Legionella pneumophila membrana esterna Vescicole: Isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatori sui macrofagi

Sommario

Qui, descriviamo la purificazione di Legionella pneumophila (L. pneumophila) vescicole membrana esterna (OMVS) da colture liquide. Tali vescicole purificate sono poi utilizzati per il trattamento dei macrofagi per analizzare il loro potenziale pro-infiammatoria.

Abstract

I batteri sono in grado di secernere una varietà di molecole attraverso vari sistemi secretori. Oltre alla secrezione di molecole nello spazio extracellulare o direttamente in un'altra cellula, i batteri Gram-negativi possono anche formare vescicole della membrana esterna (OMV). Queste vescicole di membrana possono trasportare il loro carico su lunghe distanze e il carico è protetto dalla degradazione da proteasi e nucleasi.

La Legionella pneumophila (L. pneumophila) è un patogeno intracellulare, Gram-negativo, che causa una grave forma di polmonite. Nell'uomo, infetta i macrofagi alveolari, dove blocca la degradazione lisosomiale e forma un vacuolo di replicazione specializzato. Inoltre, L. pneumophila produce OMV in varie condizioni di crescita. Per comprendere il ruolo degli OMV nel processo di infezione dei macrofagi umani, abbiamo messo a punto un protocollo per purificare le vescicole di membrana batterica da colture liquide. Il metodo si basa sull'ultracentrifugazione differenziale. Gli OMV arricchiti sono stati successivamente analizzati per quanto riguarda la loro quantità di proteine e lipopolisaccaridi (LPS) e sono stati quindi utilizzati per il trattamento di una linea cellulare monocitica umana o di macrofagi derivati dal midollo osseo murino. Le risposte pro-infiammatorie di queste cellule sono state analizzate mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico. Inoltre, sono state analizzate le alterazioni di una successiva infezione. A tal fine, la replicazione batterica di L. pneumophila nei macrofagi è stata studiata mediante saggi di unità formanti colonie.

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la purificazione di OMV di L. pneumophila da coltura liquida mediante ultracentrifugazione e per l'analisi a valle del loro potenziale pro-infiammatorio sui macrofagi.

Introduzione

I batteri possono secernere fattori di virulenza attraverso diversi meccanismi ^1. Oltre ai sistemi di secrezione ben noti, batteri Gram-negativi possono scambiarsi informazioni e fornire fattori di virulenza tramite vescicole membrana esterna (OMVS), che sono piccole vescicole, sferoidali 10-300 nm di diametro e con una struttura a membrana a doppo strato. Essi sono secreti in una varietà di ambienti di crescita (coltura liquida, solida cultura e biofilm) e in tutte le fasi di crescita ^{2, 3.} OMVS sono un importante mezzo di trasporto (ad esempio, per le proteine, adesine, tossine e gli enzimi, così come per i LPS, che si trova sulla superficie OMV) ^4. Il carico intraluminale è protetta dalla degradazione proteolitica, quindi è in grado di agire su lunghe distanze, e le vescicole si trova nei fluidi corporei e organi distanti ^{5, 6,}"xref"> ^{7, 8.} Non possono essere riconosciuti solo ed assorbiti dalle cellule eucariotiche ^{9, 10,} ma, inoltre, sono in grado di facilitare il legame di batteri e loro invasione nelle cellule ospiti ^4. Legionella pneumophila (L. pneumophila) è un batterio Gram-negativo che può rilasciare OMVS. Nel polmone umano, che infetta principalmente macrofagi alveolari, anche se il suo ospite naturale sono amebe acqua dolce ^11. Un'infezione pneumophila L. può causare la malattia del legionario ', una grave forma di polmonite ^12. Esso blocca la fusione phagosome-lisosomi nella cellula ospite. Si recluta anche organelli ospitanti, per cui una nicchia di replica, la Legionella -aventi tenore vacuolo (LCV), si forma ^{13, 14.} degradazione lisosomiale è inibito non solo da proteine ​​effettrici Translocation tramite il sistema di secrezione di tipo IV, ma anche dal rilascio di OMVS ^15.

