Cervello metastasi è diventato un bisogno medico non soddisfatto urgente come la sua incidenza è aumentata mentre le opzioni terapeutiche sono rimaste palliative. La creazione di modelli animali sperimentali di metastasi cerebrali tramite iniezione arteriosa intracarotidea delle cellule tumorali facilita gli studi meccanicistici della biologia della malattia e la valutazione dei regimi di intervento innovative.
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Articolo metodologico
Intracarotidea Cancer Cell iniezione per produrre modelli murini di cervello Metastasi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Metastasi, la diffusione e la crescita di cellule maligne nei siti secondari all'interno del corpo di un paziente, rappresenta> 90% della mortalità per cancro. Recentemente, impressionanti progressi nelle nuove terapie hanno notevolmente prolungato la sopravvivenza e una migliore qualità della vita per molti malati di cancro. Purtroppo, l'incidenza di recidive cerebrali metastatici sta rapidamente crescendo, e tutte le terapie attuali sono solo palliativi. Quindi, buoni modelli sperimentali animali sono urgentemente necessari per facilitare studi approfonditi della biologia della malattia e per valutare nuovi regimi terapeutici per la valutazione preclinica. Tuttavia, lo standard di test metastasi vivo tramite coda vena iniezione delle cellule tumorali produce prevalentemente lesioni metastatiche del polmone; animali in genere soccombono alla massa tumorale del polmone prima di qualsiasi conseguenza significativa delle metastasi cerebrali. Intracardiaca iniezione di cellule tumorali produce lesioni metastatiche a più siti di organi compreso il cervello; tuttavia, la variabilità della crescita tumorale prodotto con questo modello è grande, smorzando la sua utilità nella valutazione dell'efficacia terapeutica. Per generare modelli animali affidabili e coerenti per lo studio metastasi cerebrali, qui si descrive una procedura sperimentale per la produzione di metastasi cerebrali in casa del mouse (Mus musculus) tramite iniezione intracarotidea delle cellule tumorali. Questo approccio permette di produrre gran numero di topi di metastasi cerebrali-cuscinetto con simili caratteristiche di crescita e di mortalità, facilitando in tal modo gli sforzi di ricerca per lo studio dei meccanismi biologici fondamentali e per valutare nuovi agenti terapeutici.
Introduzione
La metastasi del cancro al sistema nervoso centrale (SNC) è una malattia devastante, e può comportare l'parenchima cerebrale o le leptomeningi ( "metastasi cerebrali" si riferisce sia in questo articolo). E 'il tumore intracranico predominante, superando in numero gliomi primari per> 10: 1 1, 2. Il cancro del polmone, il cancro al seno, e il melanoma sono i primi tre principali malattie neoplastiche che producono alta incidenza di metastasi cerebrali 3, 4. Negli ultimi anni, notevoli progressi nelle nuove terapie per il cancro sono notevolmente prolungato la sopravvivenza e una migliore qualità della vita per molti malati di cancro. Tuttavia, sulla recidiva, l'incidenza di metastasi cerebrali è in rapido aumento. Ad esempio, il trastuzumab anticorpo anti-HER2 (trastuzumab) ha dimostrato notevole efficacia clinica nei pazienti con carcinoma mammario HER2 +; ancora una preoccupante tendenza è emersain questi pazienti: fino a 1/3 di coloro la cui extracranica malattia sistemica inizialmente beneficiato di un trattamento con trastuzumab successivamente sviluppare metastasi cerebrali 5, 6, 7. Purtroppo, i pazienti con metastasi cerebrali sono refrattari a quasi tutte le attuali trattamenti, di solito sperimentare un deterioramento traumatica della qualità della vita, e la loro sopravvivenza a un anno dopo la diagnosi è solo ~ 20% 8. Le attuali terapie per metastasi cerebrali (compresi gli steroidi, la radioterapia cranica, e la resezione chirurgica nei pazienti selezionati) sono solo palliative, non curativo 9. Pertanto, metastasi cerebrali sta emergendo come la prossima sfida imponente in questa epoca di nuove terapie del cancro. Per affrontare la sfida insoddisfatti i pazienti devono affrontare ogni giorno nella clinica, abbiamo urgente bisogno di capire meglio il meccanismo alla base di metastasi cerebrali e usare questa conoscenza per sviluppare nuove terapie.
