati sezionati, carefuLLY luogo metatarsi singolarmente nelle piastre da 24 pozzetti pre-riscaldato contenenti 300 ml di terreni di coltura. Metatarsi Culture a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% per un massimo di 14 giorni.
    NOTA: Non modificare i mezzi di comunicazione di culture E15 fino ad almeno 5 giorni di cultura come questo influenza la loro capacità di mineralizzazione 26. Le ragioni di questo non sono chiari, ma la crescita lineare e matrice mineralizzazione possono dipendere stimolazione con fattori di crescita rilasciati dalle metatarsi.

4. analisi e la manipolazione delle Culture metatarso

  1. Il giorno della dissezione (giorno 0) eseguire misure longitudinali iniziali utilizzando un microscopio con un software videocamera collegata e analisi di immagine digitale. Misurare la lunghezza della zona centrale mineralizzazione quando appare dopo pochi giorni di coltura.
  2. Periodicamente, come richiesto, effettuare ulteriori misurazioni (di solito ogni 2 ° giorno) fino all'ultimo giorno della cultura a quel punto mossa etatarsal vengono elaborati dipende risultati richiesti (discusso in premessa).
  3. Media Supplemento di culture metatarso d'organo con vari fattori esogeni ad esempio fattori di crescita, ormoni e agenti farmacologici dal giorno 0 della cultura 22,24. In tutti gli studi di questo tipo, di controllo sono necessari metatarsi non trattati.
    NOTA: Anche se è consigliabile che le ossa di controllo sono il rudimento equivalenti dalla gamba controlaterale, non ce ne è stato eventuali differenze di crescita lineare o potenziale mineralizzazione delle colta E15 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso (vedi sotto, figura 2) .

Risultati

Lo scopo di questo metodo è per isolare metatarsi e li cultura embrionali per l'esame della crescita ossea longitudinale ed ECM mineralizzazione. Utilizzando il nostro protocollo qui descritto, ossa del metatarso embrionali sono stati sezionati con successo, come visualizzato al microscopio ottico. Misure di ossa metatarsali, condotti come indicato nella figura 1, hanno mostrato la loro capacità di crescere in lunghezza longitudinale ed mineralizzare loro ECM (figure 2 e 3). Mineralizzazione della matrice viene prima osservato nella metà diafisi del rudiment dell'osso ed è facilmente osservata al microscopio ottico. Nessuna colorazione è richiesto anche se l'assorbimento di calceina può offrire una migliore visualizzazione del minerale di nuova formazione.

Gli studi che utilizzano metatarsi embrionali per data 22,27,28 hanno messo in comune la sezionato 2 °, 3 ° e 4 ° (CENtrali tre) metatarsi, assumendo in crescita in vitro e la mineralizzazione per essere comparabili. In vivo dello sviluppo di metatarsi murini, tuttavia, rivela che i 3 ° e 4 ° cifre hanno evidenza di mineralizzazione prima di tutti gli altri metatarsi e falangi 29. Valutazione del potenziale di crescita e la mineralizzazione della singolarmente isolate e coltivate E15 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso ha rivelato differenze significative nella comparsa o alla portata di mineralizzazione dopo 7 giorni di coltura (Figura 2). Nessuna differenza nella percentuale di aumento dal basale è stata rilevata durante il periodo di coltura. Come è stato notato differenze nel potenziale di mineralizzazione il protocollo standard di mettere in comune i 2 ° 3 ° e 4 ° metatarso appare valida per gli studi futuri.

Tradizionalmente, gli investigatori hanno aggiunto βGP ai mediautilizzato per cultura metatarsi embrionali per promuovere ECM mineralizzazione. Tuttavia, in studi di coltura cellulare, è stato dimostrato che se TNAP enzima viene aggiunto al supporto osteogeniche contenenti βGP, ectopica deposizione minerale idrossiapatite persiste anche in assenza di cellule 30. Per esaminare gli effetti dei vari substrati di mineralizzazione e agonisti sulla capacità metatarso mineralizzazione, abbiamo colto metatarsi E15 in terreni di coltura contenente una gamma di integratori, e le immagini e le misure di lunghezza sono stati registrati tutti i giorni. I risultati hanno indicato che la E15 ossa del metatarso ancora crescere e mineralizzano la ECM, in assenza di βGP. E15 metatarsale coltivate in acido ascorbico solo media hanno mostrato aumenti comparabili lunghezza e mineralizzazione come metatarsi coltivate in presenza di βGP (figura 3).