La purificazione di OMVS da colture batteriche è necessario per analizzare il loro effetto sulle cellule riceventi. Studi precedenti focalizzati sul tenore in proteine di L. pneumophila OMVS e sull'influenza delle vescicole sulle cellule epiteliali alveolari ^16, ma gli studi successivi con trapianti di tessuto polmonare umano hanno dimostrato che L. pneumophila OMVS sono ripreso da macrofagi alveolari ^17.

Come OMVS attuali modelli molecolari associati ai patogeni (PAMPs) e altri antigeni batterici, potrebbero avere un impatto sul l'infezione di cellule eucariotiche e modulare la risposta immunitaria ^18. L. pneumophila OMVS rapidamente si fondono con le membrane della cellula ospite e, inoltre, attivano il membranosa TLR2 ^19. Come è noto che L. pneumophila OMVS stimolare macrofagi e cellule epiteliali in maniera pro-infiammatoria ^{16, 17,} abbiamo analizzato l'impatto OMVS sul processo di infezione nei macrofagi umani e murini.

Qui, descriviamo un protocollo per la coltivazione di L. pneumophila in coltura liquida per isolare i OMVS secrete da ultracentrifugazione differenziale e per valutare l'impatto delle vescicole sulle cellule ospiti eucariotiche, direttamente o dopo un'infezione.

Protocollo

1. Preparare medio e piastre di agar

1. Preparare 1 l di brodo di coltura (YEB). Sciogliere 10 g di ACES e 10 g di estratto di lievito in 900 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 6,9 con KOH (5 N). Aggiungere 10 ml di L-cisteina (0,4 g in 10 mL di acqua distillata) e 10 mL di Fe (NO _{3) 3} x9H ₂ O (0,25 g in 10 mL di acqua distillata). Riempire fino a 1 L con acqua distillata e filtrare sterilizzare il (dimensione dei pori: 0,22 micron) soluzione. Conservare a 4 ° C.
2. Preparare carbone tamponato estratto di lievito (BCYE) piastre di agar. Sciogliere 10 g di ACES e 10 g di estratto di lievito in 900 ml di acqua distillata. Regolare il pH a 6,9 con KOH (5 N). Aggiungere 15 g di agar e 2,5 g di carbone attivo. Riempire fino a 1 L con acqua distillata e autoclave.
   1. Aggiungere 10 ml di L-cisteina (0,4 g in 10 mL di acqua distillata) e 10 mL di Fe (NO _{3) 3} x9H ₂ O (0,25 g in 10 mL di acqua distillata, sia sterilizzata mediante filtrazione attraverso 0,22 micronpori) a BCYE raffreddato (circa 50 ° C). Versare in piastre e conservare a 4 ° C.

2. Coltivare L. pneumophila

1. Stendere L. pneumophila ceppo Corby (wild type, WT) su piastre di agar BCYE e incubare a 37 ° C per 3 giorni. Seminare 10 ml di YEB ad un diametro esterno ₆₀₀ di 0,3 con L. pneumophila dalla piastra precoltura; incubare i batteri a 37 ° C su un agitatore rotante (150 rpm) per 6 ore.
2. Verificare la purezza della coltura liquida diffondendo 100 microlitri della sospensione su una piastra di agar sangue. Incubare per una notte a 37 ° C.
3. Aggiungere la coltura liquida restante 90 mL di terreno YEB fresco e incubare su un agitatore rotante (37 ° C e 150 rpm) per raggiungere un OD ₆₀₀ di 3,0-3,5, che dura circa 16-20 h.

3. Preparare e quantificare L. pneumophila OMVS

NOTA: Eseguire tutte le seguenti fase di centrifugaziones in condizioni sterili e a 4 ° C.

