Il metodo descritto qui consente la visualizzazione dell'attivazione dell'infiammazione dipendente dal promotore IL-8 nei polmoni dei topi attraverso la bioluminescenza non invasiva (BLI). Lo stesso animale può essere sottoposto a più volte BLI per un massimo di due mesi a partire dal momento della consegna del costruttore di reporter luciferasi.
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Articolo metodologico
Un modello di topo transgenizzato IL-8 per il
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'infiammazione delle vie aeree è spesso associata a infezioni batteriche e rappresenta un determinante importante della malattia polmonare. La determinazione in vivo delle capacità proinfiammatorie di vari fattori è impegnativa e richiede procedure terminali, come lavaggio broncoalveolare e rimozione dei polmoni per analisi in situ , escludendo la visualizzazione longitudinale nello stesso topo. Qui, l'infiammazione del polmone è indotta attraverso l'instillazione intratracheale del supernatante di coltura Pseudomonas aeruginosa (SN) in topi transientemente transgeniati che esprimono il gene reporter del luciferasi sotto il controllo di un promotore bovino eterologo IL-8. L'espressione della luciferasi nel polmone è controllata dall'analisi bioluminescente (BLI) in vivo su un tempo di 2,5 a 48 ore dopo l'instillazione. La procedura può essere ripetuta più volte entro 2 - 3 mesi, consentendo così la valutazione della risposta infiammatoria negli stessi topi conLa necessità di terminare gli animali. Questo approccio consente di monitorare in tempo reale i fattori pro e anti-infiammatori che agiscono nel polmone e sembra adatto per studi funzionali e farmacologici.
Introduzione
Malattie polmonari croniche, come l'asma, la malattia polmonare cronica ostruttiva (BPCO), la fibrosi cistica (CF) e la bronchiectasia, sono caratterizzati da infiammazioni delle vie aeree. L'infiammazione delle vie aeree è caratterizzata da edema, infiltrazione cellulare, linfocita T e attivazione delle cellule mastiche, aumento delle secrezioni delle vie aeree e deposizione eccessiva di collagene. CF è un disturbo multisystem e la sua principale causa di mortalità e morbilità è l'infezione batterica polmonare con aggravamento dell'esacerbazione polmonare. Il declino della funzione polmonare prevede un risultato significativamente più povero
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Protocollo
Tutti gli esperimenti animali descritti sono stati approvati dal comitato intramurale per la sperimentazione animale del Centro Interdipartimentale di Ricerca Sperimentale presso l'Università degli Studi di Verona e rispettano la Direttiva Europea 2010/63 UE, il D.Lgs 26/2014 e la revisione "Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio", Washington, DC: National Academy Press, 1996. Questo protocollo e la sperimentazione sono stati approvati dal National Institutes of Health (n 273/15). Gli animali avevano accesso libero ai normali mangimi di roditori e all'acqua del rubinetto ammorbidito e sono stati acclimatati per almeno 5 giorni alle condizi....
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Risultati
Il modello del topo transgenico bIL-8-Luc è stato utilizzato per il monitoraggio in vivo dell'infiammazione polmonare nei topi sfidati con supernatante batterico concentrato (30x) contenente fattori di virulenza di secrezione. La risposta infiammatoria indotta è stata rilevata dall'immagine in vivo come aumento del segnale BLI. L'attività proinfiammatoria è stata chiaramente rilevabile dopo 2,5 h post-instillazione, anche se il segnale BLI ha raggiunto il pi.......
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Discussione
In un precedente lavoro 11 , è stato mostrato un contrasto tra i marcatori BLI e BAL dipendenti da bIL-8-Luc. Si è basata sul grado differenziale di sensibilità all'interno dei ceppi del mouse 12 . Per questa ragione, la prima applicazione del modello bIL-8-Luc su un diverso ceppo di topi richiede uno studio iniziale della risposta infiammatoria, sia in termini di BLI che di marcatori infiammatori più standardizzati.
La trasfezione dei topi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto FFC n. 18/2013, FFC # 29/2015 e dalla Lega Cistica Fibrosa Italiana attraverso la Federazione Italiana di Fibrosi Cistica (Associazione Veneta Lotta contro la Fibrosi Cistica Onlus).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sistema di tomografia a fluorescenza FMT 2500 | Perkin Elmer Inc. | Costruttore | |
| IVIS Lumina serie II Pre-clinico In Vivo; Sistema di imaging | Perkin Elmer Inc. | Costruttore | |
| MMPsense 750 FAST | Perkin Elmer Inc. | NEV10001EX | Proteggere dalla luce, conservare la sonda a 4 gradi C |
| Femmina consanguinea BalbC | Harlan Laboratories Italia | Prima dell'uso, gli animali sono stati acclimatati per almeno 5 giorni alle condizioni locali del vivaio | |
| bIL-8-Luc | plasmide Dipartimento di Scienze Mediche Veterinarie, Università di Parma, Italia | Conservare il plasmide a -20 ° C | |
| pGL3basic vettore | Promega | E1751 | Memorizza il vettore a -20 ° C |
| Reagente di trasfezione DNA JetPEI | Trasfezione Polyplus | 201B-001G | La miscela di DNA e JetPEI è stata formulata con un rapporto N/P finale di 7 |
| D-luciferina sale di potassio 1 g | Perkin Elmer Inc. | 122796 | Proteggere dalla luce, conservare a -20 gradi C |
| Living Image software | Caliper Life Sciences,Experimental | Builder | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Non inalare |
| Bio-Plex Cytokine Assay Kit | Bio-Rad Laboratories | M60-009RDPD | Conservare il kit non aperto a 4 gradi; C |
| Contatore di cellule automatizzato | Dasit XT 1800J | Costruttore | |
| modello Penn-century DP-4M Insufflatore di potenza a secco | Penn-century | DPM-EXT | |
| Sistema di anestesia a gas XGI-8 | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Siringa senza ago 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Tagliare le tavole del pistone con una forbice |
| Hamilton 0,10 mL (modello 1710) | A tenuta di gas | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Siringa con ago 1 mL | Pic soluzione | 3,071,260,300,320 | Utilizzo senza ago |
| Tubi di alimentazione in plastica 18ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Tagliare obliquamente la punta |
Riferimenti
- Barnes, P. J. Therapeutic approaches to asthma-chronic obstructive pulmonary disease overlap syndromes. J Allergy Clin Immunol. 136 (3), 531-545 (2015).
- Cohen-Cymberknoh, M., Kerem, E., Ferkol, T., Elizur, A. Airway inflammation in cysti....
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Ristampe e permessi
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Topo transgenico per IL 8Imaging bioluminescenteMonitoraggio dell infiammazione polmonareSovranatante di Pseudomonas aeruginosaTrasferimento genico in vivoIniezione di D luciferinaInstillazione intratrachealeAnalisi della regione di interesseMonitoraggio ripetuto degli animaliInterazioni ospite patogeno
