Articolo metodologico

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

DOI:

10.3791/55498

⸱

1 aprile 2017

 ,  ,  , 
1Proteomic Mass Spectrometry, Wellcome Trust Sanger Institute

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Abstract

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La maggior parte delle proteine agisce in associazione con altre; quindi, è fondamentale caratterizzare queste unità funzionali per comprendere appieno i processi biologici. La purificazione per affinità accoppiata alla spettrometria di massa (AP-MS) è diventata il metodo di scelta per identificare le interazioni proteina-proteina. Tuttavia, gli studi convenzionali AP-MS forniscono informazioni sulle interazioni proteiche, ma le informazioni organizzative vengono perse. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato una strategia per svelare i distinti assemblaggi funzionali in cui una proteina potrebbe essere coinvolta, risolvendo complessi proteici purificati per affinità prima della loro caratterizzazione mediante spettrometria di massa. I complessi proteici isolati attraverso la purificazione per affinità di una proteina esca utilizzando un tag epitopo e un'eluizione competitiva vengono separati attraverso l'elettroforesi nativa blu. Il confronto dei profili di migrazione delle proteine attraverso il profilo di correlazione utilizzando la spettrometria di massa quantitativa consente l'assegnazione di proteine interagenti a entità molecolari distinte. Questo metodo è in grado di risolvere complessi proteici di peso molecolare ravvicinato che potrebbero non essere risolti con le tecniche cromatografiche tradizionali come la filtrazione su gel. Con poco più lavoro rispetto alle convenzionali AP-geLC-MS/MS, dimostriamo che questa strategia può in molti casi essere adeguata per ottenere informazioni topologiche complesse proteiche in concomitanza con l'identificazione delle interazioni proteiche.

Introduzione

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Nelle cellule, maggior parte delle proteine ​​svolgere le loro funzioni attraverso transitori interazioni proteina-proteina o formando complessi proteici stabili. Caratterizzare le interazioni delle proteine ​​è fondamentale per i processi cellulari completamente comprensione. purificazione di affinità in combinazione con la spettrometria di massa (AP-SM) è una delle strategie più comunemente applicati per identificare le interazioni proteina nativa. Miglioramenti significativi nella capacità dello strumento raggiunti negli ultimi dieci anni hanno reso questo approccio estremamente potente. E 'importante notare che le interazioni identificate da esperimenti di AP-MS comprendono una miscela di associazioni dirette e indirette tra esche e prede. Inoltre, spesso proteine ​​partecipano a numerosi complessi diversi all'interno dello stesso contesto cellulare, che potrebbero avere diversi ruoli biologici, e quindi le interattori identificati da AP-MS possono rappresentare una miscela di complessi proteici distinte o entità funzionali. Non è possibile derivaretali informazioni topologica a priori dalle liste mono-dimensionale di proteine generati da semplici esperimenti AP-MS. Tuttavia, la tecnica può essere sfruttata ulteriormente per definire l'architettura di complessi proteici combinandolo con uno o più metodi per risolvere questi gruppi.

Al fine di risolvere la topologia delle interazioni proteiche individuati attraverso AP-MS, sono stati applicati diverse strategie. Un approccio è quello di eseguire esperimenti iterativi AP-MS utilizzando le prede identificati in un precedente round di esperimenti come esche 1. Anche se molto informativo, questo è piuttosto un compito alta intensità di lavoro sia sperimentalmente e analiticamente. Proteina reticolazione in combinazione con la spettrometria di massa è sempre più utilizzata per ricavare informazioni topologiche su complessi proteici 2, 3, 4, 5. Tuttavia, computatioanalisi nale peptidi reticolati rimane ancora un compito impegnativo e quindi è il collo di bottiglia nel flusso di lavoro. L'avvento di MS-scindibili reagenti di reticolazione dovrebbe facilitare la mappatura dei residui di amminoacidi che si trovano in prossimità di proteine interagenti 6, 7. Un'altra alternativa è quella di combinare la purificazione per affinità con le precedenti tecniche di separazione ortogonali 8, 9. Frazionamento cromatografico mediante gel filtrazione o scambio ionico, o saccarosio frazionamento gradiente sono recentemente stato usato in combinazione con la spettrometria di massa quantitativa per descrivere complessi multiproteici a livello di tutto il sistema, by-passando la fase di complesso di isolamento 10, 11, 12, 13. Blu gel di poliacrilammide nativo elettroforesi (BN-PAGE) è stato ampiamente applicato aindagare le interazioni proteina nativa, in genere quelli che coinvolgono membrana mitocondriale complessi proteici 14. Questa tecnica di separazione è stato recentemente utilizzato in combinazione con quantificazione della proteina priva di etichetta e correlazione profilatura, non solo su complessi mitocondriali 15, 16, 17, ma anche per dipanare altri complessi proteici da cellule intere 18, 19. Abbiamo ipotizzato che la combinazione di purificazione di affinità con i successivi approcci frazionamento nativi e MS quantitativa dovrebbe fornire una strategia utile per risolvere più assembly proteina contenente una particolare proteina.

