ADSC fogli trapianto per prevenire stenosi dopo esteso esofagea endoscopica della sottomucosa dissezione

Sommario

Questo studio riporta un metodo efficace di endoscopico cellule stromali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) -sheet trapianto per la prevenzione stenosi esofagea dopo una dissezione endoscopica della sottomucosa prolungato (ESD) in un modello suina.

Abstract

Negli anni passati, il costrutto cellule-foglio ha stimolato grande interesse nella medicina rigenerativa, in particolare per le procedure di chirurgia ricostruttiva. Lo sviluppo di tecnologie diversificate, che conciliano cellule stromali derivate dal tessuto adiposo (ADSCs) con vari biomateriali ha portato alla costruzione di numerosi tipi di sostituti tissutale, come le ossa, cartilagine e tessuto adiposo da roditore, suina o ADSCs umane. Esteso esofageo dissezione sottomucosa endoscopica (ESD) è responsabile della formazione di stenosi esofagea. prevenzione della stenosi rimane impegnativo, con trattamenti efficaci disponibili. Precedenti studi hanno riportato l'efficacia del trapianto di cellule fogli mucosa in un modello canino e nell'uomo. ADSCs vengono attribuite proprietà anti-infiammatorie, effetti di modulazione immunitaria locale, induzione neovascolarizzazione, e capacità di differenziazione in mesenchimali e lignaggi non mesenchimali. Questo studio originale descrive TRA endoscopicansplantation di un costrutto tissutale ADSC per evitare stenosi esofagea in un modello suina. Il costrutto ADSC era composto da due fogli ADSC allogeniche a strati l'uno sull'altro su una membrana di supporto cartaceo. Le ADSCs sono stati etichettati con il fluoroforo PKH67 per consentire sonda-based endomicroscopy laser confocale monitoraggio (PCle). Il giorno del trapianto, è stata effettuata una 5-cm e ESD emi-circonferenziale noti per indurre stenosi esofagea. Gli animali sono stati subito endoscopicamente trapiantati con 4 costrutti ADSC. L'adesione completa dei costrutti ADSC stato ottenuto dopo 10 min di applicazione delicata. Gli animali sono stati sacrificati al giorno 28. Tutti gli animali sono stati trapiantati con successo. Il trapianto è stato confermato il giorno 3 con una valutazione PCle positivo. Rispetto agli animali trapiantati, gli animali di controllo hanno sviluppato gravi stenosi, con grande sviluppo del tessuto fibrotico, più frequenti problemi alimentari, e aumento di peso ridotto. Nel nostro modello, il trapianto di allogenic ADSCs, organizzati in fogli doppi cellulari, dopo ESD prolungato ha avuto successo e fortemente associata con un tasso di stenosi esofageo inferiore.

Introduzione

La gestione dei tumori esofagei superficiali è cambiato con lo sviluppo di nuove tecniche endoscopiche. Al giorno d'oggi, la resezione endoscopica è il trattamento di prima linea. Infatti, è associata a tassi di morbilità e mortalità inferiori rispetto a un intervento chirurgico con risultati uguali oncologici ^{1, 2, 3.} resezione endoscopica della mucosa (EMR) e la resezione endoscopica della sottomucosa (ESD) sono le tecniche più utilizzati. Nel caso di un tumore superficiale esteso, ESD è preferito. Rispetto a EMR, ESD permette resezione in blocco, indipendentemente dalle dimensioni della lesione e la forma ^{4, 5, 6.} La principale complicazione ritardata di ESD è formazione di stenosi esofagea, che si verifica in genere tra una e due settimane dopo la resezione. studi pubblicati recenti hanno dimostrato che la formazione di stenosi è correlatodimensioni della resezione. Il giapponese endoscopica Society raccomanda di evitare ESD di dimensioni superiori a ¾ della circonferenza esofageo perché sono associati con lo sviluppo stenosi in più del 90% dei casi e sono responsabili di problemi di alimentazione severe e maggiore deterioramento della qualità della vita.

