Articolo metodologico

Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti

DOI:

10.3791/55242

⸱

11 maggio 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan, 2IRCCS. Istituto Ortopedico Galeazzi, 3PRC, CNRS, IFCE, Université de Tours, INRA, 4PAO, INRA, 5Clinique des Animaux de Compagnie et des Équidés, Université de Liège, 6University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo manoscritto descrive un approccio sperimentale per caratterizzare morfologicamente e biochimicamente i ovociti dei cavalli. In particolare, il presente lavoro illustra come raccogliere oociti di cavalli immaturi e maturi mediante raccolta di ovuli guidati da ultrasuoni (OPU) e come indagare la segregazione del cromosoma, la morfologia del mandrino, l'acetilazione degli istoni globali e l'espressione di mRNA.

Abstract

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Il campo della riproduzione assistita è stato sviluppato per trattare l'infertilità in donne, animali da compagnia e specie in pericolo. Nel cavallo, la riproduzione assistita consente anche la produzione di embrioni da parte di artisti di alto livello senza interrompere la loro carriera sportiva e contribuisce ad aumentare il numero di puledri provenienti da greggi di alto valore genetico. Il presente manoscritto descrive le procedure utilizzate per la raccolta di ovociti immature e mature da ovari a cavallo mediante prelevamento di ovuli (OPU). Questi oociti sono stati poi usati per indagare l'incidenza di aneuploidy adattando un protocollo precedentemente sviluppato nei topi. In particolare, i cromosomi ei centrometi di oociti metafase II (MII) sono stati etichettati in fluorescenza e contati su piani focali sequenziali dopo la scansione a microscopio laser confocale. Questa analisi ha rivelato una maggiore incidenza nel tasso di aneuploidy quando ovociti immature sono stati raccolti dai follicoli e maturati in vitro rispetto aIn vivo. Immunostaining per tubulin e la forma acetilata di istone 4 a residui di lisina specifici hanno anche rivelato differenze nella morfologia del mandrino meiotico e nel modello globale di acetilazione istone. Infine, l'espressione di mRNA che codificano le deacetilasi dell'istone (HDACs) e acetil-transferasi (HAT) è stata studiata mediante trascrizione inversa e PCR quantitativa (q-PCR). Nessuna differenza nell'espressione relativa dei trascritti è stata osservata tra ovociti maturi in vitro e in vivo . In accordo con un silenziamento generale dell'attività trascrizionale durante la maturazione di oociti, l'analisi della quantità totale di trascritti può rivelare solo la stabilità o la degradazione della mRNA. Pertanto, questi risultati indicano che potrebbero essere interessate altre normative traslazionali e post-traduzionali.

Nel complesso, il presente studio descrive un approccio sperimentale che caratterizza morfologicamente e biochimicamente l'ovocita dei cavalli, una ceLl tipo che è estremamente impegnativo da studiare a causa della scarsa disponibilità di campioni. Tuttavia, può espandere le nostre conoscenze sulla biologia riproduttiva e sulla sterilità in specie monovulatorie.

Introduzione

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Una vasta gamma di tecniche di riproduzione assistita è stata sviluppata per trattare l'infertilità in donne, animali da compagnia e specie in pericolo. Una delle procedure più comuni nelle impostazioni cliniche è il recupero di oociti di fase metafase II (MII) dai follicoli ovarici mediante aspirazione transvaginale guidata da ultrasuoni, prelevamento ovulo (OPU) 1 . Questi oociti vengono poi fecondati in vitro (IVF), con gli embrioni risultanti impiantati in un utero ricevente. Gli oociti di fase MII (maturi) vengono recuperati a seguito della somministrazione di gonadotropine esogene. Tuttavia, questo trattamento è associato, in alcuni pazienti, allo sviluppo di sindrome da iperstimolazione ovarica (OHSS) 2 .

Sfruttando la capacità intrinseca di ovociti immature (GV-stage) completamente coltivati ​​a riprendere spontaneamente la meiosi una volta isolata dai loro follicoli, è possibile ottenere oociti maturi senza somministrazioneGonadotropina 3 . Questa procedura è chiamata oocyte in vitro maturazione (IVM) e rappresenta un approccio meno drogato, meno costoso e più paziente per la tecnologia riproduttiva assistita. Tuttavia, il successo dello sviluppo degli embrioni con ovociti in vitro è generalmente inferiore a quello con oociti maturi in vivo 4 , 5 . Una possibile spiegazione è che gli ovociti maturi in vitro sono maggiormente colpiti da errori nella segregazione del cromosoma e l'aneuploidy risultante compromette lo sviluppo embrionale normale 6 .