Qui si descrive un metodo che combina nucleo purificazione per affinità epitopo-based con blu nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide dei complessi isolati, seguita da sp massa quantitativaectrometry e proteine ​​correlazione profilatura, per risolvere i più assembly una proteina potrebbe essere coinvolta. Impieghiamo cellule staminali embrionali di topo in cui una proteina di interesse fusa ad un epitopo è espresso dal locus endogeno per ottenere vicino all'abbondanza fisiologica e garantire nativo efficiente isolamento complesso. Questo approccio svela i molteplici interazioni proteina impegna in, risolverli in assiemi distinti sulla base dei loro profili di correlazione, mentre non richiede più lavoro rispetto ai tradizionali geLC-MS 20.

Protocollo

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1. Isolamento di complessi proteici nativi da FLAG Affinity Purification

  1. preparativi
    1. Impostare un bagno di acqua 37 ° C per scongelare il pellet.
    2. Raffreddare una microcentrifuga a 4 ° C.
    3. Posizionare diversi tubi microcentrifuga di diverse dimensioni (1,5 ml, 15 ml) ed un omogeneizzatore nel ghiaccio.
    4. Preparare 10 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) e mantenere in ghiaccio. Appena prima di utilizzare il tampone, aggiungere 10 ml di 1 M DTT e una tavoletta schiacciata di inibitori della proteasi privo di EDTA.
  2. Preparazione di perline anticorpo-linked
    NOTA: Le perle legate agli anticorpi possono essere preparati fino a una settimana in anticipo e conservati in frigorifero fino al momento. Proteina G ha un'affinità superiore proteina A per la maggior parte delle specie immunoglobuline sottotipi, tranne per le IgG di coniglio, per il quale la proteina A ha una maggiore affinità.
    1. Lavare 50 ml di sfere magnetiche proteina G-rivestiti: Trasferimento 50 &# 956; L del cordone di sospensione in una provetta, posizionare il tubo nel magnete per raccogliere le perline sul lato del tubo e rimuovere il liquido. Risospendere le sfere in 0,5 mL di PBS-0,01% Tween-20.
    2. Porre il tubo nel magnete per raccogliere le perline sul lato del tubo e rimuovere il liquido. Risospendere le sfere in 40 microlitri di PBS-0,01% Tween-20. Aggiungere 10 mg (10 ml di 1 mg / ml soluzione madre) di M2 anticorpo anti-FLAG. Incubare con rotazione per 20 minuti a temperatura ambiente.
    3. Porre il tubo nel magnete per raccogliere le perline sul lato del tubo e rimuovere il liquido. Lavare le perline con 0,5 mL di PBS-0,01% Tween-20.
    4. Per reticolazione l'anticorpo ai talloni, lavare le perle due volte con 1 ml di 0,2 M pH 8,2 trietanolammina. Poi, risospendere le sfere in 1 ml di 20 mM DMP (dimetil pimelimidate) in 0,2 M trietanolammina pH 8,2 (soluzione DMP deve essere preparato fresco immediatamente prima dell'uso). Incubare con rotazione a temperatura ambiente per 30 min.
      5. Posizionare il tubo nel magnete. Rimuovere il surnatante e risospendere le sfere in 0,5 ml di 50 mM Tris-HCl pH 7,5. Incubare con rotazione a temperatura ambiente per 15 min.
  3. Lavare le perline 3 volte con 0,5 mL di PBS-0.1% Tween-20. Lasciare perline in ultimo lavaggio fino a quando necessario.
  • purificazione per affinità FLAG-based
    NOTA: Fare attenzione a non lasciare le perline, senza buffer per un lungo periodo di tempo. Tutti i tamponi e tubi dovrebbero essere tenuti in ghiaccio in ogni momento. Il seguente protocollo è ottimizzato per la purificazione di complessi proteici di 2-5 x 10 8 cellule (10-20 mg proteina lisato) esprimono livelli endogeni di una proteina FLAG-tag 20.
    1. Scongelare il pellet di cellule in un bagno d'acqua a 37 ° C fino a quando non inizia a sciogliersi. Prendere il tubo dal bagno, roteare delicatamente fino il pellet è completamente scongelato, e collocare immediatamente il tubo contenente la sospensione cellulare su ghiaccio.
    2. Aggiungere 5 ml di tampone di lisi ghiacciato(Contenente DTT e inibitori di proteasi) alla sospensione cellulare e agitare per mescolare. Incubare in ghiaccio per 10 min.
    3. Trasferire il lisato ad un omogeneizzatore Dounce freddo. Lisare con 20-30 colpi utilizzando il pestello stretto (fino a quando nessun viscosità evidente). Trasferire l'omogeneizzato ai tubi microcentrifuga freddi.
    4. Centrifugare a 18.000 xg per 15 min a 4 ° C.
    5. Trasferire il lisato eliminato in una provetta pulita fredda. Lasciare 50 ml di lisato dietro. Prendete un'aliquota 35 microlitri di lisato per misurare la concentrazione di proteine ​​e monitorare la purificazione.
    6. Rimuovere il PBS-0.1% Tween-20 dalle perline. Risospendere le sfere con 1 ml di lisato e mescolare con il resto del lisato. Incubare la miscela in una ruota girevole a 4 ° C per 1-2 h.
    7. Raccogliere le perline sul lato del tubo con il magnete. Raccogliere un'aliquota di 30 ml di surnatante e scartare il resto del surnatante. Risospendere le sfere in 0,5 mL di tampone IPP150 (10 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% NP-40) pipettando 4-6 volte. Trasferire in una provetta da 1,5 ml a freddo.
    8. Ripetere i lavaggi con 0,5 mL di tampone IPP150 altre due volte.
    9. Lavaggio Perle tre volte con 0,5 mL di tampone di eluizione FLAG nativo (20 mM Bis-Tris pH 7, 20 mM NaCl, 0,02% Nonidet P-40, 1 mM EDTA, 200 mM acido ε-amminocapronico). Con l'ultimo lavaggio, trasferire le perle in una nuova provetta freddo. Rimuovere completamente tampone.
    10. Risospendere le sfere in 100 ml di 200 mg / ml 3x FLAG peptide in tampone di eluizione nativo. Incubare a 4 ° C per 10 min con rotazione dolce.
    11. Raccogliere le perline con il magnete e trasferire il surnatante in una nuova provetta freddo.
    12. Ripetere i passaggi 1.3.10-1.3.11 due volte. Piscina tutto gli eluati.
    13. Concentrare l'eluato fino a 25 microlitri in un'unità filtro centrifugo (10 kDa nominale limite di peso molecolare cut-off, PES) tramite centrifugazione a 10.000 xg a 4 ° C. Trasferire l'eluato concentrato in una nuova provetta fredda e aggiungere il 50% glycerol per una concentrazione finale del 5%. L'eluato concentrato può essere conservato a 4 ° C per una notte, se necessario.

