Articolo metodologico

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

DOI:

10.3791/55464

⸱

17 aprile 2017

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1Department of Chemistry, York University, 2The Centre for Research in Mass Spectrometry, York University, 3The Centre for Research on Biomolecular Interactions, York University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

flessibilità conformazionale gioca un ruolo critico nella funzione delle proteine. Qui, si descrive l'utilizzo di spettrometria di massa elettrospray ionizzazione tempo risolto accoppiato a scambio idrogeno-deuterio per sondare i rapidi cambiamenti strutturali che guidano funzione di proteine ​​ordinate e disordinate.

Abstract

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proteine ​​intrinsecamente disordinate (IDP) sono stati a lungo una sfida per biologi strutturali a causa della loro mancanza di elementi di struttura secondaria stabili. Idrogeno-Deuterio Exchange (HDX) misurata su scale temporali rapidi è particolarmente adatto per rilevare strutture e reti legame idrogeno che vengono brevemente popolate, permettendo la caratterizzazione dei conformeri transitori in gruppi nativi. Accoppiamento di HDX per spettrometria di massa offre diversi vantaggi, tra cui l'alta sensibilità, basso consumo di campione e sono limiti alla dimensione proteina. Questa tecnica ha avanzato notevolmente negli ultimi decenni, tra cui la possibilità di monitorare i tempi di etichettatura HDX sulla scala temporale millisecondo. Inoltre, incorporando il workflow HDX su una piattaforma microfluidica alloggiante un microreattore proteasi acida, siamo in grado di localizzare le proprietà dinamiche a livello peptide. In questo studio, tempo risolto elettrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (Trési-MS) accoppiato a HDX was utilizzato per fornire un quadro dettagliato della struttura residua nella proteina tau, così come i cambiamenti conformazionali indotte su iperfosforilazione.

Introduzione

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Negli ultimi decenni, i progressi sono stati fatti significativi nello sviluppo di tecniche analitiche progettato per misurare la struttura della proteina e dinamiche 1, 2, 3, 4. Mentre cristallografia a raggi X rimane lo strumento principale per determinare la struttura proteica, sono necessarie alte concentrazioni di proteine ​​ed è necessaria una vasta ottimizzazione per produrre cristalli di qualità diffrazione. Proteine che sono difficili da cristallizzare, come le proteine associate alla membrana e intrinsecamente disordinati sono classicamente studiate mediante scambio idrogeno-deuterio (HDX) NMR 5. Tuttavia, negli ultimi decenni, l'accoppiamento di ionizzazione elettrospray spettrometria di massa (ESI-MS) per HDX si è rapidamente guadagnato popolarità 6, 7.

La spettrometria di massa offre una soluzionea molte delle restrizioni poste dalla cristallografia a raggi X e NMR. In particolare, MS è altamente sensibile (nM a concentrazioni uM richiesto), e non v'è praticamente alcun limite alle dimensioni della proteina. Inoltre, l'elevato duty cycle di analisi MS prevede la possibilità di studiare proteine ​​quanto sottoposti fatturato enzimatica, misfolding, complessazione e altri processi biologicamente rilevanti. Questi processi avvengono molto sul millisecondo in scala seconda volta e richiedono una rapida miscelazione dei reagenti prima dell'analisi.

Lo sviluppo di time-resolved ionizzazione elettrospray (Trési) da Wilson e Konermann nel 2003 reazioni permesso di essere monitorato in tempo reale da pseudo-ESI-MS. Loro configurazione incorporato un mixer capillare con un volume di camera di reazione regolazione continua 8. Il dispositivo è costituito da due capillari concentrici, con il capillare interna, chiusa e una tacca tagliata in un lato per consentire la miscelazione all'interno della stretta inter-capillarey spazio dalla tacca all'estremità del capillare interna (tipicamente 2 mm). Quando viene applicato agli esperimenti HDX, il capillare interna porta la proteina di interesse, il capillare esterno porta l'etichettatura D 2 O soluzione, che poi subisce miscelazione con la proteina prima di entrare nella camera di reazione regolabile consentendo etichettatura HDX prima trasferimento diretto in ESI fonte.

