Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti

Sommario

Vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la cultura del dotto di Wolff mouse (WD). Abbiamo anche dimostrare una procedura dettagliata per tutto il monte immunocolorazione di coltura / WD appena isolate con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio dello sviluppo WD, spiralatura, e differenziazione.

Abstract

morfogenesi Tubal è un requisito fondamentale per lo sviluppo della maggior parte degli organi di mammiferi, compreso il sistema riproduttivo maschile. L'epididimo, parte integrante del tratto riproduttivo maschile, è responsabile per la conservazione dello sperma, la maturazione, e il trasporto. L'epididimo adulto è un tubo altamente spirale che si sviluppa da un semplice e diretto precursore embrionale noto come condotto Wolffian (WD). La corretta avvolgimento dell'epididimo è essenziale per la fertilità maschile, come spermatozoi nel testicolo non sono in grado di fecondare un ovocita. Tuttavia, il meccanismo responsabile dello sviluppo epididymal e spiralatura è chiaro, in parte a causa della mancanza di metodi di coltura interi organo e di imaging. In questo studio, descriviamo un sistema di coltura in vitro e l'intero protocollo di immunofluorescenza monte per visualizzare meglio il processo di WD avvolgimento e di sviluppo, che può essere applicato anche per studiare altri organi tubolari.

Introduzione

Il sistema riproduttivo maschile costituita principalmente testicolo, il sito per lo sviluppo di cellule germinali e differenziazione, e un sistema duttale complesso che è necessario per la maturazione, trasporto e stoccaggio di sperma. Epididimo è un organo tubolare che collega testicolo con dotti deferenti e occupa principalmente di sviluppo post-testicolare e la maturazione delle cellule germinali ^1. I altamente arrotolati epididimo topo adulto si sviluppa da una semplice e diretto tubo precursore, condotto Wolffian (WD) ^1. La struttura complessa e la spirale di dell'epididimo è essenziale per lo sperma di acquisire la capacità di fecondare cellule germinali femminili ^2. Come un organo così essenziale per la fertilità maschile si sviluppa e prende in forma non è ben compreso. Diverse vie di segnalazione hanno dimostrato di essere coinvolto nello sviluppo di WD come ad esempio la segnalazione via di Wnt ^3,4 e la via di segnalazione degli androgeni ^5. Il nostro recente lavoro ha stabilito l'obbligo di balequili- Wnt segnalazione per WD avvolgimento durante lo sviluppo prenatale ^4. Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per comprendere i meccanismi coinvolti nella postnatale avvolgimento dell'epididimo, la differenziazione cellulare, e la comunicazione cellula-cellula all'interno dell'epitelio dell'epididimo e con le cellule interstiziali.

Modelli murini geneticamente modificati hanno dimostrato di essere un potente strumento per l'identificazione / validazione dei meccanismi molecolari alla base dello sviluppo e della malattia di vari apparati ^6. Nonostante il suo ampio uso, ci sono delle limitazioni significative di modelli murini geneticamente modificati, tra cui il fenotipo imprevisto dei mutanti di topo mirati per quanto riguarda la funzione del gene presunta, e nessun fenotipo in mutanti nulli in alcuni modelli, l'influenza di fattori genetici e ambientali, lavoro intensivo e lungo processo di sviluppo di modelli murini. Pertanto, l'interpretazione del significato dei risultati solo da geneticamente modimodelli nismi mouse non è sempre semplice ^6. Queste limitazioni possono essere superate usando nel sistema di coltura in vitro di organi che ci dà la possibilità di manipolare più vie di segnalazione in tempo reale, in condizioni di coltura controllate. Sistema di coltura di organi è fondamentale per comprendere la fisiologia e la patologia di interi organi ^7. Inoltre, immagini di organi interi colorate con anticorpi fluoroforo etichettati ci permette di visualizzare i marcatori di interesse in un contesto tridimensionale, come esiste in vivo, fornendo così una migliore comprensione della forma dell'organo, la struttura e la funzione ^8.

Qui, abbiamo descritto i metodi per l'isolamento embrionali di topo creste genitali, coltura in vitro e tutta l'imaging immunofluorescenza monte di WD, che possono essere applicate a rispondere a una serie di domande riguardanti la morfogenesi di organi tubolari, come WDS. In questo protocollo, abbiamoisolati embrionali di topo creste urogenitali dal 15,5 giorni dopo coitum (DPC) dighe in gravidanza e in coltura per 3 d seguita da immunocolorazione per un marcatore di cellule epiteliali (citocheratina 8, CK8), un marker di proliferazione cellulare (fosfo-istone 3, PH3) e attiva βcatenin.

