Articolo metodologico

Flusso Virometry per analizzare antigenica spettri di virioni e extracellulare vescicole

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DOI:

10.3791/55020

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25 gennaio 2017

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1Section on Intercellular Interactions, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, 2Laboratory of Atherothrombosis, Cardiology Department, Moscow State University of Medicine and Dentistry, 3Sidra Medical and Research Center

In questo articolo

Sommario

I virus o le vescicole extracellulari sono stati immunocatturati con nanoparticelle magnetiche da 15 nm accoppiate ad anticorpi che riconoscono gli antigeni di superficie. I virioni o le vescicole catturati sono stati marcati con anticorpi fluorescenti contro altri antigeni di superficie. I complessi risultanti sono stati separati in un campo magnetico elevato e analizzati con citometri a flusso convenzionali attivati a fluorescenza.

Abstract

Le cellule rilasciano piccole vescicole extracellulari (EV) nel terreno circostante. Dopo l'infezione virale, le cellule rilasciano anche virioni che hanno le stesse dimensioni di alcune delle vescicole extracellulari. Sia i virioni che le vescicole extracellulari trasportano le proteine delle cellule che li hanno generati e sono antigenicamente eterogenei. Nonostante la loro diversità, sia i virus che le vescicole extracellulari sono stati caratterizzati prevalentemente dall'analisi di massa. Qui, descriviamo un originale metodo ad alto rendimento basato sulla nanotecnologia che consente la caratterizzazione di antigeni su singole piccole particelle utilizzando normali citometri a flusso. I virus o le vescicole extracellulari sono stati immunocatturati con nanoparticelle magnetiche (MNP) a 15 nm accoppiate ad anticorpi che riconoscono uno degli antigeni di superficie. I virioni o le vescicole catturati sono stati incubati con anticorpi fluorescenti contro altri antigeni di superficie. I complessi risultanti sono stati separati su colonne magnetiche da anticorpi non legati e analizzati con citometri a flusso convenzionali attivati a fluorescenza. Questo metodo ha ampie applicazioni e può essere utilizzato per caratterizzare la composizione antigenica di qualsiasi piccola particella virale e non virale generata da cellule in vivo e in vitro. Qui, forniamo esempi dell'uso di questo metodo per valutare la distribuzione dei marcatori delle cellule ospiti su singole particelle di HIV-1, per studiare la maturazione dei singoli virioni Dengue (DENV) e per studiare le vescicole extracellulari rilasciate nel flusso sanguigno.

Introduzione

Le cellule in organismi multicellulari hanno molte caratteristiche individuali che possono essere sia unica per una particolare cella o almeno appartenere a gruppi unici di cellule. Anche le cellule clonate in coltura mostrano caratteristiche individuali come dimostra la loro diversa morfologia. Inoltre, l'individualità di una cellula si riflette nei prodotti che secerne. Nel caso di infezione virale, le particelle virali possono trasportare proteine ​​dalle cellule che li hanno prodotti. Ad esempio, per l'HIV molte proteine della cellula ospite sono incorporati nella busta virale e virus che vengono generati dalle cellule differenti possono portare queste proteine caratteristici 1, 2 o "firme cellulari".

Anche senza l'infezione, le cellule rilasciano nei media che circondano piccole vescicole extracellulari (SVE). Biogenesis di queste vescicole e la loro struttura, in molti casi assomiglia a quella del virus, specialmente retrovirus. Negli ultimi anni è diventato chiaroche i veicoli elettrici, che sono stati inizialmente considerati "polvere di piastrine" 3, costituiscono un importante sistema fisiologico di comunicazione cellula-cellula. Insieme ad altri due sistemi di comunicazione intercellulare, cioè le interazioni di contatto cellula-cellula e molecole solubili rilasciati, i veicoli elettrici coordinare la fisiologia normale e sono alterati in varie patologie 4, 5 tra cui le infezioni virali 6, 7.

