La perdita irregolare del mezzo da micropiastre influisce sulla riproducibilità del multicellulare formazione del tumore sferoide uniforme. Il miglioramento delle condizioni di coltura per ridurre la perdita significativa medio migliorare la riproducibilità della formazione sferoide ei risultati dei dosaggi sferoidali a base usando la tecnica liquido-overlay.
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Articolo metodologico
Evaporazione di riduzione Cultura Condizione Aumenta la riproducibilità dei multicellulare Spheroid Formazione in micropiastre
In questo articolo
Sommario
Abstract
Modelli tumorali che strettamente imitano le condizioni in vivo stanno diventando sempre più popolare in scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo per lo screening di potenziali farmaci anti-cancro. Sferoidi tumorali multicellulari (MCTSes) imitano in modo efficace le condizioni fisiologiche di tumori solidi, che li rende eccellente in modelli in vitro per l'ottimizzazione di piombo e validazione del target. Tra le varie tecniche disponibili per la cultura MCTS, il metodo liquido-overlay su agarosio è uno dei metodi più economiche per la generazione MCTS. Tuttavia, il trasferimento affidabile di culture MCTS utilizzando liquido-overlay per high-throughput screening può essere compromessa da una serie di limitazioni, tra cui il rivestimento di piastre microtiter (MP) con agarosio e l'irriproducibilità di formazione MCTS uniforme attraverso pozzi. Mp sono significativamente inclini a effetti di bordo che derivano da eccessiva evaporazione del mezzo dall'esterno della piastra, impedendo l'uso della intera piastra per drogatest. Questo manoscritto fornisce miglioramenti tecnici dettagliati alla tecnica liquido-overlay per aumentare la scalabilità e la riproducibilità di formazione uniforme MCTS. Inoltre, dettagli su un semplice, strumento software semi-automatico, e universalmente applicabile per la valutazione delle caratteristiche MCTS dopo trattamento farmacologico è presentato.
Introduzione
Le cellule tumorali nei tumori sono fisiologicamente disposti in un complesso di 3-dimensionale struttura, (3D), circondato da matrice extracellulare e le cellule interagiscono. Come quasi tutte le cellule nei tessuti risiedono in un ambiente 3D, la necessità di più fisiologicamente rilevanti in modelli tumorali in vitro che imitano tratti tumorali ha portato allo sviluppo di varie tecniche di coltura 3D 1, 2, 3. Questi modelli stanno diventando strumenti di ricerca fondamentali per studiare il ruolo del microambiente tumorale sulla metastasi e delle cellul....
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Protocollo
1. Preparazione di piastre rivestite Agarose
- Pesare 0,75 g di basso punto di fusione agarosio e aggiungerlo a 100 ml di mezzo di McCoy 5A (con o senza rosso fenolo) senza siero. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde e agitare ogni 1-2 minuti per sciogliere completamente l'agarosio. Autoclave la soluzione per sterilizzarlo.
- Raffreddare la autoclavato agarosio a circa 70 ° C e filtrata attraverso un 500 mL, 0,22 micron filtro superiore per filtrazione sotto vuoto in un contenitore di flusso laminare. Aliquota della soluzione di agarosio filtrata 0,75% (FAS) in volumi più piccoli se non si utilizza l'intera soluzione in una sola vo....
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Risultati
La perdita irregolare di media, in particolare dai pozzi periferici, è un problema frequente nella parlamentari con piccoli volumi di coltura. Sostanzialmente migliorate condizioni di coltura, come le incubatrici con / sistemi ben controllati temperatura di umidificazione e parlamentari evaporazione di riduzione e coperchi piastra, riducono la perdita significativa di media attraverso pozzi 8. Per misurare la relativa evaporazione, sono stati aggiunti volumi ugual.......
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Discussione
Rivestimento 384 pozzetti TC con filtrata Agarosio
La pratica standard in LOT è utilizzare un punto agarosio bassofondente 1-1,5% per rivestire le piastre, che richiede l'agarosio e / o unità di dosaggio da tenere riscaldata per impedire la gelificazione del agarosio 6. La gelificazione agarosio è potenzialmente preoccupanti durante la preparazione di piastre multiple utilizzando cassette dosaggio liquidi con piccole aperture tubi compresi tra 0,2 e 0,4 mm di diametr.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal ministero ceco dell'Istruzione, della gioventù e dello sport (LO1304) e l'Agenzia Tecnologica della Repubblica Ceca (TE01020028). Gli autori desiderano ringraziare il Dott Lakshman Varanasi per scattare le immagini fisse di coperchi ambientali.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Agarosio | Sigma-Aldrich | A9414 | McCOY a basso punto |
| di fusione 5A Medio | Sigma-Aldrich | M8403 | |
| " rapido" Filtro Filtermax | TPP | 99505 | 0,22 μ m, 500 mL |
| Multidrop™ Dispenser di reagenti combinati | Thermo Fisher Scientific | 5840300 | |
| Cassetta di erogazione per tubi piccoli | Thermo Fisher Scientific | 24073295 | Punta in metallo |
| Piastra TC a 384 pozzetti | PerkinElmer | 6057308 | Tipo di piastra - CellCarrier |
| Cassetta di erogazione del tubo standard | Thermo Fisher Scientific | 24072670 | |
| MicroClime Coperchio ambientale | Labcyte | LLS-0310 | |
| DMSO | Incubatore rotante Sigma | D4540 | |
| (SteriStore ) | HighRes Biosolutions | 23641 | Numero di serie: D00384 |
| Dispenser per lavatrice per micropiastre | BioTek | Modello non specificato | : EL406 |
| Sistema di imaging ad alto contenuto (CellVoyager) | Yokogawa Electric Corporation | Modello non specificato | : CV7000 |
| Orange G | New England Biolabs | B7022S | |
| TrypLE™ Reagente espresso di dissociazione cellulare ricombinante | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | Senza fenolo |
Riferimenti
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In vitro three-dimensional (3D) models in cancer research: An update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically relevant in vitr....
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Ristampe e permessi
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