Protocollo

La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato Cura e etica animale dell'Università di Newcastle e confermato alla legge New South Wales Animal Research, Galles regolamento sugli animali del Sud, e il codice australiano per la cura e uso di animali a fini scientifici. Tutte le procedure intraprese sui topi sono stati approvati dal Comitato Etico e Cura degli animali dell'Università di Newcastle.

1. Il tempo di accoppiamento

1. Pair 6 - 8 settimane di vita maschi e femmine di topo appena prima della fine del ciclo di luce diurna.
2. Controllare le femmine per la presenza di tappi vaginali mattina presto (entro il 08:00), tutti i giorni. Giorno della spina è considerato come 0,5 dpc.
3. Trasferire il femminile con la spina vaginale in una nuova gabbia (senza maschile) ed etichettare la data di presa.

2. Isolamento embrionali di topo gonadici Ridges

1. Isolare embryon del mouseic creste genitali dal 15,5 DPC femmine gravide come descritto in ^9, con alcune modifiche come descritto di seguito.
2. Effettuare dissezione prima di mezzogiorno come il tempo di femmine gravide sono considerati ad entrare nel giorno successivo di gravidanza pomeriggio.
3. Sacrificio 15.5 femmine gravide DPC utilizzando dislocazione cervicale (o secondo il protocollo approvato dal Comitato Etico degli animali istituzionale).
4. Mantenere il mouse sul dorso su carta velina assorbente e spruzzare il lato ventrale dell'addome con il 70% di etanolo.
5. Sollevare la pelle addominale inferiore (lato ventrale) con una pinza e fare una incisione laterale con le forbici chirurgiche, che si estende dalla apertura urogenitale fino alla fine per gabbia toracica. Tirare la pelle verso la testa dell'animale per esporre l'addome.
6. Tagliare i muscoli addominali con le forbici chirurgiche per esporre cavità peritoneale. Afferra il dell'utero gravido con una pinza appena sopra la cervice e fare un taglio. Ora sollevare l'utero tenendo in to la vescica urinaria e tagliare il legamento largo uterina seguita da tagli giunzioni uterotubal staccare utero dall'attaccamento peritoneale.
7. Trasferire l'utero in un tubo da 50 ml contenente ghiacciata HBSS (soluzione salina bilanciata di Hank). Lavare l'utero gravido delicatamente con ghiacciata HBSS per rimuovere il sangue in eccesso.
8. Mantenere l'utero in una capsula di Petri contenente ghiacciata HBSS e tenere in ghiaccio. Tagliare la parete uterina e togliere gli embrioni. Mantenere gli embrioni in un piatto fresco di Petri con HBSS sul ghiaccio.
9. Prendete una carta pulita velina sterile e metterlo su una nuova piastra di Petri. Spray 70% di etanolo sulla carta velina. Mantenere embrione su questa carta velina sulla parte laterale e tagliare dal basso addome con lama sterile nella direzione come mostrato dalla linea tratteggiata in figura 1.
10. Fissare l'embrione su una base di una spugna sterile appuntando la colonna vertebrale.
11. Mettere sotto lo stereomicroscopio dissezione e con attenzione tagliare lungo la linea mediana ventrale. Rimuovere il fegato e l'intestino. Il sistema del mouse urogenitale (rene, uretere, del testicolo, WD e deferenti) dovrebbe essere visibile.
12. Tagliare il testicolo e WD, e mantenere in un piatto fresco di Petri con HBSS, sul ghiaccio. Per estrarre il WD e testicoli, tagliare il dotto deferente vicino al suo attaccamento alla uretra e tagliare l'attaccamento della parte inferiore di WD da gubernaculum.
13. Pool testicoli e WD dagli embrioni dello stesso gruppo (puo 'variare a seconda del piano sperimentale).