Anche se entrambe le particelle virali rilasciate e vescicole extracellulari sono molto diverse, sono caratterizzati prevalentemente da analisi di massa, in cui si perdono le loro caratteristiche individuali. Un metodo simile a citometria a flusso, che fenotipi le cellule in base alle loro differenti antigeni di superficie, è necessaria per caratterizzare le singole particelle virali e virus-like. Purtroppo, i veicoli elettrici o piccole virioni non possono essere analizzati utilizzando cito flusso standardMetodi metria perché sono troppo piccoli per generare il segnale di luce-dispersione in cui la maggior parte citometri contano per l'attivazione. Per aggirare questa limitazione, innescando la fluorescenza può essere applicata. Tuttavia, se EVs o virioni sono colorate con anticorpi fluorescenti è difficile distinguerli da anticorpi liberi e loro aggregati a causa della loro fluorescenza simile e dimensioni paragonabili.

Recentemente, è stato sviluppato un metodo di throughput elevato nanotecnologia-based che permette la caratterizzazione degli antigeni sulle singole particelle di piccole dimensioni che utilizzano regolare flusso citometri 8, 9. Impieghiamo MNPs a particelle immunocapture di interesse, come è stato descritto da altri gruppi per diverse applicazioni 10, 11, 12, 13; tuttavia, la nostra nuova tecnica permette la cattura di speci individualeobiettivi FIC seguiti da fenotipizzazione di queste particelle catturate mediante citometria di flusso utilizzando la fluorescenza innescando invece di dispersione della luce, senza interferenze da parte degli anticorpi che galleggiano liberi. Questo metodo ha applicazioni larghe e può essere utilizzato per caratterizzare la composizione antigenica di qualsiasi piccola particella viral- e non virali generati dalle cellule in vivo e in vitro fornito la disponibilità di anticorpi fluorescenti specifici contro antigeni di superficie. Abbiamo già applicato questa tecnica per studiare diversi problemi biologici.

In particolare, abbiamo valutato la distribuzione dei marcatori di cellule ospitanti sui singoli HIV-1 particelle 9, abbiamo studiato la maturazione dei singoli virus Dengue (DENV) sulla base di analisi delle loro proteine di superficie 14 e studiato EV rilasciati nel flusso sanguigno di volontari sani e pazienti con sindrome coronarica acuta (ACS). Sebbene basato su un principio simile, laapplicazione della nuova tecnica richiesto lo sviluppo di protocolli specifiche descritte di seguito.

Protocollo

1. Accoppiamento di nanoparticelle magnetiche (MNPs)

  1. Utilizzare procedura di accoppiamento commerciale e reagenti per accoppiare MNPs con anticorpi (Abs) (in genere 1 mg). Sono utilizzati ferro nanoparticelle di ossido con acido carbossilico gruppi reattivi.
    1. Se gli anticorpi sono in un volume superiore a 0,5 ml, concentrato usando un concentratore 100K. Spin a 2.000 g per 3-5 minuti.
  2. Al termine della procedura, dopo aver aggiunto 10 ml di tampone di tempra, trasferire MNPs ad un tubo 12 mm x 75 mm e aggiungere tampone / stoccaggio 3 ml di lavaggio. Porre il tubo nel foro centrale di un separatore magnetico e lasciare per una notte a 4 ° C.
  3. Verificare che MNPs hanno tutti collezionati al lato del tubo, e poi accuratamente pipettare eliminare tutto il liquido. Aggiungere 3 ml di tampone di lavaggio / stoccaggio fresco, e mettere di nuovo nel magnete.
  4. Dopo diverse ore, controllare se MNPs sono raccolti al lato del tubo e poi pipettare il liquido. Utilizzare 2 ml di tampone di lavaggio / stoccaggio dirisospendere il MNPs e conservare a 4 ° C.
  5. Verificare che Abs sono accoppiati a MNPs da loro etichettatura con una determinata fluorescenti frammento di anticorpo Fab (ad esempio capra anti-topo se si utilizza un anticorpo monoclonale del mouse Ab per la cattura come descritto al punto 2) ed eseguire su un citofluorimetro.