La prevenzione della stenosi esofagea rimane difficile. Meccanismi coinvolti nella formazione di stenosi sono solo parzialmente noti. Stenosi formazioni sembra derivare dalla associazione di due diversi meccanismi: (1) pro-infiammatorie reclutamento cellulare e (2) un eccessivo sviluppo della fibrosi ^7. Sono stati proposti diversi trattamenti preventivi. Tuttavia, i risultati non sono stati soddisfacenti, con pochi benefici e gli effetti collaterali gravi ^{8, 9.} Recentemente, un team giapponese, Ohki et al. , Proposto trapiantare un strato di cellule monostrato di cellule della mucosa orale autologhe nella esophcicatrice ageal. Il trapianto è stato effettuato immediatamente dopo ESD ^{10, 11.} Essi hanno dimostrato l'efficacia di questo approccio innovativo, prima in un modello canino e poi nei pazienti.

le cellule derivate dal tessuto adiposo stromali (ADSCs) sono promettenti nella medicina rigenerativa. La loro applicazione in diversi settori ha mostrato risultati interessanti, soprattutto nel processo di guarigione. Terapia ADSC offre diversi vantaggi, in quanto le cellule sono facilmente isolati e sono associati con proprietà anti-infiammatorie, effetti immunomodulanti locali, induzione neovascolarizzazione, e capacità di differenziazione in mesenchimali e linee non mesenchimali ^{12, 13, 14.}

In uno studio precedente, la nostra squadra ha dimostrato l'efficacia del doppio trapianto endoscopica ADSC fogli per prev stenosi esofageaenzione dopo ESD prolungato in un modello di suini ^15. In questo articolo, vengono presentati i rapporti di costruzione ADSC fogli e la tecnica di trapianto endoscopico.

Protocollo

Tutti gli animali sono stati trattati secondo il comitato etico Animal Research (linee guida del Ministero dell'Agricoltura francese). Il protocollo ha ricevuto l'approvazione del comitato etico locale autorizzato per sperimentazioni animali al Paris Descartes University (numero di registrazione MESR 2.035,02; Facoltà di Medicina Paris Descartes, Parigi, Francia).

1. ADSC cultura e etichettatura

1. Ottenere ADSCs confermati da un istituto privato. Culture ADSCs allogeniche a 37 ° C e 5% di CO ₂ con un minimo di alpha mezzo essenziale di cui 10% di siero di vitello fetale e 1% di antibiotici (penicillina e streptomicina).
2. Ottenere circa 24 x 10 ⁶ ADSCs per animale utilizzando le procedure di espansione delle cellule normali (37 ° C e 5% di CO _2). Raccogliere le ADSCs utilizzando una soluzione di tripsina standard (10 ml per un piatto T150). Effettuare il conteggio delle cellule con un emocitometro.
3. Eseguire cellule etichettatura il giorno prima del trapianto con il pr PKH67 colorazioneocedure descritto di seguito.
   NOTA: L'obiettivo della procedura di colorazione è quello di consentire il monitoraggio delle cellule dopo il trapianto.
   1. Al fine di etichettare 2 x 10 ⁶ ADSCs, preparare Soluzione A (2 x 10 ⁶ cellule con 100 ml di diluente C) e Soluzione B (4 ml di PKH67 con 1 ml di diluente C).
   2. Incubare soluzioni A e B per 2 min. Quindi, aggiungere 100 ml di siero di vitello fetale per 1 min.
   3. Lavare la soluzione con 300 ml di citrato RPMI (298,5 ml di RPMI e 1,5 ml di citrato) e centrifugare a 1500 xg per 5 min. Ripetere questa operazione 2 volte. Mantenere le cellule marcate e proteggerli dalla luce fino alla costruzione foglio.