    • 2. Blu Native PAGE

    1. preparativi
      1. Preparare 1 l di 1x PAGE nativo anodo Buffer, 1x PAGE nativo blu scuro catodo Buffer e 1x PAGE nativo Light Blue catodo Buffer.
      2. Rimuovere il pettine di un gel PAGE nativo prefabbricati 3-12% e lavare i pozzetti due volte con 1x PAGE nativo blu scuro catodo Buffer. Riempire i pozzetti con 1x PAGE nativo blu scuro catodo Buffer. Impostare il gel nel serbatoio in esecuzione ma non aggiungere Dark Blue catodo Buffer al catodo (interno) della camera.
    2. corsa elettroforetica
      1. Preparare il campione: Per i 25 microlitri concentrati eluato aggiungere volume appropriato di 4x tampone campione carico nativo e del 0,5% G-250 additivo campione per concentrazioni finali di 1x e 0,005% rispettivamente.
      2. Caricare il campione e marcatori di peso molecolare native lasciando un pozzo vuoto betweeli, n. Carico 10-20 ml di 1x campione nativo tampone di caricamento in tutti i pozzetti vuoti.
      3. Riempire la (interno) camera di catodo con 200 ml di 1x PAGE nativo blu scuro Cathode Buffer con attenzione in modo da non disturbare i campioni. Riempire la camera di anodo (esterno) con 550 ml di 1x PAGE nativo anodo Buffer.
      4. Eseguire il gel a 150 V per 30 minuti. Fermare la corsa, rimuovere il blu scuro catodo Buffer con una pipetta sierologica e sostituirlo con 1x Light Blue catodo Buffer. Continuare la corsa per 60 min. Il gel può essere effettuata a temperatura ambiente oa 4 ° C; la temperatura potrebbe avere un effetto sulla proteina struttura complessa.
    3. Gel colorazione
      1. Aprire la cassetta gel e scartare una delle piastre cassette. Il gel rimane attaccato all'altra piastra cassetta. Trasferire il gel in un vassoio o recipiente contenente la soluzione sufficiente fissativo (40% metanolo, 2% di acido acetico) per coprire il gel e incubare per 30 min agitando delicatamente.
      2. Rimuovere la solut fissativoioni e aggiungere acqua sufficiente a coprire il gel. Il gel può essere sottoposto a scansione per riferimento futuro.

    Analisi 3. Spettrometria di Massa

    Nota: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguite in una cappa a flusso laminare, se possibile, per garantire la pulizia dei campioni. Tutte le soluzioni devono essere preparate con acqua HPLC-grade. Discuti questo protocollo con il laboratorio di spettrometria di massa che effettuerà le analisi.