Abbiamo anche dimostrato che lentivirus può essere utilizzato per trasfettare DNA esogeno in Metata coltarsals. Qui abbiamo trasfettato con successo ossa del metatarso del giorno 0 della cultura (cioè giorno di dissezione) con 2 x 10 6 verdi particelle virali proteina fluorescente (GFP) per metatarso. Per abilitare la trasduzione del virus, polibrene è stato contemporaneamente aggiunta alle culture a 1: 500. Le colture sono state lasciate per 7 giorni, senza modifiche di supporto come richiesto per E15 metatarso mineralizzazione a verificarsi, prima di essere incubate con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) macchia per 5 minuti e poi direttamente visualizzati utilizzando un microscopio confocale ( Figura 4). La nostra prova di esperimenti concettuali mostrano chiaramente trasduzione efficace. Tuttavia sarebbe opportuno esaminare sezioni durante l'interezza del metatarso per valutarne la trasfezione ed efficace manipolazione genetica.

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Figura 1: metodologia standard usato per misurare tegli lunghezza e la mineralizzazione zona di embrionali Metatarso. (A) Misure totali di lunghezza di metatarsi E15 il giorno 0 della cultura (giorno di dissezione) presa attraverso il centro del metatarso. (B) Le misure di lunghezza longitudinale totale di un metatarso dopo sette giorni in coltura. Si noti la leggera curvatura del metatarso. (C) Misurazione della lunghezza della zona di mineralizzazione dopo sette giorni di coltura. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: crescita e mineralizzazione capacità di anatomicamente distinto E15 Metatarso Imaging e misura del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso dalla dell'arto posteriore di topi E15 w.interpretato. (A) le immagini seriali del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso per tutto il periodo di coltura. (B) Aumento percentuale in lunghezza da giorno 0 ad ogni giorno di coltura. (C) Lunghezza minerale del 2 °, 3 ° e 4 ° metatarsi nel periodo di coltura espresso come percentuale della lunghezza totale metatarso. Dati in sono rappresentati come media ± errore standard della media (SEM), (n = 6). (D) C57Bl / 6J metatarsali lunghezze in ogni giorno della cultura. Dati in sono rappresentati come media ± deviazione standard (n = 6). Nero bar = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: la crescita e la mineralizzazione capacità di Wild-typeE15 Metatarsi coltivate in vari media Osteogenic. (A) le immagini seriali di metatarsi coltivate in acido ascorbico solo 1 mm βGP 3 mm phosphocholine, cloruro di calcio 1,5 mm o cloruro di calcio 3 mM contenente supporti. (B) aumento percentuale in lunghezza da giorno 0 del metatarso coltivate con i vari supplementi. (C) Lunghezza minerale di metatarsi coltivate in vari media espressa come percentuale della lunghezza totale metatarso. I dati sono rappresentati come media ± errore standard della media (SEM), (n = 6). Nero bar = 1 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Transfection di E15 Metatarso con GFP virus Particoli. ossa del metatarso (A) E15 sono state trasfettate con particelle virali GFP per proof of concept. (B) Le ossa sono state colorate con DAPI per la visualizzazione del DNA. (C) Due immagini indicate trasfezione successo del virus GFP tutta la totalità delle ossa del metatarso. Barre bianche = 0,5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