1. Centrifugare la coltura liquida a 4.000 xg per 20 minuti per ottenere il pellet batteri. Trasferire il surnatante in provette da centrifuga freschi, scartare il pellet batterico, e ripetere la centrifugazione (4000 x g per 20 minuti). Ripetere questa operazione una sola volta.
2. Sterile-filter restante surnatante due volte (dimensione dei pori: 0,22 micron). Trasferire il surnatante priva di batteri ai tubi ultracentrifuga e ultracentrifuga a 100.000 xg per 3 ore.
3. Decantare il surnatante e gettarlo. Risospendere il pellet OMV in sterile tampone fosfato salino (PBS) e ultracentrifuge (100.000 xg per 3 h) per rimuovere le proteine ​​contaminanti e LPS.
4. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet OMV in 500 ml di PBS sterile. Consecutive 20 microlitri su una piastra di agar sangue e su una piastra di agar BCYE escludere la contaminazione batterica delle vescicole preparati. Incubare la piastra di agar sangue durante la notte e la piastra di agar BCYE per 3 giorni (entrambe a 376; C).
5. Quantificare l'importo proteina ottenuta dalla preparazione OMV usando un test di acido bicinconinico secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: La concentrazione di 100 ml di L. pneumophila cultura è di solito 1 mg / mL. Conservare le OMVS preparati e quantificabili a -20 ° C.

I macrofagi 4. Pre-treat

1. Preparare le cellule THP-1.
   NOTA: THP-1 è una linea cellulare monocitica derivata da un paziente leucemia.
   1. Aggiungere 2x10 ⁵ cellule THP-1 ogni 24 pozzetti e differenziare con l'aggiunta di 20 nM forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) in cellule macrofagi-like. Incubare per 24 ore a 37 ° C.
   2. Sostituire il mezzo con 500 ml di mezzo fresco e incubare per altre 24 ore; il mezzo ottimale per cellule THP-1 è composto di RPMI 1640 alto glucosio supplementato con 10% di siero fetale di vitello.
2. Isolare i macrofagi del midollo osseo murino (mBMDM), come descritto nella consultareENCE 20.
3. Trattare macrofagi THP-1-derivati ​​o mBMDM con OMVS.
   1. Scongelare i OMVS previste al punto 3 e aggiungerli in base alla loro quantità di proteine ​​(0,1, 1, e 10 mg / ml) al macrofagi murini umano o. Incubare le macrofagi con OMVS a 37 ° C per almeno 20 h. Utilizzare il surnatante per ELISA o andare avanti con il passaggio 5.

5. Infettare i macrofagi e valutare replica batterica con un (CFU) Assay formanti colonia Unità

1. Utilizzare L. pneumophila dal punto 2.1, pre-trattati cellule THP-1 o mBMDM dal punto 4.3, e non macrofagi pre-trattati come controlli (2x10 ^5/24 pozzi). Non scambiare il mezzo.
2. Infettare cellule THP-1 con L. pneumophila Corby WT e mBMDM con un mutante flagellin-privo di L. pneumophila Corby (entrambi con una molteplicità di infezione (MOI) di 0,5; 1x10 ⁵ L. pneumophila / 24 pozzi) e incubare per 24 e 48 ore, rispettivamente. preparare boesimo L. pneumophila Corby (WT o flagellin-carente mutante) come descritto al punto 2.1.
3. Lisare le cellule nel loro mezzo mediante aggiunta di saponina (concentrazione finale: 0,1%) e incubare a 37 ° C per 5 min.
4. Risospendere i batteri pipettando e trasferire la sospensione in un recipiente di reazione. Preparare diluizioni seriali del pneumophila L. -contenenti media in PBS sterile.
5. Streak 50 ml delle diluizioni richieste su piastre di agar BCYE ed incubare per 3 giorni a 37 ° C.
6. Visivamente contare le colonie formate. Calcolare il CFU Normalizzare il risultato del conteggio CFU di non pre-trattati, ma macrofagi, che sono impostati al 100% infetti.