La comprensione della base molecolare della mis-segregazione cromosomica durante l'IVM potrebbe infine fornire il pieno potenziale di questa tecnica. In questo senso, l'approccio sperimentale utilizzato per indagare le caratteristiche morfologiche e biochimiche degli oociti in vitro, confrontati con la maturazione in vivoEd oociti qui descritti sono 7 , 8 . In particolare, le procedure per l'OPU di ovociti immature e mature e l'IVM di ovociti immature sono illustrati utilizzando cavalli adulti e ciclisti naturalmente come modello sperimentale. Allora, l'immunofluorescenza e l'analisi delle immagini vengono utilizzati per studiare la segregazione del cromosoma, la morfologia del mandrino e il modello globale dell'acetilazione dell'istone su questi gameti. Infine, un protocollo di trascrizione inversa e PCR quantitativo è descritto per l'analisi dell'espressione mRNA.

Rispetto ai modelli animali roditori, i cavalli non consentono manipolazione genetica, sono meno facili da manipolare e richiedono una costosa manutenzione. Tuttavia, questo modello sta guadagnando un notevole interesse per lo studio della maturazione delle ovaie 9 , 10 a causa della somiglianza con la fisiologia ovarica umana 11 , 12 </ Sup>. Inoltre, lo sviluppo di protocolli affidabili di IVM-IVF nel cavallo ha un notevole interesse economico, in quanto consentirebbe un aumento del numero di puledri da greggi di alto valore genetico.

Una delle limitazioni di effettuare esperimenti su oociti, in particolare nelle specie monovulatorie, è la disponibilità limitata del campione. Questo limite è stato superato qui regolando un approccio, precedentemente sviluppato nei topi, a oociti di cavalli 13 , 14 per effettuare il conteggio dei cromosomi che minimizza la perdita di campioni (vedere la discussione per un confronto con altre tecniche disponibili). Inoltre, è stato ottimizzato un protocollo di colorazione a triplo fluorescenza per condurre analisi multiple sullo stesso campione e le analisi q-PCR sono state eseguite solo su piscine di 2 oociti.

Nel complesso, il presente studio descrive un approccio sperimentale mirato a morfologicamente e biochimicamente chaRacterize l'oocyte di cavallo, un tipo di cellule che è estremamente impegnativo da studiare a causa della bassa disponibilità del campione. Tuttavia, può espandere la nostra conoscenza della biologia riproduttiva e della sterilità delle specie monovulatorie.

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Protocollo

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Tutte le procedure sono state approvate dal comitato per la cura e l'uso degli animali CEEA Val de Loire numero 19 e sono state eseguite in conformità ai principi guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.