2. L'etichettatura anticorpi accoppiati a MNPs

  1. Combinare 60 microlitri (3,9 x 10 12 particelle) di MNPs (per condizione) e 5 microlitri (di una soluzione commerciale / ml 200 mg) marcato frammenti Fab, specifiche per l'isotipo della cattura Ab in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
  2. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 30 minuti con miscelazione continua.
  3. Pre-bagnare un concentratore 100K con 300 ml di tampone fosfato (PBS) e centrifuga in una microcentrifuga a 1500 xg per 5 min.
  4. Purificare complessi etichettati sulla 100K colonna. Spin la miscela dal punto 2.2 in una microcentrifuga a 1500 xg per 5 minuti, lavare con 200 microlitri di PBS, e recuperare involume iniziale.

3. Uso di Labeled Ab-MNP Complessi che trattiene le di interesse (virus o EV)

  1. Incubare pre-etichettati MNPs 60 ml (3,9 x 10 12 particelle) con l'HIV (60 ml) o la preparazione EV (100 ml).
    1. Preparare preparati EV utilizzando vari metodi. Qui, purificare i veicoli elettrici su gradienti di saccarosio, raccoglierli dal plasma povero di piastrine utilizzando reagenti exosome precipitazioni o isolare direttamente dal plasma 8.
      NOTA: rapporti ottimali devono essere determinati per ogni esperimento e dipendono dalla concentrazione di virus / EV nella preparazione. Frazione MNP-Ab dovrebbe essere ~ 10 6 in eccesso rispetto alla concentrazione della frazione virus / EV.
  2. Incubare 40 minuti a 37 ° C con miscelazione delicata di virus, o 1 ora a 4 ° C per veicoli elettrici.
  3. Aggiungere 2,5% del mouse IgG / IgG umane per bloccare legame Fc, delicatamente vortice, incubare 3-5 minuti a temperatura ambiente.
  4. Aggiungere concentrazioni produttore raccomandati o titolato di ogni Abs rilevamento e incubare ulteriore 20 minuti a temperatura ambiente.

4. Separazione dei virioni MNP-catturate (o EV) da Unbound Anticorpi utilizzando le colonne magnetiche

  1. Preparare colonna di separazione magnetica ad uso ponendolo in un magnete separatore.
  2. Pre-bagnare la colonna con 500 ml di tampone di lavaggio (2 acido mM etilendiamminotetraacetico (EDTA), 0,5% di albumina sierica bovina (BSA) in PBS). Lasciare che il tampone di lavaggio di fluire attraverso la colonna.
  3. Aggiungere i complessi MNP-virus / MNP-EV alla colonna e lasciare tutto il liquido di fluire attraverso. Aggiungere 500 pl di tampone di lavaggio alla colonna, permettendo l'intero volume di passare attraverso.
  4. lavaggio Ripetere con più tampone di lavaggio 2 volte.
  5. Rimuovere la colonna dal magnete e posto a 12 millimetri x 75 mm tubo per la raccolta dei complessi MNP-virus / MNP-EV trattenuti. Lasciare la colonna nel tubo largo magnete per 3 min. Aggiungere 200 ml di PBS e lasciarele perle scorrono verso il basso per gravità, aggiungere altri 200 ml di PBS, e fissare con 200 pl paraformaldeide 4% dopo eluizione.
    NOTA: Paraformaldeide è un sospetto cancerogeno e deve essere maneggiato in una cappa ventilata e guanti devono essere indossati.
  6. Per quantificare singoli virioni / veicoli elettrici utilizzano le impostazioni volumetrici su High Throughput Sampler (HTS) o solo prima dell'acquisizione aggiungere flusso ben miscelato citometria perle di conteggio.

5. Analisi di virus MNPs-catturati / EV con un citometro di flusso

  1. Warm up citometro di flusso per 30 min.
  2. Run sfere di controllo di qualità.
  3. Impostare la soglia sulla fluorescenza di una MNPs o etichettati virus / EV. Utilizzare 0,22 micron filtrata PBS per la soglia per diminuire il fondo "rumore". Impostare la soglia regolando la tensione PMT al livello in cui filtrata PBS non dà, o pochissimi, eventi.
  4. campioni eseguiti su bassa. (Utilizzare un filtro di 0,04 micron linea aggiuntiva per liquido guaina posto in serie dietro lafiltro guaina 0,2 micron standard per eliminare ulteriormente falsi eventi).