Risultati

L'apparato sperimentale per preparare L. pneumophila OMVS e di analizzare la loro influenza sulla risposta pro-infiammatoria dei macrofagi seguenti infezione è raffigurato nella figura 1. Il potenziale pro-infiammatoria delle OMVS preparati possono essere analizzati su PMA dissociati cellule THP-1, che è illustrato nella figura 2. cellule THP-1 rispondono con un aumento di tempo e dose-dipendente di IL-8 e IL-6 secrezione. Inoltre, l'influenza dei diversi TLR sul riconoscimento L. pneumophila OMV può essere analizzato utilizzando mBMDM da diversi background genetico, così come presentati dal CXCL1 ELISA in figura 3. mBMDM da topi WT secrete CXCL1 dopo stimolazione OMV, mentre mBMDM TLR2 / 4 ^{- / -} secreto significativamente meno. Per studiare l'impatto di L. pneumophila OMVS sulla replicazione batterica in THP-1 macrofagi, le cellule sono state pre-incubate con OMVS e poi ulteriormente infettaticon L. pneumophila (Figura 4 A). Il pre-stimolazione dei macrofagi THP-1-derivati ​​primo riduce la replicazione batterica dopo 24 h di infezione, ma porta ad un raddoppio CFU conteggio nel punto più tardi (48 h pi). L'impatto dei recettori Toll-like (TLR) di segnalazione sul riconoscimento OMV dopo l'infezione dei macrofagi può essere valutata mediante mBMDM, come illustrato nella figura 4 B. Aumenta batteriche replica di dieci volte in mBMDM da animali WT dopo OMV pre-incubazione, mentre TLR2 ^{- / -} e TRIF / MyD88 ^{- / -} cellule non mostrano questo aumento di L. pneumophila replica.

