Questo studio descrive metodi per la coespressione mediata da T7 di geni multipli da un singolo plasmide in Escherichia coli usando il sistema plasmid pMGX.
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Articolo metodologico
Inducibile T7 RNA Polymerase-mediato sistema di espressione multigene, pMGX
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La coespressione di molteplici proteine è sempre più essenziale per la biologia sintetica, studiando complessi proteico-proteici e caratterizzando e sfruttando percorsi biosintetici. In questo manoscritto è descritto l'uso di un sistema altamente efficace per la costruzione di operoni sintetici multigene sotto il controllo di una polimerasi RNA T7 indottabile. Questo sistema permette che molti geni siano espressi simultaneamente da un plasmide. In questo caso, un insieme di quattro vettori correlati, pMGX-A, pMGX-hisA, pMGX-K e pMGX-hisK, con il marker selettivo di resistenza a ampicillina o kanamycina (A e K) e posseggono o mancano di una esahistidina N-terminale (Il suo) sono divulgati. Sono forniti protocolli dettagliati per la costruzione di operoni sintetici che utilizzano questo sistema vettoriale, insieme ai dati corrispondenti, che dimostrano che un sistema basato su pMGX contenente cinque geni può essere facilmente costruito e utilizzato per produrre tutte e cinque le proteine codificate in Escherichia coli . Questo sistemaEm e il protocollo consentono ai ricercatori di esprimere in modo frequente moduli multipli complessi e percorsi in E. coli .
Introduzione
La coespressione di molteplici proteine è sempre più essenziale, in particolare nelle applicazioni di biologia sintetica, in cui devono essere espressi più moduli funzionali 1 ; Nello studio dei complessi proteico-proteici, in cui espressione e funzione richiedono spesso co-espressione 2 , 3 ; E nel caratterizzare e sfruttare percorsi biosintetici, in cui ogni gene nel percorso deve essere espresso 4 , 5 , 6 , 7 , 8 . Sono....
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Protocollo
1. Ottenere Geni di Interesse
- Generi sintetici di progettazione.
- Ottimizzare una sequenza genica per l'espressione di E. coli .
- Rimuovere tutti i siti di restrizione problematica dalla sequenza (AvrII, NdeI, EcoRI e XbaI).
- Incorporare siti di restrizione per la clonazione; Si raccomanda un sito 5'-NdeI e un sito 3'-EcoRI. Altri siti possono essere usati, se necessario; Si riferisce alla regione multicloning del plasmide selezionato ( Figura S1- S4 ). Se si desidera, includere un tag di codifica 5 'o 3' per la rilevazione Western blot. <....
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Risultati
In questo studio, l'obiettivo era quello di co-esprimere cinque proteine da un unico plasmide. I frammenti di gene sintetici ottimizzati a cinque codoni che codificano i tag di esahistidine di N- o C-terminali sono stati acquistati in commercio. I geni sintetici sono stati amplificati mediante PCR e clonati individualmente in un vettore PCR-blunt e sequenziati. Per generare il plasmide policistronico, i cinque geni di interesse sono stati prima clonati in un idoneo plasmide pMGX, p.......