6. Valutazione della cattura efficienza

  1. Cattura veicoli elettrici fluorescente o HIV con MNP-Abs come descritto in 3.1, 3.2. (EV possono essere etichettati o con un colorante a membrana o attraverso il loro carico 15; HIV può essere etichettato tramite colorante gene codificato 16, o con un colorante membrana 12, 17).
  2. Preparare colonna di separazione magnetica come descritto in (4.1-4.2).
  3. Aggiungere i complessi MNP-virus / MNP-EV alla colonna e lasciare tutto il liquido di fluire attraverso (fluire attraverso frazione). Raccogliere il flusso attraverso frazione nel tubo.
  4. Procedere con frazione trattenuta sulla colonna come descritto in (4,4-4,5).
  5. procedura di acquisizione Ripetere il flusso attraverso frazione da 6.3 con successiva separazione (4,1-4,5).
  6. Analizzare le frazioni trattenuti dal primo capture e la seconda cattura da parte loro esecuzione su citometro che è impostato con trigger su etichetta fluorescente dei veicoli elettrici o HIV. Per valutare l'efficienza, confrontare il numero di eventi in entrambe le frazioni.

7. Adattamento del protocollo per compiti specifici

NOTA: Mentre il protocollo può essere applicato all'analisi di HIV e EVs come descritto sopra, per l'analisi di DENV dovrebbero essere introdotte le seguenti modifiche:

  1. Incubare virioni con 1 pM DII al buio per 30 minuti a RT. Dopo incubazione purificare virus tinto mediante centrifugazione in gradiente di densità media (10%, 20%, 25% e 35%) a 240.000 xg per 1,5 ore a 4 ° C senza freno. Raccogliere frazionario compreso tra il 20% e il gradiente di densità 25% strati medi 14.
  2. Incubare DII etichettato DENV 1 x 10 7 (60 microlitri) con concentrazioni quelle raccomandati o titolato di rilevamento Ab in presenza di 2,5% IgG di topo per 20 minuti a RT.
  3. Incubmangiato miscela con pre-etichettati 60 microlitri (3,9 x 10 12 particelle) MNP-cattura complessi Ab per 40 min a 37 ° C con miscelazione delicata.
  4. complessi risultanti separate da Abs non associato colonne magnetici come descritto sopra e analizzare il citofluorimetro.

Risultati

la cattura selettiva di antigeni cellulari da HIV-1 virioni

Con "virometry flusso" è ora possibile visualizzare antigeni cellulari su singole particelle virali. Come esempio, si concentrati su due antigeni cellulari portati da HIV-1, LFA-1 e HLA-DR. In precedenza questi due antigeni sono stati identificati in HIV-1 preparati analizzate alla rinfusa 1. Abbiamo preparato MNPs accoppiato con uno dei anticorpi contro la proteina Env di HIV, VRC01, e catturato con queste MNPs HIV-1 virioni (HIV-1 LAI.04 o HIV-1 SF162 prodotte nelle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC)). Inoltre, abbiamo macchiato queste virioni con 2G12, un altro anticorpo anti-Env. virometry flusso mostrato una elevata eterogeneità di HIV-1 virioni riguardanti la presenza di LFA-1 e HLA-DR. In media 16,7 ± 2,0% (n = 6) e 8,6 ± 0,3% (n = 3) di HIV-1 LAI.04 virioni effettuate LFA-1 e HLA-DR,rispettivamente. Solo 4,8 ± 0,6% (n = 3) di tutti i virioni erano positivi per entrambi gli antigeni. D'altra HIV-1 ceppo, HIV-1 SF162, questi antigeni erano presenti 20,0 ± 4,4% (n = 6) e 10,8 ± 1,3% (n = 6) dei virioni, rispettivamente, mentre entrambi gli antigeni sono state effettuate da 6,5 ± 0,4% (Figura 1).