2. Fare doppio ADSC fogli Construct

1. Il giorno prima del trapianto, preparare un sensibile alla temperatura piatto di coltura cellulare 12 pozzetti con 4 ml per pozzetto di mezzo di coltura cellulare, sopra descritti, prima PKH-etichettatura. Seme il piatto con 1,5 x 10 ⁶ PKH-labeled cellule per pozzetto e incubare per 12 ore (37 ° C e 5% _di CO _2).
2. Il giorno del trapianto, staccare il foglio di cellule confluenti incubando il piatto a temperatura ambiente per 30 min.
3. Aspirare delicatamente un foglio ADSC con una pipetta e strato su un foglio idrofoba (1,5 cm di diametro). Utilizzare questo documento come una membrana di supporto.
4. Afferrare un altro foglio ADSC e delicatamente depositarlo sopra l'altro per ottenere un costrutto doppio strato.
5. Ripetere queste procedure per ottenere il maggior numero di costrutti ADSC fogli, se necessario (4 per animale).

3. esofagea endoscopica della sottomucosa dissezione (ESD)

1. Il giorno del trapianto, pre-medicare animali con 10 mg / kg di ketamina intramuscolare e indurli con 8 mg / kg di propofol endovenosa. Quindi, eseguire l'intubazione endotracheale e mantenere l'anestesia con isoflurano 2,5% inalazione.
2. Una volta che l'animale è sotto anestesia generale, eseguire ESD con gastroscOPE, un videoscope, e un elettrobisturi.
   1. Utilizzare un coltello endoscopica e coagulazione morbido per ottenere i marchi dorsali emi-circonferenziale che vanno da 40 cm a 45 cm dal arcata dentale.
   2. Iniettare una soluzione di glicerolo contenente indaco carminio colorante nello strato sottomucosa per la separazione dello strato mucoso dallo strato muscolare.
   3. Utilizzare un coltello endoscopica con modalità endocut ho per ottenere incisioni circonferenziali.
   4. Utilizzare un coltello endoscopica con modalità di coagulazione costretto ad eseguire la dissezione sottomucosa, spostando dall'incisione prossimale all'incisione distale.
3. Al termine della procedura ESD, osservare l'emi-circonferenziale, 5 cm-lunga cicatrice esofageo esponendo lo strato muscolare.

4. endoscopica Trapianto

1. Subito dopo la ESD, per via endoscopica trapianto di animali con 4 costrutti doppio ADSC fogli.
   1. Afferrare un costrutto ADSC fogli con una pinza endoscopica eproteggerlo durante il trasporto al sito della ferita utilizzando un grande tappo endoscopica trasparente,.
   2. Applicare l'intera superficie del costrutto ADSC fogli al letto dell'ulcera.
   3. Applicare delicatamente il costrutto ADSC fogli per 10 minuti per ottenere un attecchimento completo e stabile. Per l'applicazione, utilizzare una pinza endoscopica o un tappo endoscopica e applicare tutta la superficie del ADSC costruire sullo strato sottomucosa esofagea.
2. Ripetere questa procedura quattro volte per ogni animale in modo da ottenere quattro doppi costrutti cellule fogli trapiantati ed aderenti.
   NOTA: L'obiettivo è quello di coprire approssimativamente la metà della superficie feriti.