    1. preparativi
      1. Posizionare una piastra a 96 pozzetti a fondo conico su un'altra piastra a 96 pozzetti per la raccolta dei rifiuti. Pierce fondo dei pozzetti della parte inferiore 96 pozzetti conica con un ago 21 G.
      2. Lavare i pozzetti della piastra forata 96 pozzetti.
        1. Aggiungere 200 microlitri di 50% acido formico acetonitrile-0,25% ai pozzetti della piastra forata. Incubare la pila di piastre in un agitatore per 10 min.
        2. Centrifugare a 500 xg per 1 min in modo che il liquido fluisce attraverso i fori nella piastra di raccolta rifiuti. Eliminare il waste liquido.
        3. Ripetere i passaggi 3.1.2.1-3.1.2.2 altre due volte.
        4. Riempire i pozzetti della piastra forata 96 pozzetti con 150 ml di 50 mM di bicarbonato di ammonio (fresco).
      3. Lavare i pozzetti di una filtrazione centrifuga piastra a 96 pozzetti.
        1. Posizionare una normale piastra a 96 pozzetti sotto la piastra di filtrazione centrifuga per raccogliere i rifiuti. Aggiungere 200 microlitri di 50% acido formico acetonitrile-0,25% a ciascun pozzetto della piastra di filtrazione centrifuga.
        2. Centrifugare la pila di piastre a 200 xg per 1 min. Smaltire i rifiuti.
        3. Ripetere i passaggi 3.1.3.1-3.1.3.2 altre due volte.
    2. Gel escissione in gel digestione
      NOTA: Mentre ablazione del gel, identificare e prendere nota della fetta gel allineato a ciascuna delle norme proteine. Gli standard di proteine ​​possono essere usate per stimare pesi molecolari approssimative per tutte le sezioni di gel.
      1. Porre il gel con la lastra di vetro su una superficie pulita. Tagliate la corsia contieneing campione in 48 fette identiche (1,5 mm x 5 mm). Tagliare ogni fetta in 2-3 pezzi più piccoli (ad eccezione degli ultimi cinque fette nella parte superiore del gel) e porre ogni fetta in sequenza in un pozzetto della forato e lavato piastra a 96 pozzetti.
      2. Aggiungere 50 ml di acetonitrile a ciascun pozzetto. Incubare la piastra con agitazione per 30-60 min. Rimuovere il liquido mediante centrifugazione come al punto 3.1.2.2.
      3. Aggiungere 200 ml di 2 mM TCEP in 50 mM di bicarbonato di ammonio a ciascun pozzetto. Incubare la piastra con agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il liquido mediante centrifugazione come al punto 3.1.2.2.
      4. Aggiungere 200 ml di 4 mM iodoacetammide in 50 mM di bicarbonato di ammonio a ciascun pozzetto. Incubare la piastra con agitazione per 30 minuti a 37 ° C al buio. Rimuovere il liquido mediante centrifugazione come al punto 3.1.2.2.
      5. Aggiungere 150 ml di 50 mM di bicarbonato di ammonio più 50 ml di acetonitrile e incubare la piastra con agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente. Ripetere questo lavaggio passaggio di uns numero di volte necessario fino a quando tutto il colore blu è rimossa dai pezzi di gel.
      6. Disidratare i pezzi di gel aggiungendo 200 ml di acetonitrile puro e incubare con agitazione a temperatura ambiente per 20 min finché i pezzi di gel sono bianche ed opache. Rimuovere acetonitrile.
      7. Aggiungere 150 ml di 0,001 mg / ml di tripsina (sequenziamento grado) in freddo 50 mM di bicarbonato di ammonio a ciascun pozzetto. Incubare la piastra con agitazione a 37 ° C per 2 h. Dopo 1 h, controllare che i pezzi di gel sono coperti di liquido; se questo non è il caso, aggiungere un'altra 50-100 ml di 50 mM di bicarbonato di ammonio. Dopo 2 ore a 37 ° C, proseguire la digestione a 25 ° C per una notte.
      8. Posizionare una piastra di fondo conico pulito sotto la piastra di gel contenente, garantendo il corretto orientamento delle piastre. Raccogliere il liquido contenente i peptidi mediante centrifugazione a 200 xg per 1 min.
      9. Posizionare la piastra peptidi contenenti in un evaporatore centrifugo ed evaporare il liquido durante lo svolgimento tegli passo successivo.
      10. Aggiungere 150 microlitri di 50% acido formico acetonitrile-0,25% per i pezzi di gel. Incubare con agitazione a 37 ° C per 30 min.
      11. Raccogliere il liquido nella piastra parzialmente essiccato dal punto 3.2.9 mediante centrifugazione a 200 xg per 1 min. Continuare evaporazione del piatto peptidi contenenti nell'eseguire il passaggio successivo.
      12. Ripetere i passaggi 3.2.10-3.2.11.
      13. Aggiungere 200 ml di acetonitrile puro a ciascun pozzetto della piastra contenente i pezzi di gel. Incubare con agitazione a temperatura ambiente per 15 min.
      14. Raccogliere il liquido nella piastra contenente peptidi mediante centrifugazione a 200 xg per 1 min.
      15. Assicurarsi che la concentrazione finale di acetonitrile in tutti i pozzetti è superiore al 55%. Se necessario, aggiungere acetonitrile purissimo.
      16. Trasferire le soluzioni peptide alla piastra di filtrazione centrifuga lavato. Posizionare un piatto fondo conico pulita sotto di esso per raccogliere i peptidi. Centrifugare la pila di piastre a 200 xg per 1 min.
      17. Evapormangiato il liquido nella piastra di fondo conico fino pozzetti siano completamente asciutte. La piastra può essere coperto con un coperchio silicone e conservato a -20 ° C in questa fase.
      18. Ridisciogliere peptidi in 32 ml di acido formico 0,5% con vigorosa agitazione per 15 min. Aggiungere 8 ml di 400 mM di bicarbonato di ammonio e incubare con vigorosa agitazione per 15 min. Centrifugare la piastra a 200 xg per 1 min. Coprire con un coperchio di silicone e conservare la piastra a -20 ° C fino all'analisi di spettrometria di massa.
    3. Spettrometria di massa
      NOTA: Analizzare i peptidi su uno spettrometro di massa ad alta risoluzione con metodi compatibili con la proteomica fucile da caccia. Acquisizione dati dipendente è la LC-tandem più comunemente usato MS predisposta per questo tipo di analisi e dovrebbe essere ottimizzato per l'identificazione efficiente peptide, minimizzando sequenziamento ridondante e selezione dei candidati su rumore di fondo. spettri di massa nell'analisi scansione prima massa stadio (MS1) va registrato in modalità profilo. Si raccomandaed per selezionare preferenzialmente ioni doppiamente e triplamente praticati per la seconda fase di analisi di massa (MS2). Una gamma di massa m / z 400-1,600 atto ad identificare la maggior parte dei peptidi tra 8-30 gamma aminoacidi. Qui, è previsto un protocollo per analisi utilizzando uno spettrometro di massa Orbitrap.
      1. Iniettare 20 ml di campione per l'analisi utilizzando l'auto-campionatore di un sistema di nanoLC-MS / MS. Desalificare e concentrare peptidi su una colonna in fase inversa C18 (100 um id, 2 cm).
      2. peptidi separati su una colonna analitica C18 (75 um id, 15 cm) usando un gradiente lineare 30 min di 4-28% acido formico acetonitrile / 0,1% a 300 Nl / min.
      3. Analizzare peptidi in uno spettrometro di massa con una parte superiore metodo di acquisizione dati dipendenti 10 con i seguenti parametri: m / z gamma 380-1,600, risoluzione 30.000 a m / z 400, larghezza di isolamento 2 Th, esclusione dinamica a ± 10 ppm per 45 s , desiderato di controllo automatico del guadagno a 1 x 10 6 per MS e 5.000 per MS / MS, tempo massimo di iniezione 150 ms per MS e100 ms per MS / MS.

