Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Summary

Descriviamo qui un approccio relativamente veloce e semplice per mappare i tempi di replicazione dei mammiferi a livello di genoma, dall'isolamento cellulare all'analisi di base dei risultati del sequenziamento. Verrà fornita una mappa genomica di un programma di replicazione rappresentativo seguendo il protocollo.

Abstract

La replicazione del genoma si verifica durante la fase S del ciclo cellulare in un processo altamente regolato che assicura la fedeltà di duplicazione del DNA. Ogni regione genomica si replica in un momento distinto durante la fase S attraverso l'attivazione simultanea di più origini di replicazione. Tempo di replica (RPT) correla con molte caratteristiche genomiche ed epigenetici ed è collegato a tassi di mutazione e il cancro. Comprendere la visualizzazione completa del genoma del programma di replica, in salute e malattia è un importante obiettivo futuro e una sfida.

Questo articolo descrive in dettaglio il "Numero rapporto di riproduzione di S / G1 per la mappatura genomica tempo di replica" il metodo (di seguito denominato: CNR-Tor), un approccio semplice per mappare il genoma ToR di cellule di mammifero. Il metodo si basa sulle differenze del numero di copie tra le cellule in fase S e le cellule in fase G1. Il metodo CNR-TOR viene eseguita in 6 fasi: 1. Preparazione delle cellule e colorazione con ioduro di propidio (PI); 2. Sorting G1 cellule nella fase S utilizzando cellule di fluorescenza-attivato (FACS); 3. purificazione del DNA; 4. Sonicazione; 5. preparazione biblioteca e sequenziamento; e 6. L'analisi bioinformatica. Il metodo CNR-TOR è un approccio facile e veloce che si traduce in mappe dettagliate di replica.

Introduction

replicazione del DNA Mammalian è strettamente regolata per assicurare la replica esatta di ciascun cromosoma esattamente una volta durante il ciclo cellulare. La replica avviene secondo un ordine altamente regolamentato - più grandi regioni genomiche (~ Mb) replicano all'inizio della fase S (inizio replicare i domini), mentre altre regioni genomiche replicano dopo a (domini media e tarda replicanti) medio o tarda fase S ^1. La maggior parte del genoma replicati contemporaneamente in tutti i tessuti (domini ToR costitutive), mentre il 30% - 50% del genoma, cambia ToR tra tessuti ^2, durante la differenziazione

Protocol

Nota: Tor può essere misurata solo sulla crescita, le cellule non sincronizzati. La procedura dovrebbe iniziare con almeno 1 - 2 x 10 ⁶ cellule in rapida crescita, che di solito provoca ~ 1 x 10 ⁵ cellule in fase S (il passo rate limiting). Si raccomanda di condurre ogni esperimento utilizzando due o tre repliche. L'intero processo di CNR-Tor può essere completato entro una settimana - due giorni dovrebbero essere dedicati a tutte le fasi fino alla preparazione biblioteca, uno o due giorni sono necessari per il sequenziamento e un giorno in più è necessario per l'analisi dei dati iniziali.

1. Raccolta delle cellule dal....

Results

Una tipica mappa ToR è mostrato in Figura 3 per fibroblasti embrionali di topo (MEF). Questa figura illustra il processo di analisi in quanto mostra entrambi i punti, che sono normalizzate rapporto S / G1 per singole finestre (passo 8.3), così come la linea che risulta dalla levigatura cubica e interpolazione (passo 8.5).

Tali mappe catturano l'organizzazione del programma di replica, che è un mosaico di due t.......

Discussion

CNR-tor può essere eseguita in linea di principio su una popolazione di cellule proliferanti eucariotiche che può essere diviso per FACS a S e le fasi G1 (recensito da Rhind N. e Gilbert ²⁰ DM). Il metodo descritto qui è stato adattato per le cellule di mammifero con una dimensione del genoma di ~ 3 Gb come uomo e topo. Sono necessari Piccoli cambiamenti nel protocollo CNR-TR (in preparazione cellulare e profondità sequenziamento), al fine di adeguare ad altri eucarioti. L'attenzione deve ess.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PBS	BI (Biological Industries)	02-023-1A
Trypsin-EDTA	BI (Biological Industries)	03-052-1B
Provetta conica da 15 mL	Corning	430790
Provetta tondo inferiore in polistirene da 5 mL con tappo del filtro cellulare	BD-Falcon	352235
Etanolo	Gadot	64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL	Sigma	R4875
Propidiom ioduro 1 mg/mL	Sigma	P4170
Parafilm	Parafilm	PM-996
1,5 mL DNA LoBind Eppendorf provette	Eppendorf	22431021
BSA	Sigma	A7906
1,7 mL MaxyClear provetta	Perline magnetiche Axygen	MCT-175-C
- Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881
Ultrasuoni	Covaris	serie M  -530092
50 µ L microTUBE AFA Tappo a vite in fibra 6 x 16 mm	Fluorimetro Covaris	520096
Qubit	Invitrogen
Qubit dsDNA Kit di analisi ad alta sensibilità (HS)	Invitrogen	Q32854
Elettroforesi 2200 Sistema di stazioni a nastro	Agilent	D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Sistema Illumina NextSeq Illumina		SY-415-1001
Dneasy kit per la purificazione del DNA	Qiagen	69504
PureProteom Magnetic Stand	Millipore	LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC	DAKO	F7210
FACS sorter	BD	FACSARIA III
FACS software	BD	FACSDiva v 8.0.1