Articolo metodologico

Evaporazione di riduzione Cultura Condizione Aumenta la riproducibilità dei multicellulare Spheroid Formazione in micropiastre

DOI:

10.3791/55403

⸱

7 marzo 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular and Translational Medicine, Palacky University in Olomouc

In questo articolo

Sommario

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La perdita irregolare del mezzo da micropiastre influisce sulla riproducibilità del multicellulare formazione del tumore sferoide uniforme. Il miglioramento delle condizioni di coltura per ridurre la perdita significativa medio migliorare la riproducibilità della formazione sferoide ei risultati dei dosaggi sferoidali a base usando la tecnica liquido-overlay.

Abstract

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Modelli tumorali che strettamente imitano le condizioni in vivo stanno diventando sempre più popolare in scoperta di nuovi farmaci e lo sviluppo per lo screening di potenziali farmaci anti-cancro. Sferoidi tumorali multicellulari (MCTSes) imitano in modo efficace le condizioni fisiologiche di tumori solidi, che li rende eccellente in modelli in vitro per l'ottimizzazione di piombo e validazione del target. Tra le varie tecniche disponibili per la cultura MCTS, il metodo liquido-overlay su agarosio è uno dei metodi più economiche per la generazione MCTS. Tuttavia, il trasferimento affidabile di culture MCTS utilizzando liquido-overlay per high-throughput screening può essere compromessa da una serie di limitazioni, tra cui il rivestimento di piastre microtiter (MP) con agarosio e l'irriproducibilità di formazione MCTS uniforme attraverso pozzi. Mp sono significativamente inclini a effetti di bordo che derivano da eccessiva evaporazione del mezzo dall'esterno della piastra, impedendo l'uso della intera piastra per drogatest. Questo manoscritto fornisce miglioramenti tecnici dettagliati alla tecnica liquido-overlay per aumentare la scalabilità e la riproducibilità di formazione uniforme MCTS. Inoltre, dettagli su un semplice, strumento software semi-automatico, e universalmente applicabile per la valutazione delle caratteristiche MCTS dopo trattamento farmacologico è presentato.

Introduzione

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Le cellule tumorali nei tumori sono fisiologicamente disposti in un complesso di 3-dimensionale struttura, (3D), circondato da matrice extracellulare e le cellule interagiscono. Come quasi tutte le cellule nei tessuti risiedono in un ambiente 3D, la necessità di più fisiologicamente rilevanti in modelli tumorali in vitro che imitano tratti tumorali ha portato allo sviluppo di varie tecniche di coltura 3D 1, 2, 3. Questi modelli stanno diventando strumenti di ricerca fondamentali per studiare il ruolo del microambiente tumorale sulla metastasi e delle cellule risposta alle terapie in 3D 2. Inoltre, rispetto al 2-dimensionali culture (2D) di cella 4, modelli 3D consentono una migliore comprensione delle interazioni tumore-stroma, che interessano vie di segnalazione cellulare.

sferoidi tumorali multicellulari (MCTSes) su linee cellulari tumorali sono spesso utilizzati nella cella 3D cmodelli ULTURA a causa della loro relativa vicinanza ai tumori in vivo. Delle diverse tecniche in uso, la tecnica liquido overlay (LOT) di generazione MCTS su piastre di agarosio rivestite ha raggiunto livelli significativi per l'ottimizzazione di piombo e di destinazione convalida 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11. Questo è evidente dai recenti studi che sono stati con successo in grado di eseguire schermi pilota di librerie di composti nelle culture MCTS utilizzando Lotto 6, 7. Tuttavia, well-to-bene variabilità MCTS morfologia e la crescita a causa della perdita irregolare di evaporazione indotta di media sono ostacoli comuni che accompagnano la LOT utilizzando micropiastre (MPS). Di conseguenza, la formazione di non uniforme MCTSes compromette la significatività e rilevanzaI dati ottenuti in saggi farmacologici 8, 12, 13. Oltre ai problemi di riproducibilità, un altro problema pratico che colpisce saggi high throughput LOT-base è il rivestimento dei mp con agarosio utilizzando liquido automatica unità di erogazione. Sebbene l'unità di dosaggio può essere mantenuto riscaldato per evitare la gelificazione agarosio, l'intasamento della cassetta erogazione e il tubo è un potenziale preoccupazione per sistemi robotici 6.

Per superare alcune di queste sfide, abbiamo recentemente messo a punto alcune modifiche nella LOT per MCTS cultura 8. Queste modifiche si basano principalmente sui possibili modi per prevenire la perdita media irregolare dai deputati con strumenti che si trovano comunemente nei laboratori high-throughput screening. Una procedura dettagliata della LOT modificato per la generazione di MCTSes uniformemente dimensioni e riproducibili attraverso 3Piastre 84 pozzetti (WP) è presentato qui. Il manoscritto presenta anche una routine semi-automatizzato per la valutazione delle dimensioni MCTS, particolarmente in parzialmente disintegrate, MCTSes trattati con farmaci che non hanno un confine ben definito per la misura della sezione trasversale.