La distribuzione delle proteine ​​cellulari dipende dagli celle replicate virus. HIV-infetti cellule Jurkat virioni antigenicamente diversi da quelli prodotti da PBMC infettate prodotte. Virioni di HIV-1 LAI 0,4 prodotta dalle cellule Jurkat effettuate 1,6 ± 1,4% (n = 3) e 1,6 ± 0,7% (n = 4) LFA-1 e HLA-DR, rispettivamente. Per l'HIV-1 SF162 virioni prodotte da cellule di Jurkat, tali parametri sono stati 7,2 ± 2,5% (n = 3) e 5,6 ± 2,7% (n = 4). Così, makeup antigenico (almeno per HLA-DR e LFA-1) era diverso per HIV-1 LAI.04 prodotta da due cella differentetipo (p <0.02).

Flusso virometry applicata alla valutazione del virus Dengue

DENV maturazione è associata con l'espressione di proteine ​​PRM sui virioni. Abbiamo applicato virometry flusso di valutare quale frazione di DENV prodotto in BHK-1 e nelle cellule LoVo costituisce virus maturi. Virioni sono state colorate con un colorante lipidico DII. Analisi dei singoli virioni catturati rivelato PRM sul 48,2 ± 5,3% (n = 8) di DENVs. Al contrario, 84,5 ± 3,4% (n = 4) di DENV prodotta in cellule LoVo effettuate PRM. Il resto dei virioni rispettivamente 51,8 ± 5,3% (n = 8) e 15,5 ± 3,4% (n = 4) erano PRM negativo (Figura 2). Così, virometry flusso può essere utilizzato per distinguere pienamente maturo DENV individuale da immaturo (o parzialmente maturi) virioni DENV.

vescicole extracellulari rilasciati nel flusso sanguigno di sanavolontari e pazienti con sindrome coronarica acuta (ACS)

Al fine di indagare diversi sottoinsiemi EV nei pazienti con sindrome coronarica acuta e controlli sani, abbiamo catturato i veicoli elettrici dal plasma povero di piastrine (PPP) per fluorescenti MNPs-accoppiato con anticorpi contro CD31, CD41a, o CD63. EV catturati da CD31-MNPs sono state colorate per CD41a e CD63, veicoli elettrici catturati da CD41a-MNPs sono state colorate per CD31 e CD63, e veicoli elettrici catturati da CD63-MNPs sono state colorate per CD31 e CD41a (Figura 3).

La quantità di veicoli elettrici catturato da CD31-MNPs e positivo per uno o due degli anticorpi di rilevamento nei pazienti con sindrome coronarica acuta era 3.359 [2.328; 5.472] EV / mL rispetto a 1.272 [714; 2.157] EV / ml in volontari sani (p = 0,001). L'importo totale dei veicoli elettrici catturato da CD63 nei pazienti con ACS rispetto ai volontari sani è stato 3.541 [1.318; 5.173] EV / ml vs 806 [488; 2.112] EV / ml (p = 0,007). Ci sono stati 4.752 [3.238; 7.173] EV / ml nel plasma di pazienti con SCA catturati da CD41a-MNPs, mentre nel plasma di volontari sani questo numero era significativamente più basso, 2.623 [1.927; 4.188] EV / ml (p = 0,015). In generale, i nostri risultati indicano che, mentre gli importi EV erano per lo più aumentati nei pazienti ACS, l'entità dell'aumento era diversa nelle diverse sottopopolazioni di veicoli elettrici.

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Figura 1: incorporazione selettivo di antigeni cellulari in HIV-1 virioni replicano in diversi tipi di cellule. HIV (HIV-1 LAI.04 o HIV-1 SF162) virioni rilasciati da PBMC o cellule Jurkat sono stati catturati con VRC01-MNPs e colorate con secondo anticorpo anti-gp120 2G12 e con anticorpi specifici contro l'HLA-DR e LFA-1. Le preparazioni colorate sono stati sottoposti a scorrere analisi per HLA-DR (barre bianche) e LFA-1 (Ba nerors). Significa ± SEM di tre a sei esperimenti 9. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Maturazione stato di virioni DENV. DENV prodotta in cellule BHK-21 (A, B) o in cellule LoVo (C, D) sono stati etichettati con il colorante lipidico DII e, dopo ultracentrifugazione a media densità gradiente, tinto per le proteine PRM con 2H2 anticorpi (A, C) o con IgG2a controllo isotipico (B, D). I virioni etichettati sono stati poi catturati con 3H5-1-MNPs e sottoposti ad analisi di flusso 14. Clicca qui per vedere una versione più grande di questafigura.

