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Articolo metodologico

Isolamento rapido di BMPR-IB + derivate da tessuto adiposo cellule stromali per l'uso in un cranica difetto di guarigione Modello

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DOI:

10.3791/55120

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24 febbraio 2017

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1Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine, Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Le cellule stromali derivate dal tessuto adiposo possono essere utili per ingegnerizzare nuovi tessuti dalle cellule di un paziente. Presentiamo un protocollo per l'isolamento di una sottopopolazione di cellule stromali umane di derivazione adiposa (ASC) con aumentato potenziale osteogenico, seguito dall'applicazione delle cellule in un saggio di guarigione calvariale in vivo.

Abstract

Tumori invasivi, lesioni gravi e infezioni possono causare difetti ossei troppo grandi per essere ricostruiti con osso preesistente dal corpo del paziente. La capacità di far crescere l'osso de novo utilizzando le cellule di un paziente consentirebbe di riempire i difetti ossei con tessuto adeguato senza la morbilità del prelievo di osso nativo. C'è interesse per l'uso di cellule stromali di derivazione adiposa (ASC) come fonte per l'ingegneria tissutale perché queste sono ottenute da una fonte abbondante: il tessuto adiposo del paziente. Tuttavia, le ASC sono una popolazione eterogenea e alcune sottopopolazioni possono essere più efficaci in questa applicazione rispetto ad altre. L'isolamento della popolazione più osteogenica di ASC potrebbe migliorare l'efficienza e l'efficacia di un processo di ingegneria ossea. In questo protocollo, gli ASC sono ottenuti da tessuto adiposo sottocutaneo di un donatore umano. La sottopopolazione di ASC che esprimono il marcatore BMPR-IB viene isolata utilizzando FACS. Queste cellule vengono quindi applicate a un test di guarigione del difetto calvariale in vivo e si è scoperto che hanno un potenziale rigenerativo osteogenico migliorato rispetto alle cellule non selezionate.

Introduzione

I principali difetti ossei derivanti da lesioni, infezioni o cancro invasivo hanno un impatto significativo sul recupero e la qualità della vita del paziente. Le tecniche esistono per riempire questi difetti con ossa sane da altrove nel corpo del paziente, ma questo trasferimento porta proprio la morbilità e il rischio di complicazioni 1, 2, 3. Inoltre, alcuni difetti sono così grandi o complessi che sufficiente osso donatore non è disponibile per riempire il difetto. Dispositivi protesici sono una possibile opzione per il riempimento di difetti ossei, ma questi sono associati con diversi svantaggi, tra cui il rischio di infezione, guasti hardware, e la reazione da corpo estraneo 4.

Per questi motivi è grande interesse per la possibilità di ingegneria sostituti ossei biologici utilizzando cellule 5 del paziente. cellule stromali derivate da tessuto adiposo (ASC)hanno un potenziale per questa applicazione perché sono abbondantemente disponibili in proprio tessuto adiposo del paziente e hanno dimostrato la capacità di guarire difetti ossei generando nuovo tessuto osseo 6, 7. ASC sono una popolazione eterogenea di cellule e diversi studi hanno dimostrato che la selezione per specifici marcatori di superficie delle cellule in grado di produrre popolazioni di cellule con una maggiore attività osteogenica 8, 9. Selezione ASC con il più alto potenziale osteogenico aumenterebbe la probabilità che uno scaffold seminati con queste cellule potrebbe rigenerare un grande difetto osseo.

Proteina ossea morfogenetica (BMP) segnalazione è critica nel regolare differenziazione ossea e la formazione 10 e il tipo BMP Receptor IB (BMPR-IB) è noto per essere importante per osteogenesi in ASC 11. Recentemente, abbiamo dimostrato che l'espressione di BMPR-IB può be consente di selezionare per le ASC con una maggiore attività osteogenica 12. Qui mostriamo un protocollo per l'isolamento di BMPR-IB-esprimendo ASC dal grasso umano seguita da un saggio della loro attività osteogenica utilizzando un vivo cranica modello di difetto.