Brevemente, HDX deduce backbone idrogeni ammidici sottoposti a scambio con atomi di deuterio in soluzione 9, 10. Lo scambio è base-catalizzata a pH fisiologico, con acido-catalisi diventare prevalente a pH inferiore a circa 2,6. Il tasso di cambio si basa su quattro fattori principali: pH, temperatura, accessibilità solvente e legame idrogeno intramolecolare. Mentre i primi due fattori sono mantenute costanti durante tutto l'esperimento, il tasso di cambio, in particolare a posizioni ammidici peptide backbone, è soprattutto dependent sulla struttura proteica 11. Strettamente piegato regioni con ampie reti legame idrogeno stabili in alfa-eliche e beta-sheets porterà fino deuterio a tassi sostanzialmente più lenti rispetto agli anelli e regioni disordinati (e talvolta per nulla) 12. Questo permette l'analisi di proteine globale, dove perturbazioni nella struttura (per es., Su aggregazione o legame al substrato) portano a differenti deuterio assorbimento (Figura 1).

Il mixer capillare cinetica può essere incorporato in una piattaforma microfluidica contenente una camera proteolitica per la localizzazione del captazione deuterio. Tale camera proteolitica viene mantenuta a pH basso per spegnere efficacemente la reazione di scambio, e richiede una proteasi acida immobilizzato per digerire le proteine in peptidi localizzate (Figura 2). Come monitorare i backbone al millisecondo a scale di seconda volta è particolarmente importante per laCaratterizzazione delle variazioni conformazionali all'interno difficile caratterizzare regioni loop, globulo fuso e proteine intrinsecamente disordinati (IDP) 13, 14. In alternativa, Trési-HDX può anche essere utilizzato per caratterizzare proteine che attualmente non hanno una struttura atomica risolti attraverso i metodi della cristallografia a raggi X e NMR, utilizzando lo scambio di deuterio accoppiato all'algoritmo COREX (DX-COREX) approccio 15, 16. Questo protocollo dettagliate si applica Trési-HDX per studiare tau, un IDP, sia nella sua forma nativa, così come è stato patogeno hyperphosphorylated. Mentre tau nativo è uno degli sfollati più ben studiati, poco si sa circa la sua controparte amyloidogenic 13.

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Protocollo

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NOTA: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza pertinenti (MSDS) prima dell'uso. Fumi prodotti da ablazione laser di poli (metilmetacrilato) (PMMA) possono essere tossici. Assicurarsi che l'incisore laser è collegato ad un sistema di ventilazione di lavoro. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguate durante la costruzione del dispositivo microfluidico compreso l'uso di controlli tecnici (cappa, apposito contenitore) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, maschera, guanti, camici, pantaloni lunghe, scarpe chiuse). E 'estremamente importante utilizzare liquida ad alta prestazione (HPLC) reagenti puri quando possibile, con tutti gli esseri ACS grado o superiore a diminuire contaminanti interferenti durante l'analisi.