Figura 1: Procedura sperimentale. (A) L. pneumophila Corby WT da 10-cm BCYE agar piastre sono utilizzate per inoculare una piccola coltura liquido (10 mL), che viene trasferito in 90 mL di YEB frescamedia dopo 6 h. Un piccolo volume è anche placcato su una piastra di agar sangue per verificare la purezza. I batteri vengono incubate a 37 ° C fino alla fase stazionaria precoce (OD ₆₀₀ = 3,0-3,5). (B) La coltura liquido viene centrifugato e sterile filtrata per eliminare i batteri. Il supernatante -free Legionella viene quindi ultracentrifugato per ottenere un pellet OMV, che viene risospeso in PBS e ultracentrifugato nuovo. Le vescicole isolate sono risospese, controllati per purezza e quantificati per la quantità di proteine. La barra di scala rappresenta 2,5 cm. (C) macrofagi umani o murini sono stimolati con i OMVS quantificati. Il supernatante di coltura cellulare può essere utilizzato per ELISA, o macrofagi possono essere infettati con L. pneumophila per determinare replicazione batterica mediante saggio CFU su 10 cm-BCYE agar piastre. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2: attivazione pro-infiammatoria di cellule THP-1 di L. pneumophila OMVS. (A) Qui, la linea cellulare THP-1 monocitica è usato come modello per macrofagi alveolari. PMA-differenziati THP-1 le cellule sono state trattate con dosi crescenti di L. pneumophila OMVS (0,01-25 mg / ml) per 24 e 48 ore, rispettivamente. Il supernatante privo di cellule è stata usata per IL-8 ELISA. mostra i valori medi dei tre esperimenti indipendenti ± SEM. Cellule THP-1 ha risposto a soli 0,01 mg / mL L. pneumophila OMVS con significativa secrezione di IL-8, che era tempo e dose-dipendente. (B) L. pneumophila OMVS (0,1-10 mg / ml) sono stati usati per stimolare la PMA dissociati cellule THP-1. Il supernatante è stato raccolto dopo 24 e 48 ore di incubazione, e rilasciato IL-6 è stata misurata nel supernatante mediante ELISA. mostra i valori medi dei tre esperimenti indipendenti ± SEM. cellule THP-1 secreti notevoli quantità di IL-6, anche con la dose più bassa di OMVS (0,1 mg / mL). La secrezione di IL-6 aumenta con dosi crescenti OMV e con tempi di incubazione prolungati. Statistiche: test di Mann-Whitney; * P <0.05 e ** p <0,01 rispetto al corrispondente 0 mg / mL OMV. Ristampato con il permesso di riferimento 20. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3: L'attivazione pro-infiammatoria dei macrofagi dipende TLR2 / 4. mBMDM da WT e TLR2 / 4 ^{- / -} topi sono stati incubati con L. pneumophila OMVS (0,1 o 1 mg / ml). CXCL1 secrezione è stata analizzata mediante ELISA dopo 24 e 48 ore, rispettivamente. Ilsono riportati i valori medi ± SEM di tre esperimenti indipendenti. mBMDM da topi WT ha risposto con una secrezione CXCL1 dose-dipendente dopo L. pneumophila OMV incubazione. TLR2 / 4 ^{- / -} mBMDM secreti significativamente meno CXCL1 rispetto al WT mBMDM, e questa secrezione non ha aumentato la dose-dipendente. Statistiche: test di Mann-Whitney; * P <0,05 rispetto al corrispondente 0 mg / mL OMV; #p <0.05 confrontata con un campione WT altrettanto trattata. Ristampato con il permesso di riferimento 20. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: replica L. pneumophila OMV pre-incubazione aumenta batterica nei macrofagi. (A) differenziata THP-1 cellule sono state pre-incubate con OMVS (0,1, 1 o 10 μ; G / mL) o LPS / IFN-γ (200 ng / mL ciascuno) o sono stati lasciati non trattati per il controllo. Dopo di pre-incubazione (20 h), THP-1 cellule sono state infettate con L. pneumophila Corby WT (MOI 0,5) per 2, 24, e 48 ore, rispettivamente. THP-1 cellule sono state lisate mediante aggiunta di saponina, ed i batteri sono stati piastrati su piastre di agar BCYE. CFU sono stati calcolati rispetto a 0 mg / ml OMV dopo ogni punto di tempo. Le barre rappresentano i valori medi ± SEM di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in duplicato tecnici. Non ci sono state differenze nella diffusione batterica (2 ore dopo l'infezione (pi)) rispetto alle cellule non pre-trattati. Alterazioni nella replicazione batterica sono stati determinati dopo 24 e 48 ore, rispettivamente. LPS / pretrattati cellule THP-1 IFN-γ hanno mostrato una riduzione del carico batterico 24 h Pi Questa è stata anche osservata dose-dipendente per L. pneumophila OMV cellule pre-trattati. Al punto secondo momento (48 h PI), OMV pre-trattati cellule THP-1 ha mostrato un raddoppio in L. pneumophila replicatura, che LPS / IFN-gamma macrofagi pretrattati mostrato un'ulteriore riduzione di carica batterica. Statistiche: test di Mann-Whitney; * P <0.05 e ** p <0,01 rispetto al corrispondente 0 mg / mL OMV. (B) mBMDM da topi con differenti background genetico (WT, TLR2 ^{- / -,} e TRIF / MyD88 ^{- / -)} sono stati pre-incubate con 0,1 mg / ml L. pneumophila OMVS per 20 ore e sono stati poi infettati con un flagellin- mutante carente di L. pneumophila Corby (MOI 0.5) per 48 ore. mBMDM state lisate mediante aggiunta di saponina, e la Legionella sono state piastrate su piastre di agar BCYE. La CFU sono stati calcolati rispetto a 0 mg / mL OMV, indicato dalla linea continua. Le barre rappresentano i valori medi ±± SEM di tre esperimenti indipendenti, ciascuno eseguito in duplicato. mBMDM da topi WT ha mostrato un aumento in L. pneumophila replica dopo OMV pre-trattamento. TLR2 ^{- / -} macrofagi hanno mostrato significativamente ridotti - / - mBMDM. Statistiche: test di Mann-Whitney; p <0,05 rispetto al campione WT. Ristampato con il permesso di riferimento 20. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussione

I OMVS di batteri patogeni e l'impatto di queste vescicole di membrana sulle loro cellule bersaglio sono attualmente in fase di studio intensivo. Ad esempio, Clostridium perfringens -derived OMVS inducono la secrezione di citochine nei macrofagi, linfociti B possono essere attivati da OMVS da Borrelia burgdorferi, e Helicobacter pylori -released vescicole di membrana in grado di agire sulle cellule epiteliali gastriche ^{21, 22, 23.} L. pneumophila, un patogeno intracellulare in grado di indurre una grave forma di polmonite atipica, rilascia anche OMVS che sono in grado di attivare le cellule ed i macrofagi ^{16, 19} epiteliali polmonari. Qui, vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento su piccola scala di L. pneumophila OMVS da coltura liquida per studiare il ruolo potenziale di OMVS in polmonite. E 'fondamentale per lavorare sotto Condit sterileioni e per escludere la contaminazione da altri batteri per ottenere una pura L. pneumophila -derived preparazione OMV. L'isolamento di OMVS comprende una fase di filtrazione attraverso pori 0,22 micron per impedire la contaminazione del pellet OMV ottenuto con L. pneumophila, anche se questo riduce la resa OMV, poiché i grandi OMVS vengono persi da questa fase di filtrazione.