3. Cultura della embrionali gonadica creste (Figura 2)

1. Preparare media per la coltura delle creste genitali embrionali, completandolo DMEM / F12 con il 10% FBS (siero fetale bovino), 1% di penicillina / streptomicina e 1% di L-glutammina. Riscaldare il supporto a 37 ° C in un bagno d'acqua.
2. Aggiungere 300 ml di mezzi per pozzetto di una piastra di coltura cellulare di 24 pozzetti.
3. Prendete un piatto Petri fresco e mettere una piccola goccia di sterile HBSS su di esso. Mettere una membrana di policarbonato pista di incisione (0.881; m) in questa goccia di HBSS con la sua superficie splendente di fronte al HBSS.
4. Uso di pinze pulite messo due WD e gonadi sulla membrana (sulla sua superficie ruvida, rivolta verso l'alto) e rimuovere la quantità massima di HBSS con salviette sterili / di carta assorbente. Non toccare il tessuto con carta assorbente; In caso contrario, potrebbe danneggiare il tessuto.
5. Assicurarsi che né i WD né le gonadi si toccano. In caso contrario, essi stare insieme durante la successiva incubazione.
6. Trasferire la membrana con i tessuti nel pozzetto di una piastra da 24 pozzetti contenente 300 microlitri di media e coltura cultura all'interfaccia aria-media. terreno di coltura troppo su membrane si traduce in una crescita cistica di WD.
7. Incubare la piastra a 37 ° C incubatore, in presenza del 5% di CO _2.
8. Modificare il terreno di coltura ogni giorno. Per cambiare il mezzo con la pipetta, rimuovere il terreno dal pozzo e poi aggiungere 300 ml di mezzo fresco preriscaldata.
   Nota:Per studiare l'effetto di diverse vie di segnalazione alla WD morfogenesi, attivatori chimici e / o inibitori alle concentrazioni richieste possono essere aggiunti al mezzo di coltura.
9. Cultura i tessuti per 3 d. All'interno di 3 d, WD srotolò raccolti da un DPC embrione 15,5 trasformano in tubi estremamente contorto (figura 3b). L'aggiunta dell'inibitore Wnt, IWR1, provoca l'inibizione di WD avvolgimento (Figura 3C).
10. Per la raccolta di questi tessuti hanno una capsula di Petri con PBS ghiacciato. Trasferire la membrana con gonade colta e WD nella piastra di Petri. La membrana galleggerà sulla PBS. Premere la membrana ad affondare in PBS ed estrarre la gonade e WD.
11. Fissare i tessuti con% paraformaldeide (PFA) O / N 4 a 4 ° C o per 1 ora a RT. Se necessario, prendere immagini in campo chiaro del WDS prima di fissazione.

4. immunofluorescenza Mount intero

1. Lavare i tessuti fissati 3x con PBS-T (PBS + 1%Triton X-100) con lento dondolio, 10 minuti ciascuna, a RT.
2. Disidratare i tessuti in una serie graduata di etanolo (25%, 50%, 75% e 100%), 10 min ciascuna, a 4 ° C, con lenta oscillazione (~ 30 rpm). A questo punto, i tessuti possono essere conservati a 4 ° C in 75% di etanolo.
   1. Per cambiare l'etanolo, mantenere i tessuti indisturbati per 2 minuti e lasciare che i tessuti stabilirsi. Estrarre il più surnatante possibile e quindi aggiungere il successivo maggiore concentrazione di etanolo. Per evitare danni ai tessuti, la punta della pipetta non deve toccare i tessuti in qualsiasi momento.
3. Dopo la disidratazione, reidratare i tessuti in una serie graduata di etanolo (100%, 75%, 50% e 25%), 10 min ciascuna, a 4 ° C, con lento dondolio.
4. Lavare i tessuti con PBS-T (PBS + 0,1% Triton X-100), 4x, 20 minuti ciascuna, a RT, con dolce dondolo (~ 30 rpm).
5. Bloccare i tessuti per 1 ora a RT con tampone di bloccaggio (PBS + 1% BSA + 0,2% di latte secco non grasso in polvere + 0,3% Triton X-100).
6. afteR blocco, trasferire i tessuti a soluzione anticorpo primario (diluito in tampone di bloccaggio) e incubare O / N a 4 ° C con dolce dondolio (~ 30 rpm). Le diluizioni degli anticorpi primari utilizzati sono descritti nella tabella materiali.
7. Il giorno dopo, lavare i tessuti con PBS-MT (PBS + 2% senza grassi del latte in polvere secca + 0,5% Tween-20), 4x, 30 minuti ciascuno, a temperatura ambiente, con dolce dondolio (~ 30 rpm).
8. Dopo questa fase di lavaggio, aggiungere anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 250 (ciò deve ottimizzazione per anticorpi individuali) in tampone bloccante e incubare per 1 ora a RT, con dolce dondolio.
9. Da ora in poi mantenere i tessuti coperti con un foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce come anticorpi secondari sono etichettati con fluorofori sensibili alla luce.
10. Lavare i tessuti 3x con PBS-T (PBS + 0,1% Tween-20), 30 minuti ciascuno, con dolce dondolio.
11. Preparare vetrini per il montaggio dei tessuti macchiati.
    1. Per questo, tagliare i scivola copertura in vetroin strisce sottili con una penna diamante e attaccare due strisce uno sopra l'altro sul vetrino utilizzando smalto. Fare due confini e luogo tessuti tra questi due confini.
    2. Aggiungere DAPI contenente mezzo di montaggio e mettere su un vetrino. Applicare smalto agli angoli della polizza di copertura per risolvere il problema alla diapositiva.
       Nota: I tessuti sono ora pronti per l'imaging. Conservare queste diapositive a -20 ° C.