    Analisi 4. I dati

    1. l'identificazione delle proteine ​​e la quantificazione usando MaxQuant
      1. Utilizzare il software MaxQuant liberamente disponibili per identificare e quantificare le proteine ​​in ogni frazione di gel dai dati grezzi spettrometria di massa.
        NOTA: MaxQuant lavora su dati generati dall'acquisizione shotgun proteomica approcci dipendenti dai dati. I dati MS delle frazioni blu gel nativi devono essere analizzati in batch esperimenti separati e non come frazioni di un esperimento che unisce tutte le fette di gel. Selezionare la casella valore iBAQ per eseguire calcoli stechiometria. Protocolli dettagliati per la ricerca di database e proteine quantificazione usando MaxQuant sono descritti in 21, 22.
    2. Analisi profilo proteico utilizzando Perseo
      1. Utilizzare il software liberamente disponibile Perseus per visualizzare i profili di migrazione delle proteine ​​identificate e confrontarli conanalisi statistica.
        NOTA: la documentazione generale su come utilizzare Perseo è disponibile presso http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Un set di dati campione è disponibile come dati supplementari.
      2. Carica il file proteingroups.txt restituito dal analisi MaxQuant contenente le identificazioni di proteine ​​e valori di quantificazione per tutte le frazioni di gel. Inserire i valori di intensità in area principale (Figura 1). Apparirà una matrice contenente tutte le identificazioni proteiche in fila, con le frazioni gel come colonne.
      3. Rimuovere voci corrispondenti ai risultati inversa, solo proteine identificate dal sito e potenziali contaminanti selezionando righe filtro basato su colonna categorica nel menu a discesa Filtro righe (Figura 2).
      4. Normalizzare le intensità frazione di ciascuna proteina di tutti i profilo contro l'intensità totale proteina selezionando Divide nel menu a discesa Normalizzazione, quindi Sum (Figura 3). Un nuovo mappare Atrix.
      5. Visualizzare i grafici di profilo migrazione di tutte le proteine selezionando trama profilo nel menu a discesa visualizzazione (Figura 4).
      6. Selezionare Filtro righe in base a valori validi nel menu a discesa Filtrare le righe. Immettere 1 nel numero di valori validi richiesti.
      7. Eseguire il clustering gerarchico delle proteine ​​identificate in tutte le frazioni blu gel nativi selezionando clustering gerarchico nel menu a discesa Clustering / PCA. Deselezionare la casella Colonne albero (Figura 5). I cluster sono visualizzate in una mappa termica nella scheda Clustering accanto alla matrice (Figura 6).
      8. Individuare il cluster contenente la proteina esca in dendrogramma. Altri componenti del cluster rappresentano proteine ​​co-migrazione con l'esca e sono quindi potenziali proteine ​​interagenti / subunità del complesso stesso.