Inoltre, abbiamo testato la risposta dei macrofagi umani e murini a tali vescicole isolate e le cellule infettate con L. pneumophila per approssimare più da vicino la situazione in polmonite da Legionella, dove OMVS vengono rilasciati all'interno del LCV da batteri extracellulari ^15. Le dosi OMV impiegati sono stati stimati in base alla quantità OMV gratuitamente un'infezione in vitro di macrofagi umani dopo 24 ore di incubazione (descritti nel riferimento 20). Per la stimolazione di altre cellule riceventi o in vivo,altre dosi OMV potrebbero essere necessari e devono essere stabiliti. L'analisi degli effetti della L. pneumophila OMVS rappresenta un avanzamento al protocollo descritto da Jager e Steinert ^24.

Qui, PMA-differenziate cellule THP-1 servono da modello per macrofagi alveolari a causa della limitata disponibilità di materiale umano primario. L'aggiunta di PMA differenzia i monociti cellule THP-1 in cellule macrofagi come ^25. Inoltre, essi sono una linea cellulare modello ben noto per la L. pneumophila studia ^26. Oltre a questa linea cellulare monocitica umana, vengono utilizzate le cellule mBMDM. mBMDM sono ampiamente accettate per lo studio degli effetti della L. pneumophila ^{27, 28, 29.} La possibilità di utilizzare fori genetiche per i diversi TLR o altre proteine ​​di loro uno strumento prezioso per lo studio degli effetti OMV fare. in order per abbassare la quantità di topi per esperimento, mBMDM sono utilizzati al posto dei macrofagi alveolari causa delle limitazioni dei macrofagi. esperimenti chiave potrebbero richiedere macrofagi alveolari per la convalida.

Oltre al protocollo qui descritto di ultracentrifugazione per purificare OMVS, è possibile effettuare una centrifugazione in gradiente di densità, che è incluso nel protocollo da Chutkan et al. ^30. Ciò potrebbe migliorare la purezza della preparazione OMV ottenuto e ridurre la quantità di aggregati co-purificata proteine, flagellina, e LPS. La purezza della preparazione OMV ottenuto può essere analizzata mediante microscopia elettronica a trasmissione o nanoparticelle analisi inseguimento a titolo supplementare nel controllo qualità. Questo può fornire un ulteriore mezzo di quantificazione, al di là della procedura di misurazione della proteina qui presentata. Opzionalmente, la concentrazione di LPS può essere analizzato da un test di lisato di amebociti di Limulus. Se la resa OMV è basso, unfase di concentrazione aggiuntive tramite filtri centrifughe potrebbe essere eseguita, che non è stato fatto qui. Se la resa è stata inferiore al previsto, i OMVS sono stati scartati.

Come parte del continuo sforzo per chiarire i meccanismi biologici e le funzioni dietro OMVS, l'influenza delle diverse condizioni di stress sulla produzione OMV potrebbe essere testato. La privazione di nutrienti, le variazioni di temperatura di incubazione, o l'esposizione ad agenti nocivi potrebbe avere un impatto sulla secrezione OMV ^31. Le possibili condizioni di stress sono discussi nel protocollo da Klimentova e Štulík ^32. Inoltre, iper- o hypovesiculating mutanti di L. pneumophila potrebbero essere generati. Le diverse preparazioni OMV potrebbero poi essere analizzati in esperimenti di infezione con macrofagi, espianti tessuto polmonare umano (descritti in riferimento 17), o anche in modelli in vivo. Oltre al ruolo di OMVS in innato segnalazione immunitario, la loro influenza nella comunicazione battericapossono essere affrontati sperimentalmente. Inoltre, l'impatto delle varie cascate di segnalazione immunitario innato potrebbe essere analizzato con l'uso di cellule murine knockout o la generazione di CRISPR / Cas9 ko in linee cellulari umane. Questa ricerca di base in OMVS assisterà allo sviluppo di nuove strategie vaccinali, che esistono già per la meningite B trasmessa da Neisseria meningitidis ^33.