5. postoperatoria valutazione e di follow-up

1. Per ciascun animale, garantire post-ESD analgesia con l'iniezione intramuscolare di 0,2 mg / kg di morfina tre volte al giorno per il primo giorno e con 28 giorni di trattamento anti-acido di esomeprazolo (40 mg / die). Eseguire la profilassi antibiotica con amoxicillin (1 g / giorno) per 7 giorni. Autorizzare liquidi al giorno 1 e solidi il giorno successivo.
2. Follow-up con gli animali per 28 giorni. Ottenere valutazioni cliniche quotidiane utilizzando Mellow Pinkas punteggi disfagia ¹⁶ e le misure di variazione di peso.
3. Valutazione stenosi multimodale: in anestesia generale, nei giorni programmati 3, 14, e 28, effettuare una valutazione multimodale di stenosi occorrenza.
   1. Eseguire una valutazione endoscopica utilizzando descrizione cicatrice, la misurazione stenosi, e la rilevazione della membrana supporto cartaceo. Misurare la stenosi utilizzando il gastroscopio per attraversare attraverso la stenosi (il diametro del gastroscopio è di 8 mm). Osservare la cicatrice, prestando attenzione all'aspetto infiammatoria (eritema della mucosa, edema della mucosa e della mucosa emorragie spontanee) e l'assenza o la presenza della membrana supporto cartaceo all'interno della cicatrice.
   2. Applicare PCle sonda verde attraverso il canale operatore gastroscopio direttamente nel letto cicatrice. Cerca una spontaneae il segnale verde compatibile con PKH67 marcato ADSC fogli costrutto attecchimento organizzata.
   3. Eseguire 2 incidenza ortogonali di barite esophagography con un cerchio radiologico (anteriore e incidenze lato sinistro). Mantenere l'incidenza più stretto per la valutazione stenosi (grado di stenosi (%) = [1- (lunghezza dell'asse breve sotto stenosi / lunghezza dell'asse normale sotto stenosi) x 100)]) ^{17, 18.}
4. sacrificio animale.
   1. Il giorno 28, al termine del periodo di follow-up, eseguire il sacrificio di animali. Mentre l'animale è ancora in anestesia generale, iniettare 100 mg / kg di fenobarbital endovenosa. Assicurarsi che la morte degli animali mediante esame clinico per l'assenza di un battito cardiaco e la respirazione di movimento.
   2. Dopo un'esposizione sternotomia e organo, rimuovere l'esofago di ogni sacrificati animali (con il 10% di fissaggio in formalina tamponata, paraffina, e le sezioni 4 micron di spessore). Colorare le diapositivecon ematossilina e Zafferano ^15. Digitalizzare i vetrini per l'analisi computerizzata e confrontare i gruppi di animali ^15.

Risultati

La cultura ADSCs e la procedura per ottenere il foglio ADSC è mostrato in Figura 1. La Figura 2 mostra la costruzione del trapianto, composto da due fogli ADSC livelli reciprocamente sulla loro membrana supporto cartaceo. ADSCs erano stati precedentemente etichettati con il fluoroforo PKH67 per consentire il monitoraggio del trapianto in vivo con PCle. La Figura 3 mostra le varie fasi estesa esofageo dissezione sottomuc...

Discussione

In questo modello di maiale, il trapianto di ADSC fogli era tecnicamente riuscita, e il vivo di valutazione PCle in permesso per il monitoraggio attecchimento delle cellule. valutazioni cliniche, endoscopici, radiologici e istologici hanno dimostrato l'efficacia del foglio ADSC endoscopica alla prevenzione stenosi esofagea dopo ESD prolungato.

Il trapianto endoscopica di una soluzione di glicerolo ADSC contenente un foglio di tintura indaco carminio è un approccio innov...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cappuccio endoscopico trasparente Q180 compatibile	Olympus Optical Co
GIF-Q180 gastroscopio	ottico Olympus Co
Exera II	Olympus Optical Co
18 G	Olympus Optical Co
Elettrobisturi ERBE ICC 350	ERBE Tecnologia
Indigo carmin 1%	Life
Coltello ibrido endoscopico	Life
Minisonde Z pCLE sonda verde	Mauna Kea Tecnologia		Devi imparare a usare la sonda. La manipolazione potrebbe essere difficile.
Siero fetale bovino	Sigma Aldrich	12105C
Tripsina	Sigma Aldrich	T146
Alpha terreno essenziale minimo	Thermo Fisher	22561-021
Soluzioni saline tamponate con fosfato	Thermo Fisher	10010-023
PKH67 kit colorante	Sigma Aldrich	Mini67-KT
12 pozzetti cellula sensibile alla temperatura piatto di coltura	Upcell Thermo Scientific	174900	Sentire il peso con 4 ml di coltura media standard 30 minuti prima di seminare le cellule
Esomeprazolo 40 mg	Biogaran
Moprhine solfato 50 mg/mL	Lavoisier
Amoxicillina 1 g	Biogaran
Ketamina 250 mg/5 mL	Panpharma
Propofol 10 mg/mL	Fresenius
Carta idrofobica	Carrefour

Sistema di videoscopio Ago per iniezione