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Figura 3: Analisi dei veicoli elettrici da ACS pazienti e controlli sani. EV plasma sono stati catturati con CD31-MNPs, CD63-MNPs o CD41a-MNPs e colorate con anticorpi contro CD41a e CD63, CD31 e CD41a contro e contro, rispettivamente, CD31 e CD63,. EV catturati, macchiate con almeno uno dei Abs rilevazione, sono stati visualizzati e enumerati in analisi di flusso. I dati presentati come diagramma bidimensionale con mediana e range interquartile (IQR). Simboli verdi: volontari sani (controlli), simboli marrone: pazienti con ACS. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Evaluatisulla della frazione di eventi di flusso che rappresentano singoli virioni. (A) HIV-1. Sospensione dei virioni è stato diviso in due parti e macchiato sia con DID (pannello di sinistra) o Dio (pannello centrale). Dopo la miscelazione, la sospensione, che conteneva due virioni differenziale macchiati, è stato catturato con VRC01-MNPs e sottoposto a scorrere virometry (pannello di destra). Aggregati (eventi dual-color) costituivano meno del 10% degli eventi totali. (B - D) DENV. Sospensione di virioni DII-macchiati stato diluito serialmente due volte da 1: 2 a 1: 256 e rilevato con HTS un citometro di flusso (B). DII-DENVs sono stati etichettati con 2H2 anticorpi (C) o DII-DENVs sono stati catturati con 3H5-1-MNPs (D). Preparazioni C e D sono stati poi diluiti due volte da 1: 2 a 1: 256 e acquisiti con HTS 14. Virioni non sembrano aggregare poiché in tutti i casiuna correlazione lineare tra il fattore di diluizione e il numero degli eventi. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Rilevamento di singole particelle di citometro a flusso. sospensione DENV DII macchiato è stato diluito serialmente due volte da 1: 2 a 1: 2.048 e acquisito utilizzando un HTS su un citometro a flusso. (A) Numero di virus rilevati in funzione del fattore di diluizione. (B) intensità di fluorescenza mediana (MFI) del DII etichettati DENV 14. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Valutazione della frazione di virioni e vescicole extracellulari catturati con MNPs accoppiate ad anticorpi specifici. Etichettati HIV-1 virioni o veicoli elettrici sono stati catturati con MNPs accoppiate ad anticorpi specifici e sottoposti a fluire virometry. Dopo separazione su colonne magnetiche, il flusso passante (non mantenuta) frazioni sono stati analizzati per la presenza di virioni o EVs di interesse che sono stati passati al primo passaggio. (A) con etichetta virioni HIV-1 Bal sono stati catturati con 2G12-MNPs (pannello di sinistra). La frazione flow-through è stato ripreso e sottoposto a scorrere virometry (pannello di destra). Nel primo ciclo sono stati catturati circa il 95% dei virioni di interesse. (B) veicoli elettrici con etichetta sono stati catturati con l'anti-CD81 MNPs e isolati su colonne magnetiche (pannello di sinistra). La frazione flow-through è stato ri-catturato e analizzato (pannello di destra). Nel primociclo di circa il 99% delle vescicole di interesse sono stati catturati 8. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

Citometri a flusso convenzionali restano il principale strumento per l'analisi delle celle in base alle loro caratteristiche fisiche e chimiche a livello individuale 18. I principi fondamentali della citometria a flusso non sono state modificate dal suo sviluppo: una cellula che passa attraverso il fascio laser e diffonde la luce costituisce un evento che attiva la registrazione degli spettri fluorescente emessa da anticorpi fluorescenti legati alle cellule. Le particelle più piccole inferiori a 300 nm non possono essere rilevati dalla dispersione lato di un citometro come si disperdono più luce in angoli più grandi in cui la maggior parte citofluorimetro non raccolgono la luce 18. La tecnica qui descritta, consente l'identificazione e l'analisi di antigeni multipli su numerosi virus o EVs singoli da citometri a flusso convenzionali con fluorescenza innesco.