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Discussione
La coespressione di geni multipli è sempre più essenziale, in particolare per caratterizzare e ricostituire complessi percorsi metabolici multigene 3 , 4 , 5 . Il sistema pMGX rende coespressione multigene in routine E. coli 6 , 7 , 8 e accessibile a diversi ricercatori. In questo studio sono state dimostrate che cinque protei.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio di Ricerca delle Scienze Naturali e Ingegneria del Canada.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Enzimi | |||
| Fosfatasi alcalina, intestinale del vitello (CIP) | New England Biolabs | M0290S | |
| AvrII | New England Biolabs | R0174S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| XbaI | Nuovo England Biolabs | R0145S | |
| Herculase II Fusion DNA Polimerasi | Agilent Technologies | 600677 | |
| T4 DNA Ligasi | New England Biolabs | M0202S | |
| Nome | Company | Numero di catalogo | Comments |
| >Reagents | |||
| 1 kb Scala del DNA | New England Biolabs | N3232L | |
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX Gel proteici senza macchie | Bio-Rad | 456-8095 | |
| 50x TAE | Fisher Thermo Scientific | BP1332-4 | |
| Agar | Fisher Thermo Scientific | BP1423-500 | |
| Agarosio | Fisher Thermo Scientific | BP160-500 | |
| Ampicilina | Sigma-Alrich | A9518-5G | |
| BL21 (DE3) cellule chimicamente comeptenti | Cellula comeptent preparata internamente | ||
| B-PER Reagente per l'estrazione di proteine batteriche | Fisher Thermo Scientific | PI78243 | |
| dNTP mix | Agilent Technologies | Fornito con kit | |
| di estrazione su gel di polimerasiOmega | D2500-02 | E.Z.N.A Gel Extraction, fornito da VWR Cat 3: CA101318-972 | |
| Glycine | Fisher Thermo Scientific | BP381-1 | |
| His Tag Antibody [HRP], mAb, Mouse | GenScript | A00612 | |
| Substrato HRP chemiluminescente occidentale Immobilon | EMD Millipore | WBKLS0100 | |
| IPTG | Sigma-Alrich | 15502-10G | |
| LB | Fisher Thermo Scientific | BP1426-500 | |
| Metanolo | Fisher Thermo Scientific | A411-20 | |
| Latte scremato istantaneo pastorizzato in polvere | Negozio | Il latte del negozio di alimentari senza nome è adeguato | |
| Membrana di nitrocellulosa | Amersham Protran (GE Healthcare Life Sciences) | 10600007 | Membrana PT 0,45 e micro; m 200 mm x 4 m, fornito da VWR Cat #: CA10061-086 |
| Kit di isolamento del DNA plasmidico | Omega | D6943-02 | E.Z.N.A Plasmid DNA MiniKit I, fornito da VWR Cat #: CA101318-898 |
| pMGX | Boddy Lab | Richiesta dal Boddy Lab Contatto cboddy@uottawa.ca | |
| Primer | Tecnologie del DNA | Progettare i primer secondo necessità per il gene desiderato | |
| Tecnologie per la vita dei geni sintetici | Progettare e ottimizzare secondo necessità | ||
| Carta da filtro a macchia spessa | Bio-Rad | 1703932 | |
| base Tris | BioShop | TRS001.1 | |
| Tween-20 | Sigma-Alrich | P9416-50ML | |
| XL1-Blue celle chimicamente competenti Cella | Comeptent preparata in casa | ||
| Name | Azienda | Numero di catalogo | Comments |
| Equipment | |||
| BioSpectrometer | Eppendorf | RK-83600-07 | |
| Scatola di gel - PAGINA | Bio-Rad | 1658005 | Mini-PROTEIN Tetra Vertical Electrophoresis Cell |
| Gel Imager | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| Incubatore-forno | Fisher Thermo Scientific | 11-690-650D | Isotemp |
| Incubatore-agitatore | Fisher Thermo Scientific | SHKE6000-7 | MaxQ 6000 |
| Personna Rasoi | Fisher Thermo Scientific | S04615 | |
| Alimentatore | Bio-Rad | S65533Q | FB300 |
| Transilluminatore | VWR International | M-10E,6W | |
| Thermocylcer | Eppendorf | Z316091 | Mastercycler Personal, fornito da Sigma |
| UV Face-Shield | 18-999-4542 | ||
| Waterbath | Fisher Thermo Scientific | 15-460-2SQ | |
| Western Transfer Apparatus | Bio-Rad | 1703935 | Mini-Trans Blot Cell |
Riferimenti
- Purnick, P. E. M., Weiss, R. The second wave of synthetic biology: from modules to systems. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10 (6), 410-422 (2009).
- Bieniossek, C., et al. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.<....
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Ristampe e permessi