    figure-protocol-1 r /> Figura 1. schermo di finestra di caricamento dati Perseo. La figura mostra i passaggi per il caricamento di identificazione delle proteine ​​e dei dati quantificazione in Perseus. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Figura 2. Schermata della finestra Perseus per il filtraggio di voci corrispondenti ai contaminanti, colpi e proteine identificate dal sito inversa. Selezionando Filtro righe per colonna categorica apre una nuova finestra di selezione dei tipi di voci proteine ​​da eliminare dal set di dati. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Figura 3. Cattura schermo di finestra normalizzazione Perseo. Selezione Divide nel menu Normalizzazione apre una nuova finestra, con diverse opzioni. Selezionando Somma divide il valore di intensità di una proteina in ogni frazione per l'intensità totale di proteine ​​che in tutte le frazioni. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Figura 4. Cattura schermo di Perseus mostra grafici di profilo migrazione. Le proteine ​​possono essere selezionate nella matrice sotto i profili per evidenziare la loro profilo corrispondente. La barra degli strumenti può essere utilizzato per modificare ed esportare i profili. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.


    Figura 5. Schermata della finestra clustering gerarchico Perseo. La figura mostra le impostazioni per il clustering gerarchico di proteine ​​usando Manhattan (L1) distanza metrica. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Figura 6. Figura di Perseo che mostra dendrogram e intensità proteine heatmap. Il flusso di lavoro sul lato destro del pannello principale mostra ogni passo intrapreso e la matrice risultante, e può essere usato per annullare qualsiasi passaggio. Il flusso di lavoro può anche diramano da qualsiasi matrice intermedia. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questo fIGURA.

    1. Calcolo di relativa stechiometria
      1. Selezionare le subunità di un complesso proteico in base alla loro co-raggruppamento con la proteina esca e delimitare il picco profilo (s) dove compaiono.
      2. Utilizzare i valori restituiti iBAQ mediante analisi MaxQuant per ciascuna subunità in ciascuna frazione separatamente e normalizzare dal corrispondente valore iBAQ esca in quella frazione.
      3. Tracciare i iBAQs normalizzati esca e proteine ​​subunità complesse attraverso le frazioni del picco selezionato e applicare regressione lineare. Calcolare quantità relativa di subunità complesso di esca confrontando le tendenze dei loro valori iBAQ normalizzati.
    2. Stima di proteine ​​dimensione complessa
      1. Utilizzare gli standard di proteine ​​per calcolare pesi molecolari previsti per le allineamento blu fette di gel nativi dalla corsia del campione. Da questi, generare un modello di regressione lineare tracciando fette di gel in asse x e pesi molecolari in asse y.
        2. Utilizzare il modello per stimare la gamma osservata peso molecolare del complesso proteico (es) basato sulla fetta nativo blu (s) da cui sono stati identificati.

    Risultati

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    Il flusso di lavoro della purificazione di affinità Blu nativa delle proteine Correlazione profilatura mediante spettrometria di massa (ABC-MS) strategia è rappresentata in figura 7. complessi proteici nativi intorno ad una proteina di interesse sono isolati da purificazione per affinità utilizzando anticorpi contro un tag epitopo (in questo caso FLAG) ed eluizione competitivo. I complessi si risolvono con BN-PAGE, e tutta la corsia di gel viene asportato in 48 sezioni, e preparati per il fucile da caccia LC-MS / MS. Quantitative informazioni MS viene utilizzato per generare un profilo di migrazione per ogni proteina identificata attraverso la separazione nativo blu. Proteine ​​che interagiscono per formare un distinti profili migratori simili visualizzazione complesso con picchi sovrapponibili. Quando una proteina di interesse partecipa a più di un assemblaggio, picchi multipli si osservano nel suo profilo migrazione, date le sotto-complessi sono nel potere di risoluzione del gel nativo blu. Un confronto sistematico del migprofili razione può essere ottenuto mediante correlazione proteina profilatura usando clustering gerarchico. Dendrogramma e l'intensità dei picchi per tutte le frazioni vengono visualizzati in una mappa termica, facilitando l'identificazione di proteine interagenti che appartengono a distinti complessi proteici (Figura 8).

    Abbiamo usato questa strategia per analizzare i partner che interagiscono di MTA2, una subunità nucleo della cromatina nurd rimodellamento complesso 20. Come mostrato in figura 9, il profilo di migrazione MTA2 visualizzata due picchi di intensità distinti tra 700 kDa e 1,2 MDa, con il picco di massa inferiore visualizzazione maggiore abbondanza. Altre subunità nucleo nurd, tra mta1 / 3, HDAC1 / 2 e Mbd3, mostravano modello separazione identici, sebbene i picchi per alcune delle subunità, cioè Chd4, Gatad2a / b e Rbbp4 / 7, avevano la distribuzione abbondanza inversa (Figura 9A, B). Al contrario, il profilo di Cdk2ap1, un fattore di regolazione che recluta il complesso nurd di promotori genici Wnt 23, visualizzato solo il picco di massa superiore (Figura 9C), e così pure SALL4, un repressore trascrizionale che ha anche dimostrato di impegnare nurd 20, 24, 25. Così, frazionamento di affinità purificate proteine ​​MTA2-associata di blu PAGE nativa è riuscito a risolvere due diverse forme del complesso nurd.