1. Preparazione del dispositivo a microfluidi

  1. La costruzione del Microfluidic piattaforma PMMA
    1. Ottenere un blocco PMMA standard (8.9 x 3.8 x 0.6 cm) e laser ablazione un canale di ingresso per l'introduzione dei reagenti, un proteolisi camera, e un canale di uscita utilizzando un incisore laser 17, 18.
      NOTA: Etch camera proteolisi in una forma ovale allungata (30 x 5 x 0,05 mm). Il canale di ingresso ed uscita deve estendersi fino alla fine del blocco PMMA ed essere non più grande di 75 micron di larghezza e profondità per ospitare un capillare 30 ga.
    2. Tagliare a 30 ga inossidabile metallo capillare in due pezzi di circa 10 cm ciascuna con un utensile rotante con un disco di taglio spessa 1/64" . Usa carta vetrata per lisciare le estremità dei capillari (questo può essere facilitato da una visualizzazione sotto microscopio ottico).
    3. Sciogliere i capillari nella poli acidato (metil metacrilato) blocco utilizzando un saldatore. Il canale di ingresso sarà collegato a pompe a siringa automatizzate, e il canale di uscita sarà utilizzato per accoppiare nella MS.
  2. La costruzione del Mixer Kinetic a flusso continuo tempo risolto
    1. Ottenere un fusocapillare di silice vetro (ID: 75 um, OD: 150 pm) di circa 40 cm e inserirla in un 28 ga inossidabile metallo capillare di circa 15 cm. A seconda del tempo di reazione richiesto, usare un capillare metallico più esterno o uno con un ID più grande.
      NOTA: Determinazione del 'vero' diametro interno del capillare metallo è essenziale per ottenere tempi di reazione accurati. Questo può essere fatto fissando il capillare metallico ad un HPLC, scorre solvente però il capillare, e registrando la contropressione. Una contropressione di calcolo diametro interno può essere fatto, e il vero diametro interno del capillare metallico determinato. Questo può essere calcolato utilizzando il software Molecular Weight Calculator (per Windows versione 6.49).
    2. Produrre una tacca 2 mm mediante regolazioni dell'incisore laser a bassa potenza su un'estremità del capillare vetro interno e sigillare la fine del capillare vetro interno (figura 2). In alternativa, rendere la tacca usando un capillare di vetro ceramicafresa y o una smerigliatrice rotante con una lama di taglio fine.
    3. Formazione la capillare di vetro interno con l'estremità del capillare metallico (questo può essere facilitato mediante osservazione al microscopio ottico).
    4. Collegare questo mixer cinetica ad un'estremità del tee miscelazione (Figura 2).
    5. Collegare un capillare fusa di vetro di silice (ID: 75 um, OD: 150 pm) di circa 40 cm dalla estremità opposta del miscelatore cinetica sul tee miscelazione. Questo è utilizzato per fornire l'acido (acido acetico al 5%, pH 2,4) per spegnere la reazione.
      NOTA: reagenti vengono forniti al dispositivo con siringhe a tenuta di gas attraverso politetrafluoroetilene (PTFE) tubo utilizzando pompe di infusione automatizzati.
  3. Attivazione pepsina
    1. Pesare 20 mg di pepsina dalla mucosa gastrica suina o sospenderlo in 1 ml di tampone di accoppiamento (fosfato di sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 6,0).
    2. Pesare 50 mg di N -hydroxysuccinimide (NHS) attivati agarosio, aggiungere alla re-sproteasi uspended e ruotare delicatamente notte a 4 ° C.
    3. Spin down a 1.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente per raccogliere la resina.
    4. Aspirare la proteasi non legato.
    5. Incubare l'agarosio in 1 ml di tampone di bloccaggio (1 M Tris-HCl, pH 6,0) e ruotare delicatamente a temperatura ambiente per 1 h.
    6. Spin down a 1.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente per raccogliere la resina.
    7. Aspirare il tampone di bloccaggio.
    8. Incubare la pepsina-agarosio con acido acetico 1 ml di 5%, pH 2,4 per 5 min.
    9. Spin down a 1.000 xg per 2 minuti per raccogliere la resina.
    10. Aspirare il surnatante.
    11. Ripetere i punti 1.3.8 - 1.3.10 per un totale di tre lavaggi.
    12. Conservare le perline in 1 ml di acido acetico a 4 ° C per un uso a lungo termine.
  4. Assemblea dispositivo
    1. Riempire la camera proteolisi con la sospensione di perline attivate pepsina-agarosio in acido acetico al 5% utilizzando una spatola sterile.
    2. Posizionare il platfor microfluidica PMMAm tra due blocchi di PMMA bianco come copertura per sigillare il dispositivo, rivestito in gomma di silicone per creare una tenuta ermetica liquido.
    3. Utilizzare piastre metalliche di fissaggio a pressione a tenuta del dispositivo.
      NOTA: La pinza è stata personalizzata per adattarsi alla piattaforma microfluidica ed è composto da due piastre di misura 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm.
    4. Flusso di acido acetico 5%, pH 2,4 ad una velocità di 10 ml / min. Flusso 50 mM tampone di acetato di ammonio (pH 6.9) se la linea proteina ad una velocità di 1 ml / min.
      NOTA: E 'estremamente importante che l'acido acetico viene continuamente fluisce attraverso il dispositivo durante l'intera dell'esperimento. Garantire che non vi siano perdite e che il fluido sta uscendo solo dal canale di uscita, che servirà come sorgente ESI.
    5. Accoppiare il dispositivo alla estremità anteriore di una quadrupolo tempo di volo (Q-TOF) spettrometro di massa modificata utilizzando una fase isolata regolabile per ottenere condizioni ottimali elettrospray.
      NOTA: un interruttore di bypassviene introdotto in modo da simulare la presenza di una sorgente ESI commerciale. 17

2. ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Scambio risolta nel tempo

  1. Acquisizione di pepsina e proteine ​​Solo Spectra
    NOTA: acquisizione ESI-MS viene effettuata in modalità ioni positivi con una tensione di 4500-5000, 60-V potenziale declustering e 250 V potenziale focalizzazione. Gli spettri vengono acquisiti su una gamma di 350-1,500 m / z con una velocità di scansione di 1 s -1.
    1. Acquisire un solo spettro di pepsina. Eventuali picchi che compaiono in questo spettro sono sottratti una volta si aggiunge la proteina.
    2. Introdurre 50-100 pM tau / proteine fosfo-tau (purificare e preparare come descritto in precedenza 13, 19) ad una velocità di 1 ml / min in cui il tampone di acetato di ammonio 50 mM è stato precedentemente scorre.
    3. Acquisire una proteina solo spettro.
  2. acquisizione oPunti F Tempo
    1. Mentre la proteina / fosfo-tau 100 pM tau fluisce a 1 ml / min, introdurre D 2 O ad una velocità di 3 ml / min attraverso un connettore a T e lasciare reagire nel mixer cinetica. Consenti per il sistema di equilibrare per almeno 10 minuti prima dell'acquisizione dello spettro.
      NOTA: Dopo lo scambio, la reazione di marcatura viene raffreddata dal flusso di acido acetico pH acido 2,4 a 10 ml / min e la digestione della proteina marcata si verifica nella camera proteolitica.
    2. Al fine di aumentare il tempo di etichettatura, manualmente tirare all'indietro la posizione del capillare di vetro interna per ottenere tempi di miscelazione di 42 ms a 8 s. Consenti per il sistema di equilibrare per almeno 10 minuti tra ogni pull-back.

3. I dati e l'analisi statistica

  1. Identificare Peptidi e calcolando la percentuale di Deuterio Scambio
    1. Eseguire MS analisi utilizzando il software mMass, versione 5.5.0 20 .
    2. Identificare i peptidi che utilizzano il server di proteomica ExPASy FindPept e confermare collisione indotta dissociazione (CID) quando richiesto 21.
      NOTA: Qui, il deuterio assorbimento incorporazione è stata misurata utilizzando un software di FORTRAN in-house sviluppato per l'analisi isotopica di distribuzione 22, 23.
    3. Calcolare la tariffa intrinseche teorici basati sulla sequenza primaria utilizzando lo strumento web SFERA 22, 24.
    4. Montare i dati utilizzando un'unica regressione non lineare esponenziale e normalizzare utilizzando una grafica e software statistico (ad esempio, SigmaPlot).
      NOTA: Il rapporto k int / k obs produce l'Protection Factor (PF), una misura semi-quantitativa del grado che una regione particolare è strutturata all'interno dell'insieme conformazionale.