1. Raccolta di Oocyte e maturazione in vitro

  1. Raccolta di ovuli
    1. Daily valutare per ultrasuoni il diametro dei follicoli ovarici in una coorte di marne adulte. Alla comparsa di un follicolo ≥33 mm (follicolo dominante), inietta la cavalla con 1.500 UI di gonadotropina corionica umana (hCG) nella parte superiore della vena jugulare (iv).
      1. Prima di effettuare l'iniezione, tamponare l'area con l'alcool, individuare il solco giallo e posizionare il pollice 2-3 cm sotto il sito di iniezione per indurre la vena a salire. Inserire l'ago quasi parallelo al collo e aspirare per assicurarsi che l'ago sia nella vena (il sangue entrerà nella siringa). A questo punto, iniettare; HCG indurirà la mAtura del oocito nel follicolo dominante.
    2. 35 h dopo l'iniezione hCG, sedano la mare con detomidina (15 μg / kg iv), butorfanolo tartrato (10 μg / kg iv) e bromuro di butilscopolamina (0,2-0,3 mg / kg, 15 ml / mare, iv).
    3. Collegare l'ago alla sonda ad ultrasuoni. Inserire la sonda ad ultrasuoni vaginale e tenere la ovaia trasversalmente per affrontare la sonda ad ultrasuoni. Indica un operatore per manovrare l'ago e l'altro per tenere l'ovario in posizione, con il follicolo di fronte alla sonda ad ultrasuoni . Inizia dall'ovario con il follicolo dominante.
    4. Puntare la parete vaginale e la parete del follicolo dominante con l'ago (le sonde a ultrasuoni per OPU sono dotate di un canale per l'ago collegato ad un sistema di aspirazione); Theneedle sarà visibile nell'immagine ecografica.
    5. Aspirare il fluido follicolare in un tubo conico da 50 mL collegato al sistema di aspirazione. Versare il contenuto del conoTubo in un grande piatto di Petri e cercare il complesso cumulo-oocyte (COC) usando uno stereomicroscopio.
    6. Dal momento che il COC non viene sempre recuperato con il fluido follicolare, scorrere il follicolo con la soluzione di Dulbecco modificata con tampone fosfato (DPBS) contenente 5 IU / mL di eparina a 37 ° C. Esaminare DPBS per la presenza di COC, come precedentemente descritto per il liquido follicolare nel punto 1.1.5. Scorrere più volte fino a quando il COC viene recuperato.
    7. Una volta che il COC dal follicolo dominante viene recuperato, puntare e scuotere i follicoli ≥5 e ≤25 mm, come descritto per il follicolo dominante nei passaggi 1.1.3-1.1.4; I follicoli ≥5 e ≤25 non esprimono l'ormone luteinizzante / recettore di choriogonadotropina (LHCGR) e quindi i loro oociti non maturano in risposta a hCG e verranno raccolti a livello di GV (immaturo). Soltanto mantenere COC con diversi strati completi di cellule cumuli e marrone, finemente granulato ooplasma. Scartare gli altri.
    8. Alla fine dell'OPU, inLa mare con benzil-penicillina 15.000 UI / animale per prevenire l'infezione.
    9. Casa la mare in una tranquilla e pulita stabile per almeno 2 ore. Controllare i segni della consapevolezza determinando la posizione delle orecchie, la reazione agli stimoli ( ad esempio, il rumore) e l'andatura prima di tornare alla mare di compagnia di altri animali.
  2. Maturazione in vitro
    1. TCM199 tamponato HEPES caldo (20 mM Hepes) aggiunto a 1,790 IU / L di eparina, 0,4% di albumina bovina serba (BSA), penicillina e streptomicina a 37 ° C. Preparare questo supporto in anticipo. Filtro-sterilizzare e mantenerlo a 4 ° C per un massimo di 6 mesi.
    2. Preparare il mezzo IVM integrando TCM199 (25 mM NaHCO3) con NaHCO 3 con 50 ng / ml fattore di crescita epidermico (EGF) e 20% siero di vitello 7 . Utilizzare NaHCO 3 -fferrato TCM199 entro 3 settimane dall'apertura di una nuova bottiglia. Preparare il FEG in anticipo come scorte 100x, congelarlo a -20 ° C, E utilizzarlo entro 6 mesi. Dispensare 500 μL nei pozzetti di un piatto da 4 pozzetti e incubare in aria umidificata con 5% di CO 2 a 38,5 ° C per almeno 2 ore.
    3. Dopo il recupero dei COC dai follicoli ≥5 e ≤25 mm, metterli in un piatto di petri (diametro 3,5 cm) riempito con 2 mL di HEPES-TCM199. Spostare i COC in diverse aree del piatto per lavare i detriti cellulari.
    4. Trasferire i COC al mezzo IVM e incubare per 28 h in aria umidificata con 5% CO 2 a 38,5 ° C.