    ABC-MS permette anche l'identificazione di nuovi interattori mentre assegnandoli a particolari entità proteiche. Attraverso l'esame dei cluster proteine e intensità frazione rappresentata in una mappa termica abbiamo rilevato una forte correlazione tra subunità nurd e Wdr5, una subunità regolatrice del complesso metiltransferasi MLL 26, con Wdr5 visualizzazione due picchi migrazione coincidenti con i due nurd peaks (Figura 8), suggerendo una nuova interazione tra Wdr5 e nurd. Abbiamo confermato questa interazione mediante co-immunoprecipitazione e co-migrazione cromatografia di esclusione dimensionale 20.

    La scelta di calcolo della metrica distanza nel clustering gerarchico influenzerà la forma dei cluster e quindi le correlazioni. Si consiglia di sperimentare le diverse metriche per raggiungere la migliore forma con la conoscenza dell'interazione esistente della proteina o complessi di interesse. Generalmente abbiamo ottenuto risultati migliori con il Manhattan (L1) distanza metrica 20. Correlazione di Pearson o metriche distanza euclidea sono stati riportati anche per identificare complessi basati su tecniche di frazionamento alternative 10, 11, 12.

    la quandati titative MS ottenuti da frazioni native blu possono anche essere utilizzati per determinare la stechiometria dei complessi proteici. Il valore iBAQ (intensità basato assoluta quantificazione) fornisce una misura della relativa abbondanza di proteine identificate 27, 28. I valori iBAQ per la proteina membri complessi in tutte le frazioni all'interno di un profilo di migrazione picco vengono normalizzati a quella della proteina esca per ottenere quantità relative. I iBAQs normalizzati attraverso un profilo di picco di un membro complessa data proteina dovrebbero seguire un andamento orizzontale, e i valori delle curve riflettere la stechiometria delle proteine ​​interagenti relativi alla proteina esca. Per una rappresentazione più dettagliata di calcoli stechiometrici, vedi 20.

    figure-results-1
    Figura 7: Schema flusso che sintetizza l'ABC-MS sSTRATEGIA. Questa figura è modificata da 20. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figure-results-2
    Figura 8. raggruppamento gerarchico dei profili migratori BN-PAGE di interattori MTA2. proteine ​​MTA2-associati sono stati raggruppati in base alla somiglianza delle loro profili migratori. È mostrata solo un sottoinsieme della mappa termica contenente il complesso nurd (racchiuso nella scatola blu). La scatola gialla evidenzia la forte correlazione del Wdr5 con il complesso nurd. I pesi molecolari annotati sono stati stimati dalle distanze di migrazione degli standard proteine ​​eseguite sullo stesso gel. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in molecolare e cellulare Proteomica 20 l'American Society for Biochimica e Mo Biologia lecular. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

    figure-results-3
    Figura 9. BN-PAGE profilo migrazione delle subunità nurd e proteine associate. A) subunità MTA2 e nurd presenti in un modello simile intensità. B) MTA2 e nurd subunità con il modello intensità inversa. C) MTA2 e Cdk2ap1, che è presente solo nell'entità nurd peso molecolare superiore. I pesi molecolari annotati sono stati stimati dal profilo migrazione degli standard proteina. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Cellular Proteomics 20 l'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare Molecolare e._blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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    Dati supplementari: set di dati campione. MaxQuant-derivato del file contenente proteingroups.txt identificazioni di proteine ​​e valori di quantificazione da un esperimento ABC-MS. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Cellular Proteomics 20 l'American Society for Biochimica e Biologia Molecolare Molecolare e. Cliccate qui per scaricare questo file.

    Discussione

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    Qui, si descrive l'utilizzo di purificazione di affinità seguita da elettroforesi su gel nativo blu in combinazione con la spettrometria di massa quantitativa per risolvere complessi proteici. Questo approccio offre un metodo di svelare elenchi interazione proteina unidimensionali in assiemi proteina funzionale.

    Dimostriamo il metodo basato sull'utilizzo di proteine ​​epitopo-tag. Tuttavia, se una linea cellulare che esprime una proteina tag non è disponibile, in alternativa potrebbe essere quella di utilizzare gli anticorpi contro la proteina di interesse, purché vi sia un peptide a disposizione per raggiungere eluizione competitiva nativo. La quantità di materiale di partenza e la quantità di perline potrebbe essere necessario modificare a seconda del livello di espressione della proteina bersaglio. Noi di solito effettuare questo protocollo con 2-5 x 10 8 cellule materiale di partenza, e questo è sufficiente anche per le proteine a basso livello di espressione. La composizione del tampone di lisi dovrebbe essere scelto empiricamente per ottenerevicino alla completa solubilizzazione dell'esca. Questo potrebbe essere difficile per alcuni tipi di proteine, in particolare legame cromatina o proteine ​​di membrana. Opzioni alternative includono l'aumento della quantità di sale, purché il complesso proteina in esame è stabile in alto sale, o utilizzando sonicazione e / o il trattamento nucleasi per cromatina proteine leganti 20, 29. Nel caso delle proteine di membrana, il passaggio detersivo DDM o digitonina può essere consigliabile 30. Nel caso di legame al DNA proteine, è utile includere un nucleasi come benzonasi durante la fase di purificazione 20. La rimozione completa di acidi nucleici assicura che le interazioni rilevate si verificano tra le proteine ​​e non sono mediati da DNA.