La cultura del metatarso embrionali murine fornisce un modello altamente fisiologico della crescita endochondral e mineralizzazione. I primi studi hanno confermato che E15 metatarsi del mouse subiscono un normale modello di crescita scheletrica e la differenziazione. La cartilagine (condrociti) e l'osso (osteoblasti e osteoclasti), le cellule e le loro rispettive matrici di collagene sono indistinguibili da quelle osservate in vivo. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni riconosciute di questo modello. La velocità di differenziazione degli osteoclasti è compromessa così come la crescita delle ossa (ma non cartilagine differenziazione). La crescita ossea è circa il 50% inferiore a quella osservata in vivo e può essere causa di carenze in fattori sistemici che influenzano la produzione di fattori locali (ad esempio, IGF-1, BMP, ecc) 31. Inoltre, è ben noto che l'osso è sensibile al suo ambiente meccanico e questo è anche il caso per metatarsi coltivate, che rispondono alla cHANGES a carico 32,33 meccanica. Pertanto, in situazioni non caricati, come descritto in questo protocollo, la mineralizzazione e il riassorbimento minerale potrebbe essere compromessa. Tuttavia, il modello metatarso offre la possibilità di misurare direttamente la crescita delle ossa lineare che non è possibile tramite 2D e 3D in sistemi di coltura in vitro.

Abbiamo fornito una descrizione completa del protocollo coinvolti nella dissezione e la cultura della E15 metatarsi murini e in effetti, per la prima volta, confermare la validità di mettere in comune i 2 °, 3 ° e 4 ° metatarso per gli esperimenti.

Metatarsi da E17 / E18 sono comunemente usati per studiare i meccanismi di crescita ossea a causa della loro straordinario potenziale per crescere ex vivo per lunghi periodi di tempo (cioè oltre i 14 giorni di cultura). Si tratta di un modello consolidato per indagare il ruolo dei fattori di crescita sulla crescita embrionale ossea longitudinale.Inoltre, la dissezione e la cultura di metatarsi postnatali è comunemente impiegato per delineare i meccanismi che circondano la crescita delle ossa post-natale, come si è capito che la crescita delle ossa post-natale e la crescita delle ossa del feto sono regolati in modo diverso 21. La crescita ossea osservata in metatarsi postnatali in coltura è comunque notevolmente inferiore a quello osservato nei rudimenti embrionali 25,34, limitando il loro potenziale in studi a lungo termine e mettendo in evidenza l'influenza più sistemico sulla crescita delle ossa, in questa fase post-natale. Infatti, 3 giorni di età metatarsi postnatale di topi sono tipicamente l'ultima fase che può essere utilizzato per ottenere misurabile 34 crescita.

Qui si descrive il nostro protocollo per l'isolamento delle ossa del metatarso embrionali a E15. L'assenza di minerale hydroxyapaptite in E15 metatarsale significa che essi forniscono un modello ineguagliabile per indagare non solo i meccanismi circostanti crescita ossea longitudinale, ma anche l'iniziazionedi mineralizzazione scheletrica. La matrice mineralizzata della zona di condrociti ipertrofica terminale fornisce un'impalcatura per invadere osteoblasti stabilire un osso specifica matrice (osteoide), che viene successivamente mineralizzata, e come tale questo mineralizzazione iniziale è di vitale importanza per la formazione delle ossa di successo e funzionale 35. In effetti una serie di rapporti recenti che utilizzano metatarsi E15 hanno confermato la loro capacità unica per l'indagine del 28,36,37 processo di mineralizzazione. Inoltre, i ricercatori hanno descritto l'uso di metatarsi E15 come modello di angiogenesi 38, mettendo in evidenza il potenziale di metatarsi embrionali come modello di fuori del contesto della crescita ossea / mineralizzazione.

Il protocollo che descriviamo richiede solo apparecchiature di laboratorio standard tra cui una cappa flusso laminare, un microscopio da dissezione per eseguire la dissezione, e un incubatore di CO 2 per la cultura dei primi rudimenti escisse. Inoltre, una strada molto essenzialeture terreno contenente αMEM, BSA, antibiotici, antimicotici e l'acido L-ascorbico (un cofattore nella sintesi di idrossiprolina e idrossilisina, due amminoacidi essenziali per la produzione di collagene 39) evita l'uso di additivi non definiti, come siero animale . Tradizionalmente, gli investigatori hanno aggiunto βGP ai mezzi utilizzati per la coltura metatarsi embrionali, ma come rivelato nei nostri risultati, l'uso di una fonte di fosfato supplementare non è richiesto per la mineralizzazione successo in questo sistema di coltura. Questo è un dato importante nella nostra ricerca di comprensione dei meccanismi alla base ECM mineralizzazione.