2. Immunofluorescenza e analisi delle immagini

  1. Conteggio del cromosoma
    1. Dopo la raccolta dal follicolo dominante o alla fine di IVM, incubare i COC con monastrillo da 100 μM per 1 h in aria umidificata con 5% di CO 2 a 38,5 ° C. Preparare monastrol in anticipo come scorte 100x e conservarlo a -20 ° C per un anno.
    2. Rimuove le coppie di cumuloTrattandoli con ialuronidasi del 0,5% o pipettando delicatamente; Rimuovere la zona pellucida trattandola in 0,2% di proprietà. Preparare ialuronidasi e pronasi in anticipo come scorte 10x e conservarle a -20 ° C per un periodo di 1 anno.
    3. Fissare gli oociti in 4% di paraformaldeide in DPBS per 15 minuti a 38,5 ° C seguito da altri 45 minuti a 4 ° C.
      ATTENZIONE! Indossare equipaggiamento protettivo personale durante la manipolazione di paraformaldeide e smaltire materiali contaminati in conformità con le linee guida per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
    4. Lavare gli oociti trasferendo sequenzialmente in 3 pozzetti riempiti di 500 μL di DPBS integrati con 0,1% di alcool polivinilico (PVA). Permeabilizzare in 0,3% Triton X-100 per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
    5. Bloccare l'incubazione non specifica del binding in DPBS completata con 1% di albumina bovina serba (DPBS-1% BSA) e 10% di siero normale asino per almeno 30 minuti a RT. I campioni possono essere conservati in soluzione bloccante a 4 ° C per 3-4 giorni.
    6. Per la colorazione primaria, incubare gli oociti in anti-Aurora B fosfato-Thr232 coniglio con DPBS integrato con 1% BSA (diluizione 1:50) a 4 ° C per una notte.
    7. Lavare gli oociti come descritto nel punto 2.1.4. Incubare gli oociti in una soluzione di IgG anti-coniglio (1: 100 in DPBS-1% BSA) di isotiocianato tetra-metilrhodamina (TRITC) -conjugato per 1 h a RT al buio.
    8. Lavare gli oociti come descritto nel punto 2.1.4 e quindi posizionare 3-4 oociti in una goccia di supporto di montaggio anti-indurimento anti-indurimento integrato con 20 μM YOPRO1 su uno scivolo in vetro. Ripetere la procedura fino a quando tutti gli oociti sono montati (3-4 oociti per diapositiva).
    9. Lasciare che gli oociti si stabiliscano per circa 10 minuti nel supporto di montaggio, quindi copriscano con un coperchio. Per evitare di schiacciare gli ovociti, applicare due strisce di nastro biadesivo prima di posare la copertura sullo scivolo in vetro.
      NOTA: Questa precauzione garantirà anche che tutti i campioni siano ugualmente compressi tra il vetro di vetroDe e la coverlip. Le diapositive in vetro possono essere congelate a -20 ° C e imaged durante i 2-3 giorni successivi.
    10. Immagini i campioni su un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo 60X usando i canali rossi (centromeres) e quelli verdi (cromosomi) 7 , 13 , 14 , 20 , 21 . Esaminare i campioni che attraversano l'intera piastra metafisica sull'asse z, con gradini ogni 0,35 μm. Salva le immagini digitalizzate di ogni singolo piano.
    11. Contare i centromeres in sezioni confocali di serie usando la funzione di conteggio delle celle del software NIH ImageJ (disponibile all'indirizzo: https://imagej.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html).
      NOTA: evitare un ripetuto conteggio di centromeres che appaiono nelle sezioni adiacenti identificando i centrometri che appaiono, rimangono e scompaiono in sezioni sequenziali con un codice numerico.
    12. Ripetere il co cromosomicoDisinserire nel passaggio 2.1.11 con un operatore indipendente.
      NOTA: Classificare gli oociti come euploidi (32 cromosomi), iperploidi (> 32) o ipoploidi (<32).
  2. Morfologia del mandrino e acetilazione dell'istone
    1. Dopo la raccolta dal follicolo dominante o alla fine dell'IVM, rimuovere le cellule cumulo mediante trattamento in 0,5% di ialuronidasi o con pipetta gentile, come descritto nel punto 2.1.2.
    2. Lavare gli oociti in DPBS-PVA come nel punto 2.1.4 e fissarli in paraformaldeide al 2,5% per 20 minuti a 38 ° C. Lavare intensamente, come descritto nel punto 2.1.4, e permeabilizzare in 0,1% di Triton X-100 per 5 minuti a RT.
      NOTA: Indossare dispositivi di protezione individuale durante la manipolazione di paraformaldeide e smaltire i materiali contaminati in conformità con le linee guida per lo smaltimento dei rifiuti pericolosi.
    3. Blocco di incubazione non specifica in DPBS con complemento di albumina bovina serba del 2% (DPBS - 2% BSA), 0,05% saponina e 10% di siero normale di asinaR 2 ore a RT.
      NOTA: I campioni possono essere conservati in soluzione bloccante a 4 ° C per 3 - 4 giorni.
    4. Per la colorazione primaria, incubare l'oocyte in mouse anti-alfa-tubulina (1: 150) e coniglio anti-acH4K16 (1: 250) in DPBS-2% BSA con 0,05% di saponin a 4 ° C durante la notte.
    5. Lavare gli oociti come nel punto 2.1.4. Incubare gli oociti in una soluzione di IgG anti-mouse IgG (1: 500) con gomma coniugata fluorescente fluorescente verde e IgG anti-coniglio (1: 100) conica con TRITC in DPBS-2% BSA con 0,05% saponin per 1 ora RT nel buio.
    6. Lavare gli oociti come indicato al punto 2.1.4 e quindi posizionare 3-4 oociti in una goccia del mezzo di montaggio non anticarico e anti-sbiadito integrato con 1 μg / mL 4 ', 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) Su una lastra di vetro.
    7. Montare gli oociti sulle diapositive di vetro come descritto nel punto 2.1.8.
    8. Immagini i campioni su un microscopio confocale a scansione laser con un obiettivo 60x utilizzando i canali rossi (acH4K16), verde (alfa-tubulina) e blu (DNA).
      NOTA: mantenere costanti le impostazioni del laser per i canali rossi e blu durante l'acquisizione di tutti i campioni. Esaminare i campioni che attraversano l'intero mandrino meiotico e la piastra metafisica sull'asse z, con gradini ogni 0,35 μm. Salvare le immagini digitalizzate (piani singoli e immagini 3D proiettate).
    9. Misurare la lunghezza del mandrino polo a polo e il diametro del mandrino alla larghezza massima dell'immagine proiettata utilizzando la funzione di misura del software NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30 .html). Ripetere ogni 3 volte e calcolare la media.
    10. Quantificare la relativa fluorescenza di acH4K16 usando la funzione di densità integrata del software NIH ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146-30.html). Normalizzalo per la densità integrata della colorazione DAPI.