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Protocollo

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1. Preparazione di piastre rivestite Agarose

  1. Pesare 0,75 g di basso punto di fusione agarosio e aggiungerlo a 100 ml di mezzo di McCoy 5A (con o senza rosso fenolo) senza siero. Riscaldare la soluzione in un forno a microonde e agitare ogni 1-2 minuti per sciogliere completamente l'agarosio. Autoclave la soluzione per sterilizzarlo.
  2. Raffreddare la autoclavato agarosio a circa 70 ° C e filtrata attraverso un 500 mL, 0,22 micron filtro superiore per filtrazione sotto vuoto in un contenitore di flusso laminare. Aliquota della soluzione di agarosio filtrata 0,75% (FAS) in volumi più piccoli se non si utilizza l'intera soluzione in una sola volta. Conservare agarosio soluzione asetticamente pronta per l'uso in una stanza fredda o 4 ° C frigorifero per 4 settimane.
  3. Attaccare un piccolo tubo con una plastica o di cassette erogazione punta metallica per un dispensatore di reagente Combi e adescare la cassetta con il 70% di etanolo (EtOH) e poi con sterile phosphate-buffered saline (PBS) in una scatola di flusso.
  4. Prima dell'uso, riscaldare un'aliquota memorizzata di FAS i n il forno a microonde per sciogliere esso. Prime la cassetta di erogazione con la soluzione di agarosio e cappotto 384 pozzetti, coltura tissutale (TC) -treated "speciale" micropiastre con 15 ml di FAS. Lasciare che il agarosio nel piatto si raffreddi per 15-20 minuti prima della semina le cellule. Conservare le piastre di agarosio rivestite asettico, avvolto in un sacchetto di polietilene in un ambiente freddo o a 4 ° C e al riparo dalla luce.
    NOTA: Evitare il riscaldamento ripetuto del 0,75% FAS per impedire una variazione della concentrazione di agarosio in soluzione madre. piastre di agarosio rivestite possono essere conservati fino a 2 settimane se conservato nelle condizioni sopra citate. Il FAS non richiede riscaldamento durante il rivestimento di lastre.
  5. Pulire la cassetta di erogazione da adescamento con 70-80 ° C acqua sterile per eliminare ogni residuo di agarosio nelle punte cassette e tubi.

2. cellulare Cultura e Formazione MCTS

  1. cellule HCT116 carcinoma colorettale umano Cultura, come descritto in precedenzalass = "xref"> 8.
  2. Rimuovere il numero richiesto di agarosio rivestite, 384 pozzetti, TC-trattati micropiastre da celle frigorifere e di equilibrare a temperatura ambiente (RT) per 15 minuti.
  3. Preparare il dispensatore di reagente Combi per la semina delle cellule per l'innesco di una cassetta tubo di erogazione di serie con il 70% EtOH e PBS sterile. Regolare il volume semina alla richiesta microlitri e la velocità di erogazione di media utilizzando i pulsanti di impostazione manuale sul dispenser.
    NOTA: L'intero processo di semina cellulare viene effettuata in condizioni sterili e in una scatola di flusso laminare.
  4. Dissociarsi cellule aderenti dal pallone di coltura di tessuto utilizzando un enzima ricombinante cellule dissociazione. Effettuare una sospensione di cellule in un becher sterile con alveoli ad una densità di 2,5 x 10 4 cellule / ml per pozzetto in 50 ml di terreno di coltura completo. Quando semina più 384 WP, mescolare le cellule con un agitatore magnetico per impedire loro di sedimentazione al fondo del bicchiere.
  5. Lasciare che ilpiastre di riposare per 30 minuti a RT e quindi si centrifuga per 15 minuti a 4 x g.
  6. Nel frattempo, fare un coperchio di evaporazione ambientale-riduzione e riempirlo con 8 mL di H 2 O sterile o 5% dimetilsolfossido (DMSO) nei lati corti (sinistra e destra) utilizzando una pipetta da 5 ml (Figura 1A). Innanzitutto, dispensare 4 ml di liquido di riempimento nel trogolo lato sinistro da spazzare la punta della pipetta lentamente su e giù. Ripetere questa operazione con trogolo destra.
    NOTA: Assicurarsi che il liquido aggiunto gli abbeveratoi laterali non unisce al centro del coperchio, e lasciare uno spazio per lo scambio di gas (Figura 1A). L'aggiunta di un eccesso di H 2 O provoca infiltrazioni di H 2 O all'esterno del coperchio e successivamente nei pozzetti esterni delle piastre a 384 pozzetti TC.
  7. Riempire il serbatoio del liquido della piastra TC 384 pozzetti con H 2 O sterile e sostituire i coperchi piastra regolari con i coperchi ambientali contenenti liquido (Figura 2A).
  8. Posizionare le piastre in un incubatore rotativo 37 ° C con il 95% di umidità, 5% di CO 2, e 20% O 2, e permettono alle cellule di aggregano in MCTSes per 4 giorni. Evitare di aprire la porta incubatore per troppo tempo nei giorni successivi al fine di evitare che il livello di umidità dal cadere bruscamente.