    Un elemento fondamentale da considerare quando si utilizza questo approccio è la stabilità del complesso sotto inchiesta. La procedura è lunga e può comportare preserving proteina overnight complesso. Abbiamo raggiunto un buon successo con due complessi di rimodellamento della cromatina (D. Bode e M. Pardo, dati non mostrati), ma questo deve essere valutato. La fase di purificazione per affinità può essere abbreviato se necessario.

    tecniche alternative che consentono frazionamento nativo, come cromatografia di esclusione dimensionale, sono stati ampiamente utilizzati per oltre 50 anni per caratterizzare complessi proteici. Noi e altri hanno dimostrato che la risoluzione del blu PAGE nativa è superiore a quella ottenuta mediante cromatografia di esclusione dimensionale 20, 31, 32, 33. Un altro vantaggio di blu PAGINA nativa è che non richiede sistemi di cromatografia, che sono costosi, ma piuttosto utilizza proteine ​​attrezzature elettroforetico che è molto diffusa nei laboratori. In termini di hands-on tempo, questo metodo non comporta più lavoro rispetto al tradizionale geLC-MS / MS unAPPROCCIO o offline cromatografica frazionamento. Tuttavia, come la maggior parte delle tecniche di frazionamento fanno, ha un limite alla loro risoluzione. Complessi che sono molto omogenei o chiudere in massa e la forma può essere oltre la risoluzione offerta dal blu PAGE nativa, e quindi il protocollo come riportato qui potrebbe non essere universalmente riuscito a risolvere complessi distinti con subunità condivisi. È incoraggiante, abbiamo avuto successo nel separare due complessi tetrameriche molto simili che condividono tre subunità (M. Pardo, manoscritto in preparazione).

    Poiché spettrometria di massa è diventata sempre più sensibile, anche piccole quantità di interattori e contaminanti non specifici possono essere rilevati in campioni di AP-MS. L'approccio qui presentato potrebbe aiutare nel discriminare interattori reali dalla contaminazione di fondo nella purificazione di affinità focalizzando l'attenzione sulle proteine ​​con picchi di migrazione che coincidono con picchi di migrazione esche a più alto peso molecolare di quello dile proteine ​​monomeriche.

    Diversi gruppi hanno utilizzato tecniche di frazionamento seguite da proteine correlazione profilatura a delineare complessi proteici in scala cellulare senza bisogno di precedente isolamento 10, 11, 12, 34. Tuttavia, ciò può comportare il mancato rilevamento interazioni sub-stechiometrico. L'incorporazione di una fase di arricchimento attraverso la purificazione di affinità può aiutare a superare questo. L'approccio qui descritto dovrebbe essere generalmente utile per esplorare la topologia di complessi proteici e disfare le molteplici complessi una data proteina partecipa nello stesso contesto cellulare. La strategia è semplice e suscettibili di laboratori che non possono avere costose apparecchiature di frazionamento cromatografico per risolvere complessi proteici.

    Dichiarazioni

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    Gli autori non hanno nulla da rivelare.

    Ringraziamenti

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust (WT098051).

    Materiali

    Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
    NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
    Proteina G DynabeadsLife Technologies10003D
    FLAG anticorpo M2Sigma-AldrichF1804
    Tween-20, grado proteico, soluzione al 10%Millipore655206
    dimetilpimelimidatoSigma-Aldrich80490
    0,2 M tampone trietanolammina, pH 8,2Sigma-AldrichT0449
    3x FLAG peptideSigma-AldrichF4799
    Vivaspin 5K NMWCO, PESSartoriusVS0112
    NativePAGE 3-12% Bis-Tris gelLife TechnologiesBN1001
    20x NativePAGE Running BufferLife TechnologiesBN2001
    20x NativePAGE Cathodo AdditiveLife TechnologiesBN2002
    4x NativePAGE tampone di caricamento del campioneLife TechnologiesBN2003
    NativeMARKLife TechnologiesLC0725
    NativePAGE 5% G-250 additivo del campione Life TechnologiesBN2004
    Nunc fondo conico piastra a 96 pozzetti, polipropileneThermo249944
    Multiscreen HTS 96 pozzetti Sistema di filtrazioneThermoMSDVN6550
    Nunc con tappo a 96 pozzetti naturaleThermo276002
    TCEP (Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato)Sigma-Aldrich646547
    IodoacetammideSigma-AldrichI1149
    Acetonitrile, grado HPLCFisher ScientificA/0627/17
    Tripsina, grado di sequenziamentoRoche11418475001
    MaxQuant (software)N.A.N.A.http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant
    Perseus (software)N.A.N.A.http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus

    Riferimenti

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