colonizzazione successo del cervello da cellule tumorali metastatiche richiede prestazioni di una serie di funzioni mediate dall'interazione intricata di più giocatori biologici, come il bypass della barriera ematoencefalica (BBB) e la fuga dal cervello di intrinseca meccanismi di difesa immunitari 10, nessuna delle quali si riassume in un ex vivo o in vitro sistema. Quindi, la corretta e fedele a modelli in vivo sono fondamentali per gli studi di metastasi cerebrali. Un convenzionale nel test in vivo metastasi introduce le cellule tumorali mediante iniezione vena della coda, che porta la maggior parte delle cellule di rimanere incastrati nel polmone. Lesioni metastatiche cerebrali sono raramente prodotte in questi modelli animali prima della morte causata da carico tumorale nei polmoni 11. iniezione diretta intracerebrale di cellule tumorali produce escrescenza tumorale consistente nel SNC ed è ampiamente usato in studi di gliomi primari. Tuttavia, siniezione uch compromette la BBB e provoca lesioni traumatiche al sito di iniezione, entrambi i punti principali di preoccupazione per quanto riguarda la rilevanza fisiologica di questo modello. Un altro uso frequente percorso introduzione delle cellule del cancro, iniezione intracardiaca, è facile da amministrare e che produce metastasi sperimentale al sistema nervoso centrale. Tuttavia, le metastasi simultanee a siti di organi diversi da quelli del sistema nervoso centrale sono sempre prodotte e possono causare la mortalità degli animali 11; Pertanto, l'elevato grado di variabilità di questo modello rende appropriati per la valutazione quantitativa dei meccanismi biologici o agenti terapeutici con un numero limitato di animali.Qui si descrivono le procedure per la produzione sperimentale metastasi cerebrali tramite l'iniezione di cellule tumorali in arteria carotide comune. Abbiamo usato questo approccio per sezionare i contributi singoli geni 'alla cascata metastatica di metastasi cerebrali e per valutare l'efficacia di un intervento terapeuticos 12, 13. I principali vantaggi di questo approccio sono l'elevato grado di riproducibilità e basso grado di variabilità; Lo svantaggio principale è la sofisticazione e la destrezza necessaria per eseguire la microchirurgia.
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Protocollo
dichiarazione etica: Tutti gli studi su animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale animali (IACUC) della University of Texas MD Anderson Cancer Center.
1. Preparare cellule tumorali per iniezione
- Seme le cellule tumorali uno o due giorni prima dell'iniezione. Utilizzare DMEM / F12 supporti supplementato con 10% FBS, a meno che un mezzo specialità è indicato in letteratura per una particolare linea cellulare.
- Il giorno dell'intervento chirurgico, cellule raccolto quando raggiungono 70 - 80% di confluenza dal primo lavaggio con mezzi senza siero volta prima tripsinizzazione (0,25%) per 1 - 2 min a 37 ° C. Aggiungere in cellule 10% FBS contenenti DMEM media / F12 per placare la tripsina 0,25%.
- Centrifugare le cellule a 80 g per 3 min. Lavare le cellule in mezzi privi di siero due volte per rimuovere siero residuo, contare le cellule con un emocitometro e risospendere in soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a 1 - 5 × 10 6 cellule / ml, a seconda della linea cellulare. Tenere in ghiacciofino al momento dell'iniezione.
NOTA: MDA-MB-231 cellule del cancro al seno e le cellule di melanoma K1735 sono stati utilizzati in questo studio, ed entrambe le linee cellulari sono stati utilizzati a 2 × 10 6 celle concentrazione / ml. Mantenere la durata tripsinizzazione più breve possibile come trattamento eccessivo può influenzare i risultati del test di metastasi.
2. Preparare topi per tumore delle cellule iniezione
- Anestetizzare topi intraperitoneale (ip) iniezione di ketamina / xilazina cocktail (ketamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
- Confermare l'anestesia completa pizzicando i piedi degli animali e di osservare la mancanza di risposta.
- Posizionare il mouse su una lastra di vetro (utilizzato per la fusione gel proteici), e fissare con elastici.
- Se necessario, rimuovere i peli del collo con la rasatura o l'applicazione di una piccola quantità di prodotto di rimozione dei capelli e asciugandosi i capelli fuori con un tovagliolo di carta. NOTA: Se si utilizza topi nudi, saltare questo passaggio in quanto non hanno peli sul corpo.
- Pulire la pelle del collo applicandopovidone-iodio e il 70% di alcol.
- Posizionare il mouse sul palco del microscopio da dissezione
- Fare un'incisione nella pelle ~ 1 cm di lunghezza con un bisturi chirurgico.
- Senza mezzi termini sezionare il muscolo con una pinza dentata per esporre la carotide sotto.
- Separare l'arteria carotide dal nervo vago adiacente con pinza chirurgica.