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Protocollo

NOTA: I campioni sono stati ottenuti da pazienti che hanno dato il consenso informato. Tutti i protocolli sono stati esaminati e approvati dal appropriata Stanford University Institutional Review Board. Durante la manipolazione dei tessuti e delle cellule umani, sempre aderire al livello di biosicurezza 2 (BSL2) le precauzioni, come specificato dal proprio istituto.

1. Preparazione dei reagenti

  1. Preparare tampone FACS: aggiungere 10 ml di FBS, 5 ml Polossamero 188 e 5 ml Pen-Strep a 500 ml di soluzione fisiologica sterile tampone fosfato (PBS).
  2. Preparare digerire miscela: Aggiungi 0.375 g C. hemolyticum tipo collagenasi II in polvere e 5 ml Polossamero 188 a 500 ml sterile 199 / EBSS medie.
  3. Preparare mezzo standard: aggiungere 50 ml di FBS e 5 ml Pen-Strep per Modified Eagle Medium di 500 ml Dulbecco.

2. Raccolta e Isolamento di ASC

NOTA: Assicurarsi che adeguate approvazioni istituzionali sono in atto per l'utilizzo di tessuti umani e per isolare hLe cellule staminali Uman. Ottenere addominale umana, affiancare, o coscia grasso sottocutaneo da un donatore sano fase di liposuzione elettiva. Mantenere il grasso in un contenitore di plastica di aspirazione.

  1. Aggiungere PBS sterile in un rapporto 1: 1 per il grasso nel contenitore in plastica originale. (Se non vi è 500 grasso ml, aggiungere 500 ml di PBS). Mescolare delicatamente agitazione per 30 s. Lasciare la fase acquosa di depositarsi sul fondo (figura 1) e poi aspirare e scartare lo strato acquoso con una pipetta 10 mL plastica applicata aspirazione.
  2. Decantare il grasso in un contenitore di plastica grande e aggiungere digerire miscela in un rapporto 1: 1. Chiudere il contenitore e pulire l'esterno con il 70% di etanolo. Sigillare il tappo con la pellicola di paraffina.
  3. Agitare il contenitore in un agitatore orbitale a 180 rpm a 37 ° C per 30 min.
  4. Neutralizzare la digestione aggiungendo mezzo standard in un rapporto 1: 1. (Se non vi è 1.000 miscela di grassi ml, aggiungere 1.000 ml medie standard).
  5. Distribuire il composto in parti uguali in un numero pari di 250 mL plastica provette coniche da centrifuga e centrifugare la miscela a 300 xg per 20 minuti a 4 ° C.
  6. Aspirare il surnatante e fare attenzione a lasciare intatto il pellet. pellet Risospendere in 5 ml di medio standard per ciascun tubo conico.
  7. Filtrare la sospensione attraverso un filtro da 100 micron in un tubo da 50 ml centrifuga. Poi, centrifugare a 300 xg per 15 min a 4 ° C.
  8. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml di temperatura ambiente tampone di lisi RBC. Lasciare il composto riposare per 5 min a temperatura ambiente quindi si centrifuga a 300 xg per 15 min a temperatura ambiente (RT).
  9. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 15 ml di media standard. Ancora filtrata attraverso un filtro da 100 micron in 50 mL provetta conica.
  10. In un nuovo 50 ml conica, aggiungere 15 ml di soluzione polysucrose progettata per la separazione di densità-based (vedi elenco dei reagenti). Quindi, tenendo il tubo con un angolo di 45 °, pipettatura le cellule sul latoil tubo in modo che la sospensione cellulare delicatamente strati sulla parte superiore della soluzione polysucrose (Figura 2).
    NOTA: È importante cellule pipetta sulla superficie della soluzione. Non aggiungere soluzione polysucrose ad una sospensione di cellule in quanto ciò crea una miscela irreversibile. Analogamente, non pipettare le cellule al centro della soluzione polysucrose.
  11. Centrifugare questa miscela a 300 xg per 10 min a RT. Utilizzare bassa accelerazione (2 - 3 su 10) e impostare la funzione di freno della centrifuga a zero per questo passo.
    NOTA: Tre strati saranno visibili: chiara sul fondo, nuvoloso nel mezzo, e color salmone sulla parte superiore. Lo strato intermedio contiene le cellule di interesse.
  12. Usando una pipetta mL 10 rimuovere con cautela lo strato intermedio e il trasferimento ad un nuovo tubo da 50 ml.
    NOTA: E 'meglio trasferire completamente lo strato intermedio e nel processo prendere alcuni degli strati superiore e inferiore rispetto a lasciarsi alle spalle alcuni lo strato centrale.
  13. Contare le cellule utilizzando un emocitometro e determinare il numero totale di cellule vive.
    NOTA: Usiamo tipicamente blu trypan aggiunto alla miscela di cellule ad una concentrazione finale di 0,8% per aiutare nella conteggio delle cellule. Vitali cellule vive non prenderanno il colorante blu e appariranno bianco.

