Vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la cultura del dotto di Wolff mouse (WD). Abbiamo anche dimostrare una procedura dettagliata per tutto il monte immunocolorazione di coltura / WD appena isolate con anticorpi con tag fluorescenza. Insieme, queste tecniche consentono lo studio dello sviluppo WD, spiralatura, e differenziazione.
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Articolo metodologico
Organo cultura e monte intero immunofluorescenza colorazione di mouse di Wolff Condotti
In questo articolo
Sommario
Abstract
morfogenesi Tubal è un requisito fondamentale per lo sviluppo della maggior parte degli organi di mammiferi, compreso il sistema riproduttivo maschile. L'epididimo, parte integrante del tratto riproduttivo maschile, è responsabile per la conservazione dello sperma, la maturazione, e il trasporto. L'epididimo adulto è un tubo altamente spirale che si sviluppa da un semplice e diretto precursore embrionale noto come condotto Wolffian (WD). La corretta avvolgimento dell'epididimo è essenziale per la fertilità maschile, come spermatozoi nel testicolo non sono in grado di fecondare un ovocita. Tuttavia, il meccanismo responsabile dello sviluppo epididymal e spiralatura è chiaro, in parte a causa della mancanza di metodi di coltura interi organo e di imaging. In questo studio, descriviamo un sistema di coltura in vitro e l'intero protocollo di immunofluorescenza monte per visualizzare meglio il processo di WD avvolgimento e di sviluppo, che può essere applicato anche per studiare altri organi tubolari.
Introduzione
Il sistema riproduttivo maschile costituita principalmente testicolo, il sito per lo sviluppo di cellule germinali e differenziazione, e un sistema duttale complesso che è necessario per la maturazione, trasporto e stoccaggio di sperma. Epididimo è un organo tubolare che collega testicolo con dotti deferenti e occupa principalmente di sviluppo post-testicolare e la maturazione delle cellule germinali 1. I altamente arrotolati epididimo topo adulto si sviluppa da una semplice e diretto tubo precursore, condotto Wolffian (WD) 1. La struttura complessa e la spirale di dell'epididimo è essenziale per lo sperma di acquisire la capacità di feconda....
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Protocollo
La cura degli animali e le procedure sperimentali sono state condotte in conformità con le linee guida del Comitato Cura e etica animale dell'Università di Newcastle e confermato alla legge New South Wales Animal Research, Galles regolamento sugli animali del Sud, e il codice australiano per la cura e uso di animali a fini scientifici. Tutte le procedure intraprese sui topi sono stati approvati dal Comitato Etico e Cura degli animali dell'Università di Newcastle.
1. Il tempo di accoppiamento
- Pair 6 - 8 settimane di vita maschi e femmine di topo appena prima della fine del ciclo di luce diurna.
- Controllare le f....
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Risultati
Durante lo sviluppo, la WD subisce cambiamenti significativi in cui un tubo semplice e lineare si trasforma in un condotto molto complesso e arrotolato. Utilizzando metodi sopra descritti, WD subiscono una trasformazione simile in condizioni di coltura. Qui abbiamo dimostrato i risultati WDs coltivate per 3 d (Figura 3). Per analizzare i meccanismi molecolari coinvolti nella morfogenesi WD, il terreno di coltura può essere integrato con gli inibitori e attivatori di targeting diverse vie di segnalazio.......
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Discussione
Il sistema di coltura organo ha molti vantaggi rispetto al tradizionale sistema di coltura cellulare. Questo sistema mantiene le relazioni strutturali originali e le interazioni tra i diversi tipi cellulari. Imita sistemi in vivo e fornisce informazioni più accurate di studi su colture cellulari in cui il fattore di nicchia è assente. L'utilizzo di sistemi di coltura di organi nemmeno vantaggi rispetto utilizzando l'intero animale. Questi includono il costo più elevato di utilizzare l'intero animale.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare i membri del gruppo di oncologia ginecologica per la lettura critica di questo manoscritto. Questo lavoro è in parte sostenuto da un finanziamento dal National Health and Medical Research Council, l'Australian Research Council, e il Cancer Institute NSW (PST). MK è un destinatario della University of Newcastle Postgraduate Research Fellowship.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre a 24 pozzetti | Corning, USA | 3524 | può essere acquistato da altri fornitori |
| Hank' s Soluzione salina bilanciata (HBSS) | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30031.02 | può essere acquistato da altri fornitori |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12) | Sigma, USA | D8437 | Caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso |
| Fetale Siero Bovino (FBS) | Interpath, Australia | SH30034,02 | 10% FBS utilizzato nel terreno di coltura |
| L-glutammina | GE Healthcare Life Sciences, USA | SH30034,01 | 1% concentrazione utilizzata |
| Penicillina/streptomicina | Gibco, USA | 15070-063 | 1% concentrazione utilizzata |
| Whatman Nuclepore Polycarbonate Track-Etch | Whatman, USA | 110409 | Membrana (0,8 & micro; m) |
| IWR1 | Sigma, USA | 10161-5mg | 100 µ Concentrazione M utilizzata |
| Paraformaldeide (PFA) | Microscopia elettronica Sciences, USA | 15710 | 16% stock, 4% in PBS per l'uso. TOSSICO - indossare guanti e non può essere smaltito nel lavandino |
| Etanolo | Thermo Scientific Fisher, USA | 214-20L PL | Absolute, fare 25, 50 e 75% con milliQ di acqua. |
| Tween-20 | Thermo Scientific Fisher, USA | 2509-500ml | Molto viscoso, attento durante l'erogazione |
| di Triton X-100 | Sigma, USA | T8787-50ml | Molto viscoso, attento durante l'erogazione di |
| fosfato acido di sodio | Thermo Scientific Fisher, USA | 621-500mg | può essere acquistato da altri fornitori |
| Sodio di-idrogeno fosfato | Ajax Finechem, USA | 4745-500g | può essere acquistato da altri fornitori Cloruro |
| sodio | Thermo Scientific Fisher, USA | 465-500g | può essere acquistato da altri fornitori |
| Citocheratina8/Troma I | Studi sullo sviluppo Hybridoma Bank, USA (DHSB) | TROMA-I | 1:250 in tampone bloccante |
| attivo e beta; catenina | Tecnologia di segnalazione cellulare, USA | D13A1 | 1:200 in tampone di blocco |
| fosfo-istone 3 | Millipore, MA, USA | 06-570 | 1:200 in tampone di blocco |
| Alexa488 Capra anti-coniglio IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 111-545-047 | 1:250 in tampone di blocco |
| Alexa594 Capra anti-ratto IgG | Jackson ImmunoResearchLabs, USA | 112-585-072 | 1:250 in tampone bloccante |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific, USA | 242-500ml | può essere acquistato da altri fornitori |
| n-Propyl galate | Sigma, USA | 2370-2 | |
| -(4-amidinofenil)-1H -indole-6-carbossamidine (DAPI) | Sigma, USA | D9564-10mg | Utilizzare per colorare gli acidi nucleici (DNA) |
| Dimetil solfossido (DMSO) | Thermo Fisher Scientific, USA | 2225-500ml | Vetrini |
| coprisolvente (24 x 50 mm) | Lomb Scientific | CS24501GP | - |
Riferimenti
- Joseph, A., Yao, H., Hinton, B. T. Development and morphogenesis of the Wolffian/epididymal duct, more twists and turns. Dev Biol. 325, 6-14 (2009).
- Murashima, A., Xu, B., Hinton, B. T. Understanding normal and abnormal develop....
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Ristampe e permessi