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Risultati

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profili di digestione-tau fosfo nativa e erano simili, ottenendo rispettivamente una copertura sequenza di 77,1 e 71,7%. valori deuterio assorbimento di ciascun peptide è stata determinata inserendo le distribuzioni isotopiche osservati con le distribuzioni teoriche generate utilizzando un software FORTRAN sviluppato in casa. Le migliori distribuzioni di montaggio sono mostrati (Figura 3a) insieme ai valori di assorbimento di deuterio associati. profili cinetici di capta...

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Discussione

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Mentre i metodi di biologia strutturali come la cristallografia a raggi X e NMR sono vantaggiosi perché forniscono strutture estremamente dettagliate di proteine, queste immagini sono spesso statica. La caratterizzazione di specie transienti e domini debolmente strutturati continua ad essere sfuggente quando è stato studiato da questi metodi convenzionali. Pertanto, al fine di acquisire conoscenze dinamici su questi tipi di sistemi è importante lavorare su scale temporali rapidi. Abbiamo applicato con successo Trési-HDX...

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Dichiarazioni

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo il Dr. Markus Zweckstetter per aver fornito il file di coordinate pdb per l'ensemble tau 'nativo' previsto dal suo lavoro NMR, con strumenti di analisi forniti dal Dr. Adnan Sljoka. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal programma di sovvenzioni ENGAGE del Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Plastica professionalein poli(metilmetacrilato) o PMMASACR.250CCP8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm
Capillare in vetro di silice fusaPolymicro Technologies106815-0018ID: 75 &; m, OD: 150 µ m
Capillari metalliciMcMaster-Carr28 ga - 89875K97
30 ga  - 89875K99
Tubo fluorurato etilene propilene (FEP) IDEX1477
1548		ID: 0.007", OD: 1/16"
ID: 0,020", diametro esterno: 1/16"
Tagliatubi in polimero standardIDEXA-327per 1/16" e 1/8" Tubo OD
Static Mixing TeeIDEXM-540per 1/16" Tubo OD
o
T in acciaio inossidabile, 0,25  mm BoreValco Instruments Co., Inc. (VICI)ZT1Cper 1/16" Tubo OD
PEEK Tee per 1/16" Tubo ODIDEXP-727
10-32 Femmina a femmina LuerIDEXP-659
10-32 PEEK Dado a doppia alaIDEXF-300
Ghiera per 1/16" Tubi ODIDEXF-142
Serie 100 Utensile rotanteDremelF013010001
Dischi da taglioJobmate1/64" di spessore
Stereomaster Zoom digitale MicroscopioFisher Scientific12-563-411
SaldatoreMastercraft58-6301-2
Laser universaleVersaLaser
SiringheHamilton81220500  µ Capacità L
Pompe SiringaHarvard Apparato70-4501
NomeCompanyNumero di catalogoComments
Reagents
NHS-Activated AgaroseFisher Scientific26196
Pepsina da mucosa gastrica suinaSigma-AldrichP6887-250MG
Ossido di deuterioSigma-Aldrich151882-10X0.6ML
Acido aceticoSigma-Aldrich695092-100ML
Acqua di grado HPLCFisher ScientificW5-4
Acetato di ammonioSigma-AldrichA7330-500G
Fosfato di sodioFisher ScientificS369-500
Cloruro di sodioFisher ScientificS671-3
NameCompanyCatalog NumberComments
Software/Online Tools
CorelDraw X3Corel
CalcolatoreVersione 6.49Strumento MS open source
mMassVersione 5.5.0Strumento MS open source
ExPASy FindPeptIstituto svizzero di bioinformatica
SigmaPlotSystat Softwareversione 11.0
PyMOLSchrö dingerVersione 1.5.0.4
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass SpectrometerAB SCIEX
Micro del peso molecolare

Riferimenti

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