3. FACS ordinamento per BMPR-IB Cellule positive e preparazione di scaffold cellulari contenenti

  1. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Risospendere le cellule in tampone FACS ad una concentrazione di 1 milione di cellule per 100 microlitri (in base al conteggio delle cellule fatto nel passaggio 2.13).
  2. Trasferimento di almeno 10 milioni di cellule in una provetta da centrifuga di plastica con l'etichetta "BMPR-IB." Separatamente, il trasferimento di un milione di cellule in 100 microlitri di buffer FACS di un tubo da centrifuga di plastica separato con l'etichetta "senza macchia". Aggiungere 1 ml FACS buffer per il tubo "senza macchia". Mantenere il resto delle cellule in tampone FACS sul ghiaccio mentre le FACS ordinamento porzione del experiment è stato fatto. Etichettare queste cellule "non scelti". Utilizzare questi come controlli successivamente nell'esperimento.
  3. Aggiungere una quantità appropriata di un anticorpo BMPR-IB antiumano fluorescente al tubo "BMPR-IB" secondo le istruzioni del produttore. Pipettare la miscela su e giù delicatamente per distribuire l'anticorpo.
    NOTA: Usiamo un Umano BMPR-IB / ALK-6 Anticorpo APC-coniugato ad una diluizione 1:10 (vedi elenco di reagenti per i dettagli). Tuttavia, gli anticorpi di diversi produttori avranno diverse concentrazioni consigliate.
  4. Coprire il secchio di ghiaccio in un modo che mantiene la luce. Lasciare il composto cellule / anticorpo riposare per 30 min (o secondo le istruzioni del produttore anticorpi).
    NOTA: Se l'anticorpo anti-BMPR-IB viene come un anticorpo coniugato primario che richiede un anticorpo secondario, eseguire una fase di colorazione separata su ghiaccio con l'anticorpo secondario secondo le istruzioni del produttore.
  5. Centrifugare entrambi i tubi a300 xg per 5 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non aspirare il pellet. Risospendere le cellule pellet in 1 mL di tampone FACS. Anche in questo caso centrifugare le provette a 300 xg per 5 min. attenzione aspirare il surnatante e risospendere le cellule in tampone FACS ad una concentrazione di 1 milione di cellule per 1 ml.
  6. Filtrare il "BMPR-IB", "senza macchia", e "le cellule non scelti" attraverso 40 micron filtri cellulari in nuovi tubi di vetro FACS etichettati. Sciacquare i filtri con 500 microlitri di buffer FACS per assicurare che le cellule non sono lasciati alle spalle nel filtro. Anche aggiungere 2 ml di medio standard per due provette da centrifuga di plastica separati etichettati "BMPR-IB-positivo" e "BMPR-IB-negativo." Utilizzare questi due per raccogliere le cellule ordinati nella macchina FACS.
  7. Sulla macchina FACS, utilizzare le cellule non colorate per definire un cancello negativo per il marcatore fluorescente.
  8. Utilizzando un ugello di 100 micron, di ordinamento BMPR-IB cellule positive e negative nelle rispettive provette della truffacontenente medie standard. Mantenere questi tubi raffreddati a 4 ° C durante l'ordinamento se la macchina FACS ha questa capacità.
    NOTA: Si prega di fare riferimento all'articolo 13 JOVE da Sharon et al. per un protocollo ottimo per FACS ordinamento.
  9. Utilizzando un emocitometro, contare le cellule in ciascun tubo. Centrifugare la "BMPR-IB-positivo", "BMPR-IB-negativo" e "tubi" non scelti a 300 xg per 5 minuti a 4 ° C e aspirare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Poi risospendere le cellule in terreno standard ad una concentrazione di 1 milione di cellule per 250 ml.
  10. Ottenere ponteggi rivestite con idrossiapatite pre-tagliate quattro millimetri PLGA (poli [acido lattico-co-glicolico]). Posizionare ogni impalcatura in un pozzo di una piastra da 24 pozzetti. Coprire ogni scaffold con 50 ml di sospensione cellulare da uno dei tre gruppi (i .e, 200.000 celle.): Unsorted, BMPR-IB-positive, e BMPR-IB-negative (figura 3).
    NOTA: Si prega diconsultare l'articolo JOVE 14 da Lo et al. Per i dettagli sulla costruzione di ponteggi PLGA.
  11. Riempire parzialmente circostanti pozzetti vuoti con medie standard (per evitare essiccazione dei ponteggi), ricoprono la piastra con il coperchio, e incubare in un incubatore di coltura cellulare a 37 ° C per 30 min.