Risultati

Durante lo sviluppo, la WD subisce cambiamenti significativi in ​​cui un tubo semplice e lineare si trasforma in un condotto molto complesso e arrotolato. Utilizzando metodi sopra descritti, WD subiscono una trasformazione simile in condizioni di coltura. Qui abbiamo dimostrato i risultati WDs coltivate per 3 d (Figura 3). Per analizzare i meccanismi molecolari coinvolti nella morfogenesi WD, il terreno di coltura può essere integrato con gli inibitori e attivatori di targeting diverse vie di segnalazio...

Discussione

Il sistema di coltura organo ha molti vantaggi rispetto al tradizionale sistema di coltura cellulare. Questo sistema mantiene le relazioni strutturali originali e le interazioni tra i diversi tipi cellulari. Imita sistemi in vivo e fornisce informazioni più accurate di studi su colture cellulari in cui il fattore di nicchia è assente. L'utilizzo di sistemi di coltura di organi nemmeno vantaggi rispetto utilizzando l'intero animale. Questi includono il costo più elevato di utilizzare l'intero animale...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre a 24 pozzetti	Corning, USA	3524	può essere acquistato da altri fornitori
Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS)	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30031.02	può essere acquistato da altri fornitori
Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12)	Sigma, USA	D8437	Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso
Fetale Siero Bovino (FBS)	Interpath,  Australia	SH30034,02	10% FBS utilizzato nel terreno di coltura
L-glutammina	GE Healthcare Life Sciences, USA	SH30034,01	1% concentrazione utilizzata
Penicillina/streptomicina	Gibco, USA	15070-063	1% concentrazione utilizzata
Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch	Whatman, USA	110409	Membrana (0,8 & micro; m)
IWR1	Sigma, USA	10161-5mg	100 µ Concentrazione M utilizzata
Paraformaldeide (PFA)	Microscopia elettronica Sciences, USA	15710	16% stock, 4% in PBS per l'uso. TOSSICO - indossare guanti e non può essere smaltito nel lavandino
Etanolo	Thermo Scientific Fisher, USA	214-20L PL	Absolute, fare 25, 50 e 75% con milliQ di acqua.
Tween-20	Thermo Scientific Fisher, USA	2509-500ml	Molto viscoso, attento durante l'erogazione
di Triton X-100	Sigma, USA	T8787-50ml	Molto viscoso, attento durante l'erogazione di
fosfato acido di sodio	Thermo Scientific Fisher, USA	621-500mg	può essere acquistato da altri fornitori
Sodio di-idrogeno fosfato	Ajax Finechem, USA	4745-500g	può essere acquistato da altri fornitori Cloruro
sodio	Thermo Scientific Fisher, USA	465-500g	può essere acquistato da altri fornitori
Citocheratina8/Troma I	Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank, USA (DHSB)	TROMA-I	1:250 in tampone bloccante
attivo e beta; catenina	Tecnologia di segnalazione cellulare,  USA	D13A1	1:200 in tampone di blocco
fosfo-istone 3	Millipore, MA, USA	06-570	1:200 in tampone di blocco
Alexa488 Capra anti-coniglio IgG	Jackson ImmunoResearchLabs,  USA	111-545-047	1:250 in tampone di blocco
Alexa594 Capra anti-ratto IgG	Jackson ImmunoResearchLabs, USA	112-585-072	1:250 in tampone bloccante
Glycerol	Thermo Fisher Scientific, USA	242-500ml	può essere acquistato da altri fornitori
n-Propyl galate	Sigma, USA	2370-2
-(4-amidinofenil)-1H -indole-6-carbossamidine (DAPI)	Sigma, USA	D9564-10mg	Utilizzare per colorare gli acidi nucleici (DNA)
Dimetil solfossido (DMSO)	Thermo Fisher Scientific, USA	2225-500ml	Vetrini
coprisolvente (24 x 50 mm)	Lomb Scientific	CS24501GP	-

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