- Utilizzando pinze chirurgiche, separare un batuffolo di cotone da un batuffolo di cotone, inumidire, e la moda in un batuffolo di cotone più piccola. Inserire questo batuffolo di cotone tampone-idratata sotto la carotide del sito previsto per l'iniezione.
- Posizionare un distale e prossimale di sutura per il batuffolo di cotone e fare nodi sciolti. Stringere il nodo prossimale per bloccare il flusso di sangue nel sito di iniezione.
- Procedere alla iniezione di cellule di cancro se la carotide sul batuffolo di cotone appare completamente pressurizzato con sangue rosso fresco.
3. Cancer Cell iniezione in carotide
- Vortex e disegnare 100 ml ocellule tumorali f nella siringa.
- Al microscopio da dissezione, inserire lentamente il 31 ago G (con bisello alto) nel lume dell'arteria carotide seduto sulla cima del batuffolo di cotone.
- Iniettare lentamente le cellule dalla siringa nella carotide. iniezione di successo può essere osservata al microscopio dal colore cambiando dei vasi sanguigni vicini e muscolatura quando le cellule tumorali buffered vengono spinti nella circolazione.
- Quando l'iniezione dell'intero volume è completa, sollevare l'arteria carotide distale delicatamente per evitare rigurgito.
- stringere rapidamente il nodo distale per completare il processo di iniezione.
- Dopo aver completato l'iniezione, serrare le legature e tagliare la sutura di seta in eccesso con micro-forbici sotto il microscopio da dissezione. Spostare indietro il muscolo separato per coprire la ferita. Chiudere la pelle con due punti metallici.
4. recupero chirurgico
- Spostare l'animale operato su una piastra elettricaper il recupero. Si può prendere 30-60 minuti per gli animali a riprendere conoscenza. Nel frattempo, amministrare buprenorfina (0,05 mg / kg) per via sottocutanea come analgesia post-chirurgica. Nota: L'analgesia deve essere fornito secondo il vostro IACUC locale approvato protocollo.
- Una volta che gli animali si svegliano e riprendono il loro comportamento normale, restituire i topi alla loro posizione abitazioni. Fornire i topi con il cibo in gel per diversi giorni dopo l'intervento chirurgico. Mantenere un record chirurgica e tenerlo nella stanza.
5. non invasiva In Vivo Imaging
- Per le cellule marcate con costrutti reporter luciferasi, misurare l'efficienza di iniezione delle cellule tumorali utilizzando in vivo sistema di imaging 14.
NOTA: Imaging non viene eseguita il giorno di iniezione per evitare eccessive sollecitazioni agli animali di ricerca.
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Risultati
Ci sono due punti in cui la qualità di iniezione può essere valutata. La prima occasione è per l'osservazione dell'operatore di cambiare i colori dei vasi sanguigni durante l'iniezione. Perdite da iniezioni poveri può essere facilmente osservata al microscopio da dissezione. Il posizionamento stabile e sicuro del corpo del mouse (Figura 1A) e la sua arteria carotidea (Figura 1B) sul batuffolo di cotone di supporto sono fattori critici per ini...
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Discussione
Le fasi più critiche per successo iniezione arteriosa carotidea delle cellule tumorali sono: 1) anestesia profonda di topo in preparazione per il funzionamento chirurgico; 2) il posizionamento stabile della carotide sulla sommità del supporto di cotone; 3) stretto legatura dell'arteria carotide dopo l'iniezione di successo.
anestesia profonda di ~ 30 minuti è di solito necessario per le prestazioni chirurgiche costante sotto il microscopio da dissezione. Usiamo cocktail di ketamina /...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori non hanno riconoscimenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di ketamina cloridrato/xilazina cloridrato | Sigma-Aldrich | K113 | |
| Stereomicroscopio di routine Leica M50 | Leica | M50 | Il microscopio è modulare e altamente configurabile per adattarsi a particolari esigenze di spazio. |
| Scapel chirurgico monouso | Integra Miltex | 4-410 | per praticare incisioni cutanee |
| Pinze per tessuti - 1 x 2 denti | Strumenti di scienza fine | 11021-12 | per sezionare senza mezzi termini i muscoli |
| Dumont #5 - Pinze con finitura a specchio | Strumenti di scienza fine | 11252-23 | per separare e preparare l'arteria carotide per l'iniezione |
| Forbici a molla | Strumenti di scienza fine | 15025-10 | per tagliare le suture |
| EZ Clip Kit | Stoelting | 59020 | per chiusura delle ferite |
| Siringa da insulina BD | Becton Dickinson | 328438 | per iniezione cellulare |
| IVIS Spectrum In Vivo Sistema di imaging | PerkinElmer | 124262 |
Riferimenti
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