4. Creazione di difetti cranica e l'applicazione di ACS contenenti Ponteggio

NOTA: assicuratevi che adeguate approvazioni istituzionali sono in atto per la creazione di difetti cranica in topi vivi. Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa la Stanford University.

  1. Anestetizzare un CD-1 topo nudo utilizzando sia inalato gas isoflurano o un iniettato lunga durata d'azione cocktail anestetico.
    1. Per utilizzare solo gas, posizionare il mouse in una camera anestesia e avviare il flusso di ossigeno a 2 - 3 l / min con una concentrazione del 2% di isoflurano. Una volta che il mouse è fully incoscienza, posizionarlo prono su una calda coperta di acqua di ricircolo con un tampone assorbente e mettere il muso in un cono anestesia con la stessa concentrazione di ossigeno e isoflurano. Monitorare attentamente la frequenza respiratoria e regolare la concentrazione di isoflurano, se necessario.
    2. Per utilizzare un iniettato azione prolungata cocktail anestetico anestetizzare il mouse in una camera di anestesia come descritto sopra e poi iniettare il cocktail anestetico. Rimuovere il mouse dalla camera di anestesia e osservare il suo comportamento.
      NOTA: Il mouse può brevemente emergere dall'anestesia ma in pochi minuti dovrebbe essere ancora completamente anestetizzato sotto l'effetto dell'anestetico iniettato. Trasferire il mouse per una calda coperta di acqua di ricircolo coperto con un tampone assorbente.
      NOTA: Per un cocktail anestetico, si consiglia una miscela contenente ketamina 10 mg / mL e xilazina 1 mg / ml in soluzione fisiologica, consegnato per via intraperitoneale. La dose standard di questa miscela è300 microlitri di 30 g del mouse, il che equivale a ketamina 100 mg / kg e xilazina 10 mg / kg. Vedi la sezione di discussione per ulteriori dettagli riguardanti l'anestetico iniettabile.
    3. Utilizzare una manovra punta pizzico di determinare la profondità dell'anestesia. Un mouse adeguatamente anestetizzato non rientra la zampa quando è leggermente schiacciato dal chirurgo.
    4. Applicare unguento oculare per prevenire l'essiccamento della cornea.
    5. Somministrare 1 mg / kg per via sottocutanea di buprenorfina SR.
      NOTA: fornire l'analgesia prima ai risultati di chirurgia nella riduzione del dolore superiore.
    6. Durante l'intera procedura, monitorare la frequenza respiratoria del mouse.
      NOTA: Un mouse adeguatamente anestetizzato sotto isoflurano dovrebbe avere una frequenza respiratoria di 50 - 100 respiri / min. Un aumento della frequenza respiratoria indica che l'anestesia è troppo leggero, mentre una diminuzione della frequenza respiratoria può indicare che l'anestesia è troppo profondo.
  2. Preparare la pelle della parte dorsale del cranio con povidone-IODsoluzione ine seguito da etanolo al 70% per tre volte. Telo con teli sterili, lasciando il sito chirurgico esposto.
    NOTA: Indossare guanti chirurgici sterili e mantenere una tecnica sterile durante la procedura. Solo toccare le superfici sterili e oggetti, come il telino sterile e gli strumenti in autoclave. Avere un assistente regolare l'illuminazione, i pacchetti di sutura aperti, etc.