Le fasi critiche all'interno del protocollo sono l'accoppiamento di anticorpi MNPs. I nostri esperimenti sono stati performed utilizzando 15 nanoparticelle di ossido di ferro nm con acido carbossilico come gruppo reattivo come descritto in precedenza 9. Secondo il produttore, ogni 15 nm MNP può associare un massimo di 20 anticorpi; leghiamo a circa 10 anticorpi a 15 nm MNP. Questa stima è basata sulla quantità di anticorpi prima e dopo l'accoppiamento ed il numero di perline / mL misurati mediante caratterizzazione delle nanoparticelle e strumentazione dimensionamento. In linea di principio, l'accoppiamento può causare aggregazione delle particelle ed è indesiderabile. Per verificare che l'aggregazione non sta accadendo con il nostro protocollo, abbiamo verificato questo con la caratterizzazione di nanoparticelle e strumentazione dimensionamento. Questo strumento misura il diametro idrodinamico per le particelle, che comprende i coating e anticorpi strati piuttosto che il nucleo 15 nm soltanto. Abbiamo trovato che la maggior parte delle perline accoppiate si trovano in un unico picco (media picco a 64,7 ± 4,2 nm con il 90% di tutti gli eventi al di sotto 73 ± 7.3 nm). La miscelazione di Ab-MNP complexes con virioni o EVs nella giusta proporzione è importante affinché MNPs sono nella concentrazione di diversi ordini superiori EV / virioni. Questo è fondamentale per garantire che i singoli veicoli elettrici / virioni vengono analizzati. Evitare coincidenze degli eventi eseguendo citometro a basso flusso. Assicurarsi di attivare l'acquisizione da fluorescenza e utilizzare i controlli volumetrici per misurare la concentrazione delle entità catturate.

Tuttavia, MNPs può aggregare EVs o virioni per reticolazione o dal legame di due o più virioni alla stessa nanoparticelle. A questo scopo, un test di aggregazione descritto nella figura 4 deve essere eseguita. virioni o EV Anche catturati singolarmente possono simultaneamente accedere al raggio laser del citofluorimetro. Ciò creerebbe falsa positività per due antigeni diversi. Per evitare questo, il citometro di flusso deve essere impostato come descritto e le preparazioni deve essere diluito. Si può verificare se un caso che sta accadendo utilizzando lo stessostrategia come descritto al punto precedente. Inoltre, la mancanza di coincidenza potrebbe essere verificata analizzando diluizioni seriali del preparato e dimostrando che il numero di eventi diminuisce linearmente con la diluizione, mentre l'intensità di fluorescenza media di un antigene fluorescente macchiato rimane costante in tutte le diluizioni (Figura 5). Un altro problema è che troppo pochi i virus / EV può essere catturato. Questo può essere dovuto al vero scarsità di virus / veicoli elettrici che trasportano gli antigeni attraverso i quali vengono catturati da specifici MNPs. In alternativa, l'efficienza di cattura è bassa a causa di vari motivi (ad esempio, l'accoppiamento inefficiente di anticorpi MNPs, deviazione dai rapporti di MNPs a virioni / EVs sviluppati per questo protocollo, ecc). Per evitare quest'ultima possibilità, l'efficienza di cattura deve essere specificamente valutata. Tipicamente, l'efficienza dovrebbe essere di circa il 90% come in Figura 6.