3. Analisi dell'espressione di mRNA

  1. Dopo che i COC sono stati recuperati dai follicoli da 5 a 25 mm, raccogliere la cellula granulosaChe rimase nel piatto di Petri e lavi due volte in DPBS freddo centrifugando a 10.600 xg per 2 minuti. Congelare in azoto liquido. Conservare i campioni a -80 ° C per un massimo di 6 mesi; Le cellule serviranno per la curva standard.
  2. Rimuovere con cautela tutte le cellule cumulo, come descritto nel punto 2.1.2, da immature (GV), in vitro mature e da oociti maturi in vivo .
  3. Lavare gli oociti, come descritto al punto 2.1.4, in DPBS-PVA, raccogliendoli singolarmente in volumi di 1 μL e superare 2 μL RNALater. Snap-freeze in azoto liquido. Conservare i campioni a -80 ° C per un massimo di 6 mesi.
  4. Aggiungere 2 pg di RNA di Luciferasi a ciascun campione come uno spike-in. Raccogliere gli oociti 2 x 2 e estrarre l'RNA totale usando un kit a base di filtri a membrana di silice, idoneo a recuperare RNA da piccoli campioni.
  5. Reverse-trascriva l'RNA in 10 μL con esame casuale di 0,25 μg e la trascrizione trasversa inversa del virus di leucemia Moloney di topo per 1 h a 37 & 176; C. Conservare i campioni a -20 ° C per un massimo di 6 mesi.
  6. Diluire il cDNA dalle cellule granulose in acqua libera da RNAse a 50 ng / μL. Diluire serialmente questa soluzione 1:10 per ottenere 5 ng / μL, 0,5 ng / μL, 0,05 ng / μL e 0,005 ng / μL soluzioni.
  7. Riunire le reazioni in triplice quantità in un volume totale di 20 μL per reazione utilizzando cDNA equivalente a 0,05 oociti come substrato o 5 μL delle diluizioni seriali del cDNA di cellule granulose, 10 μL di supermix verde verde SYBR e 0,3 μM di ciascun primer specifico ( Tabella 1 ).
  8. Eseguire la reazione in un ciclotermico utilizzando un protocollo a tre fasi: 95 ° C per 30 s, 60 ° C per 30 s e 72 ° C per 20 s, ripetuti 40 volte. Infine, acquisite la curva di fusione, a partire da 60 ° C, e aumentate la temperatura di 0,5 ° C ogni 20 s fino a 95 ° C.
  9. Valutare la quantità di partenza (SQ) dell'MRNA specifico nei campioni di oociti utilizzando la curva standardF "> 15 calcolato sulla base del campione di cellule granulosa Esprimere i dati come rapporto tra il SQ del gene di interesse e gli SQ dei geni di mantenimento.

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Risultati

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I risultati originali di questi esperimenti sono stati descritti in profondità in precedenza 7 e sono riportati qui come un esempio di risultati che possono essere ottenuti utilizzando i protocolli descritti.