  3. Usando un bisturi 15-lama, fare una incisione mediana sagittale che si estende sulla maggior parte del cranio dorsale. Utilizzando una pinza sottile dentate, ritrarre la pelle sul lato destro dell'incisione per esporre destra osso parietale.
  4. Utilizzando un trapano con una punta da trapano 4 millimetri trapano diamantata autoclave, praticare un difetto attraverso l'osso parietale. Non estendere il difetto passato osso nello strato di dura madre. (Figura 4)
  5. Mettere un ponteggio nel difetto, e quindi chiudere l'incisione cutanea con l'esecuzione di sutura in nylon.
  6. Monitorare il mouse e fornire standard di assistenza post-operatoria di unecondo le linee guida istituzionali.
    1. Tenere il mouse su un tovagliolo di carta pulito all'interno di una gabbia pulita mentre si recupera. Una metà della gabbia deve essere collocato sopra una calda coperta ricircolo acqua e il mouse deve essere inizialmente collocato in questo mezzo.
    2. Non lasciare incustoditi un mouse fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per deambulare. Non restituire un mouse che ha subito un intervento chirurgico per una gabbia con altri topi finché non è completamente recuperato.
  7. Ripetere i passaggi precedenti con un nuovo mouse per ogni scaffold che deve essere testato. Sterilizzare gli strumenti chirurgici tra interventi chirurgici utilizzando uno sterilizzatore a caldo tallone o altro metodo adeguato.
  8. Poco dopo la procedura, e poi a 2, 4, 6, e 8 settimane, utilizzare la scansione micro CT per analizzare il tasso di chiusura del difetto cranica.
    NOTA: Vedere l'articolo di Levi et al. 6 per una descrizione di TAC micro difetti cranica.
  9. Quando l'esperimento è complete, eutanasia i topi mettendoli in una camera eutanasia pulito e iniziare un flusso di anidride carbonica nella camera ad una velocità di 2 L / min. Dopo respirazioni hanno cessato completamente (dopo circa 10 min) eseguire dislocazione cervicale per confermare l'eutanasia.
  10. Facoltativamente, dopo l'esperimento è completa, l'uso di sezionamento e colorazione istologica di valutare formazione ossea all'interno del difetto.
    NOTA: Vedere l'articolo di McArdle et al. 12 per i dettagli della preparazione ossea campioni per esame istologico. Per una rassegna di tecniche istologiche e di colorazione, consultare un manuale istologico, come il Manuale di Patologia Chirurgica 15.

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Risultati

Micro TAC eseguita il giorno della chirurgia mostrerà chiaramente il difetto cranio. A questo punto non vi sarà alcuna ricrescita nel difetto 4 mm. scansioni successive vengono ottenuti nel tempo di quantificare l'entità del difetto nel tempo rispetto al basale. Difetti seminati con cellule BMPR-IB + dovrebbero dimostrare più rapida chiusura del difetto se confrontato con BMPR-IB e le cellule non scelti (Figura 5). Inoltre, la porzione del cranio contenente il difett...