Diversi anticorpi possono interferire a causa disterico tra di loro o con gli anticorpi accoppiati a MNPs. Per verificare che questo non è accaduto un protocollo di acquisizione inversa deve essere testato (come descritto nella sezione 7. In breve, virioni o veicoli elettrici dovrebbero essere prima colorati con fluorescenza Abs rilevazione e poi catturato dai complessi Ab-MNP con successiva separazione da Abs galleggianti gratis colonne magnetiche.

virometry flusso ha vantaggi significativi rispetto ai metodi esistenti di analisi della composizione antigenica dei virioni o veicoli elettrici. metodi biochimici di routine rapporto sulla presenza generale di particolari proteine ​​nelle preparazioni, ma non forniscono informazioni sulla eterogeneità dei virioni o veicoli elettrici. Questo include immunocattura di virioni o veicoli elettrici su particelle di grandi dimensioni disponibili in commercio. Tali particelle sono tipicamente di alcuni micron di diametro e ciascuno di essi può catturare centinaia o migliaia di virioni o EVs. Pertanto, eventuali medie analisi successive le proprietà dei virioni / EVcatturato da una particella. Al contrario, virometry flusso utilizza MNPs di 10-15 nm di diametro e con il protocollo descritto almeno il 90% degli eventi rappresentare un singolo virione o singola EV.

La limitazione principale è che l'intera popolazione di virioni o veicoli elettrici nella preparazione potrebbe non essere analizzato, ma solo quelli che vengono catturati. Così, la scelta dell'antigene attraverso cui vengono acquisite virioni o EVs diventa critica. Inoltre, a differenza di flusso citometria il numero di antigeni diversi (il numero di anticorpi fluorescenti contro diversi antigeni) è limitata dalla piccola superficie di virioni o EVs. Infine, diversi anticorpi possono stericamente interferire tra loro ancora a causa della piccola superficie (rispetto alle cellule).

L'attuale protocollo può essere adattato per l'analisi di qualsiasi virus o EV di qualsiasi origine, a condizione che gli anticorpi specifici attraverso cui possono essere catturati sono disponibili. Analisi di antigeni sulla virioni individuale permessoricercatori s per affrontare la patogenesi di diverse frazioni di popolazioni virali. Inoltre, l'identificazione dei singoli veicoli elettrici nel plasma può consentire di risalire all'origine dei veicoli elettrici a particolari cellule e di riferire sulle condizioni normali o patologiche di queste cellule e gli organi in cui risiedono.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro di AA, SZ, WF, J-C. G, e LM è stato supportato dal programma intramurale NICHD. Il lavoro di MV è stato sostenuto dalla sovvenzione governativa della Federazione Russa #14.B25.31.0016.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materials
Kit di coniugazione di nanoparticelle di ossido di ferro magnetico carbossilico OceanNanotechICK-15-005
Unità filtrante centrifuga Amicon Ultra-4 con membrana Ultracel-100MilliporeUFC810024
Provetta in PP a fondo tondo da 5 ml, senza tappoFalcon352002
trattato DEPC Qualità dell'acquaBiologica 351-068-131
Separatore magnetico SuperMAG-01 Ocean NanotechSuperMAG-01
Zenon R-Ficoeritrin Topo IgG1  Kit di etichettaturaThermo Fisher ScientificZ25055
Dispositivi centrifughi Nanosep con membrana Omega 100kPall CorpOD100C34
EDTA 0,5 MCorning Cellgro46-034-CI
Soluzione di albumina sierica bovinaSigma-AldrichA9576-50ML
PBSGibco10010-23
Paraformaldeide, grado EM, EMS purificato15710
123 conteggi eBeads eBioscience01-1234-42
Perline CytoCountDakoS2366
Perline di conteggio AccuCheckCitometro InvitrogenPCB100
Configurazione e configurazione Kit di perline di tracciamento (CST)BD Bioscience642412
Vybrant DiI Soluzione di etichettatura cellulareThermo Fisher ScientificV22885
NomeCompanyNumero di catalogoComments
Equipment
µ Colonna MACS Miltenyi Biotec130-042-701
OctoMACS Magnete separatoreMiltenyi Biotec130-042-108
NanodropThermoFishernessuno
NanoSight NS300Malvernnessuno
BD LSRII citometro a flussoBD Biosciencenessuno
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Software
Flowjo softwareFlowjo
BD FACSDiva softwareBD

Riferimenti

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