Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

Siamak Djafarzadeh; Stephan M. Jakob

doi:10.3791/54985

Articolo metodologico

Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

DOI:

10.3791/54985

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8 febbraio 2017

Siamak Djafarzadeh¹ , Stephan M. Jakob¹

¹Department of Intensive Care Medicine, Inselspital, Bern University Hospital, University of Bern

In questo articolo

Sommario

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Ad alta risoluzione respirometria è utilizzato per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questa è una tecnica semplice per determinare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima, e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Abstract

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Un ossigrafo ad alta risoluzione è un dispositivo per misurare il consumo di ossigeno cellulare in un sistema a camera chiusa con altissima risoluzione e sensibilità in campioni biologici (cellule intatte e permeabili, tessuti o mitocondri isolati). Il dispositivo ossigrafo ad alta risoluzione è dotato di due camere e utilizza sensori polarografici di ossigeno per misurare la concentrazione di ossigeno e calcolare il consumo di ossigeno all'interno di ciascuna camera. I tassi di consumo di ossigeno sono calcolati utilizzando un software ed espressi come picomoli al secondo per numero di cellule. Ogni camera per ossigrafo ad alta risoluzione contiene un tappo con porte di iniezione, che la rende ideale per titolazioni di disaccoppiatori-inibitori del substrato o protocolli di titolazione con detergenti per determinare concentrazioni efficaci e ottimali per la permeabilizzazione della membrana plasmatica. La tecnica può essere applicata per misurare la respirazione in un'ampia gamma di tipi di cellule e fornisce anche informazioni sulla qualità e l'integrità mitocondriale e sulla capacità massima del sistema di trasporto degli elettroni respiratori mitocondriali.

Introduzione

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I mitocondri svolgono ruoli importanti nel metabolismo energetico cellulare, particolarmente usando ossigeno per produrre adenosina trifosfato (ATP). Essi sono implicati nella morte cellulare ed in numerose malattie umane. Mitocondriale fosforilazione ossidativa (OXPHOS) combina trasporto degli elettroni lungo la catena di trasporto di elettroni con il consumo di ossigeno e la sintesi di ATP. L'acido ciclo (TCA) mitocondriale tricarbossilici è coinvolto nella conversione di proteine, carboidrati e grassi in composti ricchi di energia come dinucleotide nicotinamide adenina (NADH) e flavina adenina dinucleotide (FADH _2). Gli elettroni del NADH e _FAD....

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Protocollo

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Cultura 1. cellulare

Cellule Culture epatoma HepG2 umano ⁶ su 25 cm ² fiasche di coltura cellulare in terreno Dulbecco Modified Eagle (DMEM) contenente siero 10% inattivato al calore bovino fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina a 37 ° C in un incubatore (5% CO _2, 95% di aria) (densità di semina: 1 x 10 ⁶ cellule ogni 25 cm pallone di coltura cellulare ^2, tempo di incubazione in incubatrice a 37 ° C: 48 hr, densità delle cellule al confluenza: 4-5 x 10 ⁶ cellule per 25 cm pallone di coltura di cellule ^2).
Eseguire esperimenti quando le cellule sono i....

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Risultati

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Determinazione ottimale Digitonina concentrazione per Cellular Permeabilizzazione: Digitonina Titolazione Experiment

Digitonin titolazione viene eseguita per determinare la concentrazione ottimale per permeabilizzazione delle cellule HepG2. Per questi esperimenti, digitonina viene titolato in cellule intatte in presenza di rotenone, succinato (mitocondriale complesso II substrato) e una quantità saturante di ADP (per indurre stat.......

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Discussione

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L'obiettivo del presente protocollo è stato quello di usare ad alta risoluzione respirometria per misurare mitocondriale complessi della catena respiratoria '(I-IV) frequenza respiratoria, la capacità del sistema di trasporto degli elettroni mitocondriale massima e l'integrità della membrana mitocondriale esterna.

Ci sono alcuni passaggi critici all'interno del presente protocollo. Primo, i tassi di consumo di ossigeno cellulare sono generalmente normalizzati per il numero di.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica (Grant nº 32003B_127619).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ADP	Sigma	A 4386	Chimico
Antimicina A	Sigma	A 8674	Chimico, sciogliere in etanolo
Ascorbato	Merck	1.00127	Chimico
BSA	Sigma	A 6003	Chimico
FCCP	Sigma	C 2920	Chimico, sciogliere in etanolo
Countess contatore cellulare automatizzato	Thermo Fisher Scientific	n/a	Strumento automatizzato per il conteggio delle cellule
Citocromo c	Sigma	C 7752	Chimico
Digitonina	Sigma	D 5628	Chimico, sciogliere in
DMSO DMEM	Gibco 31966021		Medium
EGTA	fluka	3779	Chimico
FBS	Gibco	26010-074	Componente medio
Glutammato	Sigma	G 1626	Chimico
Hepes	Sigma	H 7523	Chimico
KCl	Merck	1.04936	Chimico
KH₂PO₄	Merck	1.04873	Chimico
K-lattobionato	Sigma	L 2398
Chimico MgCl₂	Sigma	M 9272
O2k-Core chimico: ossigrafo-2k	Oroboros Instruments	10000-02	Strumento per respirometria ad alta risoluzione
Oligomicina	Sigma	O 4876	Chimico, sciogliere in etanolo
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140122	chimico
Azide di sodio	Sigma	S2002	Chimico
Rotenone		Sigma R 8875	Chimico, sciogliere in etanolo
Succinato	Sigma	S 2378	Chimico
Taurina		Sigma T 8691	Chimico
TMPD	Sigma	T 3134	Chimico
Tripsina	Sigma	T 4674	Chimico

Riferimenti

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Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochem J. 435 (2), 297-312 (2011).
Lanza, I. R., Nair, K. S. Functional assessment of isolated mitochondria in vitro. Methods Enzymol. 457, 349-372 (2009).
Zhang, J., et al.

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Cellule permeabilizzate consumo di ossigeno titolazione del substrato titolazione dell inibitore permeabilizzazione con digitonina integrit mitocondriale catena respiratoria

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