3. Scambio medio Utilizzando un sistema robotico

  1. Il giorno 4 dopo la formazione di MCTS, aggiungere 30 ml di media pre-riscaldato per pozzetto utilizzando un dispensatore di micropiastre di lavaggio automatizzato. Consentire le MCTSes a crescere per altri 3 giorni. Sostituire il medium regolarmente ogni 3 giorni, fino a quando raggiungono le dimensioni desiderate per la sperimentazione.
  2. Per aspirare un volume definito di media da ogni pozzetto, regolare empiricamente z -altezza del collettore rondella. Aspirare 30 ml di media per pozzetto e sostituirlo con 30 ml di fresco, di media pre-riscaldato.
    NOTA: impostare la velocità di erogazione e la velocità con cui il collettore di washer viaggia lungonei pozzi al tasso più basso per ridurre al minimo la turbolenza nei pozzetti.

4. Alto-contenuti Imaging di MCTS e semi-automatico Image Analysis

  1. Immagine del MCTS in un sistema di imaging automatizzato ad alta contenuto utilizzando un obiettivo aereo 4X (NA 16).
  2. Impostare il tempo di esposizione di 11 ms e il binning di 4 x 4. Regolare il numero e la spaziatura delle z -Pile e il binning dei pixel come desiderato per l'esperimento di catturare un intero MCTS per pozzetto.
  3. Elaborare le immagini graduale, come descritto nel "readme", impiegando la procedura in casa scritto in linguaggio di programmazione.
    NOTA: Il codice .m e readme .txt file sono disponibili come file di codice supplementari (Figura 1B). Le misure di routine l'area MCTS, assi maggiori e minori, il perimetro e solidità dalle immagini 2D.

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Figura 1:Preparazione dei coperchi ambientali e un diagramma di flusso della routine semiautomatico. (A) Immagine di un coperchio ambientale evaporazione riduzione riempito con il corretto (a sinistra) e l'eccesso (a destra) quantità di liquido di riempimento (qui, 5% DMSO). La freccia indica trogolo lato corto per l'aggiunta di liquido. L'asterisco indica il vuoto nel mezzo del coperchio dopo l'aggiunta del corretto volume di DMSO. (B) Un flusso di lavoro che mostra i passaggi necessari per l'analisi delle immagini di routine semi-automatizzato. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Risultati

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La perdita irregolare di media, in particolare dai pozzi periferici, è un problema frequente nella parlamentari con piccoli volumi di coltura. Sostanzialmente migliorate condizioni di coltura, come le incubatrici con / sistemi ben controllati temperatura di umidificazione e parlamentari evaporazione di riduzione e coperchi piastra, riducono la perdita significativa di media attraverso pozzi 8. Per misurare la relativa evaporazione, sono stati aggiunti volumi ugual...

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Discussione

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Rivestimento 384 pozzetti TC con filtrata Agarosio

La pratica standard in LOT è utilizzare un punto agarosio bassofondente 1-1,5% per rivestire le piastre, che richiede l'agarosio e / o unità di dosaggio da tenere riscaldata per impedire la gelificazione del agarosio 6. La gelificazione agarosio è potenzialmente preoccupanti durante la preparazione di piastre multiple utilizzando cassette dosaggio liquidi con piccole aperture tubi compresi tra 0,2 e 0,4 mm di diametro. P...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal ministero ceco dell'Istruzione, della gioventù e dello sport (LO1304) e l'Agenzia Tecnologica della Repubblica Ceca (TE01020028). Gli autori desiderano ringraziare il Dott Lakshman Varanasi per scattare le immagini fisse di coperchi ambientali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AgarosioSigma-AldrichA9414McCOY a basso punto
di fusione 5A MedioSigma-AldrichM8403
" rapido" Filtro FiltermaxTPP995050,22 μ m, 500 mL
Multidrop™ Dispenser di reagenti combinati Thermo Fisher Scientific5840300
Cassetta di erogazione per tubi piccoli Thermo Fisher Scientific24073295Punta in metallo 
Piastra TC a 384 pozzetti PerkinElmer6057308Tipo di piastra - CellCarrier
Cassetta di erogazione del tubo standardThermo Fisher Scientific24072670
MicroClime Coperchio ambientaleLabcyteLLS-0310
DMSOIncubatore rotante SigmaD4540
(SteriStore )HighRes Biosolutions23641Numero di serie: D00384
Dispenser per lavatrice per micropiastre BioTekModello non specificato: EL406 
Sistema di imaging ad alto contenuto (CellVoyager)Yokogawa Electric CorporationModello non specificato: CV7000
Orange GNew England BiolabsB7022S
TrypLE™ Reagente espresso di dissociazione cellulare ricombinanteThermo Fisher Scientific12604021Senza fenolo

Riferimenti

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