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Discussione

I passaggi critici all'interno del protocollo

Durante la raccolta di ASC, la fase critica è adeguata digestione dei grassi con collagenasi. digestione inadeguata si tradurrà in una bassa resa di ASC. Durante FACS ordinamento delle cellule BMPR-IB +, è importante definire con precisione il cancello per positività. Definire cancelli troppo debolmente può causare popolazioni ordinati che non sono puri. Durante la creazione del difetto cranica, è fondamentale per perforare il difetto attraverso...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcuna divulgazione da fare.

Ringraziamenti

C.D.M. è stato supportato dalla borsa di studio per la ricerca residente dell'American College of Surgeons (ACS). M.S.H. è stato supportato dalla borsa di formazione Clinical Fellow del California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) TG2-01159. M.S.H., H.P.L. e M.T.L. sono stati sostenuti dall'American Society of Maxillofacial Surgeons (ASMS)/Maxillofacial Surgeons Foundation (MSF) Research Grant Award. H.P.L. è stato sostenuto dalla sovvenzione NIH R01 GM087609 e da un dono di Ingrid Lai e Bill Shu in onore di Anthony Shu. H.P.L. e M.T.L. sono stati supportati dall'Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine e dalla Oak Foundation. M.T.L. è stato supportato dalle sovvenzioni NIH U01 HL099776, R01 DE021683-01 e RC2 DE020771. DCW è stato supportato dalla sovvenzione NIH 1K08DE024269, dall'Hagey Laboratory for Pediatric Regenerative Medicine e dallo Stanford University Child Health Research Institute Faculty Scholar Award.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtro cellulare da 100 micronFalcon352360
bisturi a 15 lameMiltex4-515
piastra a 24 pozzettiCorning3524
Filtro cellulare da 40 micronFalcon352340
provette da centrifuga coniche da 50 mlFalcon352098
sutura in nylon 6-0 Ethilon, 18", ago P-3, Ethicon1698G
Anti-BMPR-IB anticorpo primarioR& Sistemi DFAB5051A
Guanti chirurgici BioGel PIMö lnlycke Health CareALA42675Z
Buprenorfina SRZooPharm
Castro-Viejo cacciavite ad agoFine Science Tools12565-14
CD1 topo nudoCharles River086
Collagenasi Tipo II polvereGibco17101-015
DMEM medioGibco10564-011
Trapano: Coltello circolare da 4,0 mmXemax SurgicalCK40
Trapano: Micromotore brushless Z500NSKNSKZ500
FBSGicbo10437-077
Fisherbrand Underpads assorbenti, 20" x 24"Fisher Scientific14-206-62
Fisherbrand Garza di cotone sterile, 4" x 4"Fisher Scientific22-415-469
TermoforoKent ScientificDCT-20
Hyclone 199/EBSS mediumGE  Scienze della vitaSH30253.01
Isothesia isofluranoHenry Schein 
050033 Micro Pinze con dentiRobozRS-5150
Micro Pinze con dentiRobozRS-5150
Film di paraffina (Parafilm)BemisPM996
PBSGibco10010-023
Pen-StrepGibco15140-122
Scaffold PLGAFormulazione proprietaria
Poloxamer 188, 10%SigmaP5556-100ML
sterile polifoderato, 18" x 24"Busse Hospital Monousos696Tagliare un foro rettangolare della dimensione appropriata
Soluzione di polisaccarosio: Histopaque 1119Sigma11191
Soluzione per la preparazione dello iodio povidoneMedlineMDS093944H
Unguento oftalmico Puralube petrolato, tubo da 1/8 oz.Dechra Veterinary Products
Tampone di lisiRBC Sigma11814389001
Webcol tamponi per la preparazione dell'alcolCovidien6818
Campo

Riferimenti

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