A partire dal protocollo sull'isolamento OMV e la caratterizzazione, si può applicare questo ad altri batteri Gram-negativi e ad altre cellule ospiti; deve soltanto essere regolato per la crescita dei batteri in coltura liquida. Il protocollo pubblicato da Chutkan et al. fornisce informazioni dettagliate sulla generazione di OMVS da Escherichia coli e Pseudomonas aeruginosa ^30. La cultura non deve raggiungere la fase stazionaria tardiva per evitare aumenti di batteri lisati e proteine ​​contaminanti e membrane. Inoltre, la dose OMV utilizzato per la stimolazione delle cellule ospiti deve essere determinato in funzione della quantità di OMVS presente durante infezioni in vivo, pur garantendo un basso tasso di citotossicità. In questo modo, il ruolo patologico della OMVS, il loro impatto sulla comunicazione inter-specie, e le interazioni ospite-patogeno potrebbe essere esaminata.

Per studiare ulteriormente il ruolo di L. pneumophila OMVS in polmonite, sono necessari preparativi OMV standardizzati con rendimenti sufficienti e esperimenti di infezione comparabili. Questo protocollo contribuirà a standardizzare le procedure di isolamento e di estendere gli studi OMV ad altri batteri Gram-negativi e ad altre cellule ospiti. Inoltre, la ricerca beneficerà il dettaglio nella conoscenza vitro, che può essere utilizzata per estendere gli esperimenti alle impostazioni in vivo. In futuro, questo protocollo potrebbe essere esteso a l'isolamento di OMVS da materiale biologico primario, come il siero o lav broncoalveolareil fluido di età, al fine di conoscere la composizione del OMVS rilasciata in condizioni fisiologiche. Ciò contribuirà a determinare i parametri chiave della composizione OMV e per comprendere le proprietà di OMVS generate da in vitro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra Petri da 10 cm	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)	82.1473
Rotore 70 Ti	Beckman Coulter Incorporation (California, USA)	337922
ACES	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	9138.2
carbone attivo	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	X865.2
agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	5210.2
Columbia agar con il 5% di sangue di pecora	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germania)	254005
cuvette	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)	67.742
ELISA (umano)	BD OptEIA™; Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germania)	IL-8: 555244 IL-6: 550799
ELISA (murino)	DuoSet, R& D (Minneapolis, USA)	CXCL1: DY453-05
Fe(NO3)3x9H2O	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	5632.1
Siero fetale di vitello (FCS)	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germania)	10270-106
Heracell 240i CO2 incubatore	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)	75004515
Ciclo di inoculazione	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)	86.1567.010
KOH	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	6751.1
L. pneumophila Corby	---	---	gentilmente fornito da Prof Dr Antje Flieger (RKI, Berlino, Germania)
L. pneumophila Corby & Delta; flaA	---	---	gentilmente fornito dal Prof. Dr. Klaus Heuner (RKI, Berlino, Germania)
L-cystein	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)
mBMDM	---	---	gentilmente fornito dal Prof. Dr. Markus Schnare (Philipps Univeristy Marburg, Marburg, Germania) e dal Prof Dr Carsten Kirschning (University Duisburg Essen, Essen, Germany)
PBS	Biochrom GmbH (Berlin, Germany)	L 1825
phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germany)	P8139-1MG
agitatore rotante (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)	SHKE6000
RPMI 1640 high glucose	Life Technologies GmbH (Darmstadt, Germania)	11875-093
saponina	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	9622.1
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Inghilterra)	80-2116-30
filtro sterile (dimensione dei pori: 0,22 &; m)	Corning Incorporated (new York, USA)	431096
THP-1	Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Germania)	88081201-1VL
Sorvall Discovery 100 SE	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)
estratto di lievito	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	2363.2
Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce	Thermo Fisher Scientific Germany BV & Co KG (Braunschweig, Germania)	23225