Metatarsi sono stati precedentemente infettati con adenovirus contenenti forme dominanti negativi di Smad2 per esplorare il ruolo di fattore di crescita trasformante β nella regolazione dello sviluppo delle ossa lunghe 40. Qui si rivelano anche la trasfezione di successo di wild-type ossa metatarsali E15 con particelle virali GFP, indicando ttecniche di cappello lentivirali potrebbero essere facilmente adottate per manipolare l'espressione genica nelle culture del metatarso. Analogamente, il sistema di coltura organo metatarso è un modello eccellente in cui confrontare la crescita delle ossa da topi geneticamente modificati per comprendere meglio il ruolo di un particolare gene nel processo di crescita ossea. I nostri studi precedenti hanno utilizzato il sistema di coltura di organi metatarso per determinare il ruolo di soppressore di citochine segnalazione-2 (SOCS2) in crescita ossea endochondral. Utilizzando ossa del metatarso da topi deficienti in SOCS2, abbiamo dimostrato che l'ormone della crescita è in grado di simulare il loro longitudinale crescita autonoma di insulina come fattore di crescita (IGF-1), a differenza di wild-type ossa metatarsali che non rispondono alla crescita trattamento ormonale 34, 41. Ciò evidenzia la misura in cui le culture metatarsali possono essere manipolati per esaminare gli effetti di diversi geni e / o fattori esogeni sulla crescita ossea endochondral.

In sintesi, abbiamo detaicondotto un metodo per l'estrazione di successo e cultura metatarsale embrionali che possono essere manipolate ed esaminati utilizzando una varietà di analisi. Questo modello ex vivo mantiene cellula-cellula e le interazioni cellula-matrice, così come contiene condrociti in diverse fasi di condrogenesi, fornendo quindi un modello più fisiologico di cellule in monostrato o coltura 3D. Metatarsali organo culture sono quindi un modello unico per lo studio dei meccanismi molecolari responsabili encondrale, e sono essenziali per migliorare la nostra comprensione sia la fisiologia dell'osso e fisiopatologia

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Siamo grati al Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) per il finanziamento di DH (BB/J01446X/1), CF & VEM (Institute Strategic Programme Grant Funding BB/J004316/1). Ringraziamo inoltre Arthritis Research UK per il finanziamento a KAS (20413). Ringraziamo la signorina Elaine Seawright per la sua assistenza con gli esperimenti dettagliati, il dottor Neil Mackenzie per la sua assistenza con le tecniche lentivirali, e il signor Darren Smith e il signor Alex Robertson (Roslin Institute BRF) per la loro assistenza con gli studi sugli animali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Forbici da dissezioneWorld Precision Instruments14393Sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Pinzette Dumont #5World Precision Instruments500342sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Pinzette Dumont #4Precision Instruments500339sterilizzare in autoclave prima dell'uso
Forbici SuperFine VannasWorld Precision Instruments
Etanolo assolutoFisher ScientificE/0650DF/17Diluire al 70% v/v in dH2O
&alfa;-MEM senza nucleosidiThermo Fischer Scientific 
Albumina sierica bovinaSigma AldrichA3059
Filtri per siringhe (0,22 μ m)Millipore Merck diametroSLGP033RS
Cloruro di fosfocolina sale di calcio tetraidratoSigma AldrichP0378Aggiungere direttamente al terreno prima della sperimentazione
Acido L-ascorbico-2-fosfatoSigma AldrichA8960Confezione da brodo a 5mg/ml e aliquota a -20 ° C
Cloruro di calcio diidratoSigma AldrichC5080Confezione stock soution a 150mM e aliquota a -20 ° C
β-glicerofosfato sale disodico idratoSigma AldrichG9422Confezione scorta a 1mM e aliquota a -20 ° C
GentamicinaThermo Fischer Scientific 
Amfotericina BThermo Fischer Scientific
Piastre a 24 pozzetti trattate con colture cellulari NuncThermo Fischer Scientific 
PolybreneSigma AldrichH9268
DAPIThermo Fischer Scientific D3571
World 50177822561021 33 mm 1571004915290018142475

Riferimenti

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