Tasso di maturazione

Dei 32 COC recuperati da OPU da follicoli dominanti, 28 (88%) erano allo stadio MII. Quattordici dei 58 COC raccolti ...

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Discussione

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Anche se l'IVM è stato eseguito in cavalli per più di 20 anni 16 , non sappiamo ancora se l'oocyte possa essere l'origine dell'aneuploidy embrionale, come è stato proposto per l'uomo17. La ragione è probabilmente che la preparazione di spread di oociti per il conteggio dei cromosomi comporta una notevole perdita di campioni. Tenuto conto di questo, è stata condotta un'indagine sui metodi utilizzati per indagare gli errori nella segregazione dei cromosomi per cercare la tec...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori vorrebbero ringraziare Fabrice Vincent per il supporto con la microscopia confocale a scansione laser (LSCM) e Philippe Barrière e Thierry Blard per eseguire la scansione giornaliera di ovaie e hCG. Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal progetto "Regione di Sardegna e Regione Lombardia" "Ex Ovo Omnia" (n. 26096200 a AML); La borsa di studio "L'Oreal Italia per la Donne e la Scienza 2012" (contratto 2012 a FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Agenzia esecutiva di ricerca (REA) "Pro-Ovum" (Grant n ° 303640 a VL); E dalla Scuola post-dottorata di agricoltura e veterinaria, cofinanziata dal Fondo sociale europeo, Programma operativo settoriale per lo sviluppo delle risorse umane 2007-2013 (n. POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 a IM). La raccolta inoculare in vivo è stata finanziata dall'Institut Français du Cheval et de l'Equitation.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
sonda ecograficaAlokaUST-5820-7,5
gonadotropina corionica umanacentravetCHO0041.500 unità/animale
EV detomidinacentravetMED0109 - 15 &; g/kg EV
butilscopolamina bromurecentravetEST0010,2 mg/kg
StereomicroscopioIV NIKONSMZ-2B
butorfanolocentravetDOL00310µ g/kg IV
benzil-penicillinacentravetDEP203 IM15.000 UI/animale
TCM199Sigma-AldrichM3769 10X1Lpolvere per hepes-tamponed TCM199
Hepes sale sodicoSigma-AldrichH3784-100G
albumina sierica bovinaSigma-AldrichA8806
eparina Sigma-AldrichH3149-10KU
NaHCO3-tamponed TCM199Sigma-AldrichM2154-500MLliquido per
fattore di crescita epidermicoSigma-AldrichE4127
siero per vitelli neonatiSigma-AldrichN4762-500ML
Piastre a 4 pozzettiIncubatrice per 144444
HeraeusBB6060
monastrolSigma-AldrichM8515
ialuronidasiSigma-AldrichH3506
pronasiSigma-AldrichP5147
paraformaldeideSigma-AldrichP6148
alcool polivinilicoSigma-Aldrich341584
triton-X 100Sigma-AldrichT8787
siero d'asino normaleSigma-AldrichD9663
coniglio anti-Aurora B fosfo-Thr232BioLegend636102
asino coniugato TRITC anti-coniglio IgGVector Laboratories711-025-152
Vecta-ShieldVector LaboratoriesH-1000
YOPRO1Thermofisher Microscopio aY3603
LSM 780confocale Zeiss
LSM 700Software Zeiss
ImageJrsb.info. nih.gov/ij/download.htmlrisorsa
mouse anti-alfa-tubulinaSigma-AldrichT8203
coniglio anti-acH4K16Upstate Biotecnologia07-329
AlexaFluor 488-coniugato asino anti-topo IgGLife TechnologiesA21202
4',6-diamidino-2-fenilindoloSigma-AldrichD8417DAPI
centrifugaEppendorf5417R
RNALaterInvitrogenAM7020
Luciferase RNAPromegaL4561
Kit di isolamento dell'RNA PicoPureApplied Biosystems12204-01
esameri casualiThermofisher ScientificN8080127
il virus della leucemia di Moloney trascrittasi inversaThermofisher Scientific28025013
SYBR green supermixBioRad1708880
primer specificiSigma-Aldrichprimer specifici sono stati progettati utilizzando il software Primer3Plus (risorsa gratuita)
ciclatore termicoBioRadMyiQ
topo monoclonale anti-CENPAAbcamab13939
topo monoclonale anti-Aurora BAbcamab3609
medio IVM NUNCLON scansione laser confocale Scientific Microscopio a scansione laser gratuita

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467(1984).
  2. Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
  3. Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
  4. Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
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