Presentiamo qui un metodo di coltura cellulare per indurre transizioni mesenchimali-epiteliale (MET) in cellule di sarcoma basato su espressione ectopica combinata di microRNA-200 familiari e grainyhead-like 2 (GRHL2). Questo metodo è adatto per una migliore comprensione dell'impatto biologico della plasticità fenotipica sull'aggressività cancro e trattamenti.
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Articolo metodologico
Induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma
In questo articolo
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Sommario
Abstract
plasticità fenotipica si riferisce a un fenomeno in cui le cellule transitoriamente ottenere tratti di un altro lineage. Durante la progressione del carcinoma, plasticità fenotipica spinge l'invasione, la diffusione e le metastasi. Infatti, mentre la maggior parte degli studi di plasticità fenotipica sono stati nel contesto di carcinomi epiteliali derivate, si scopre sarcomi, che sono mesenchimali in origine, anche esibire plasticità fenotipica, con un sottoinsieme di sarcomi subire un fenomeno che assomiglia a un mesenchymal- transizione epiteliale (TEM). Qui, abbiamo sviluppato un metodo comprendendo la famiglia miR-200 e grainyhead-like 2 (GRHL2) per imitare questo fenomeno MET-come osservato nel sarcoma paziente samples.we sequenzialmente esprimono GRHL2 e la famiglia miR-200 utilizzando la trasduzione delle cellule e trasfezione, rispettivamente , per meglio comprendere le basi molecolari di queste transizioni fenotipiche in cellule di sarcoma. cellule di sarcoma che esprimono miR-200 e GRHL2 hanno dimostrato una maggiore caratteristica atmosfera epitelialeCI della morfologia cellulare e le modificazioni del epiteliali e mesenchimali biomarker. Studi futuri usando questi metodi possono essere utilizzati per comprendere meglio le conseguenze fenotipiche dei processi MET simili su cellule di sarcoma, quali la migrazione, invasione, propensione metastatica, e resistenza alla terapia.
Introduzione
plasticità fenotipica si riferisce ad una transizione reversibile tra fenotipi cellulari, ed è generalmente suddiviso in due tipi, epiteliali-to-mesenchimale (EMT) transizioni e mesenchimali-to-epiteliale transizioni (TEM). Questa plasticità fenotipica gioca un ruolo importante nei normali processi di organismi multicellulari, come lo sviluppo e la guarigione della ferita 1; tuttavia, questi stessi percorsi e programmi di espressione genica può anche portare a malattie come la fibrosi (valutata in 2, 3, 4) e carcinoma metastasi (valutata in riferiment....
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Protocollo
1. Preparazione dei reagenti
- Preparare DMEM per coltura cellulare aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino (FBS) e 5 mL di penicillina-streptomicina (5.000 U / ml) a 500 ml di DMEM. Questo terreno può essere conservato a 4 ° C per un massimo di sei mesi.
- Risospendere primer liofilizzati in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione finale di 10 uM. primer negozio risospese a -20 ° C.
- Preparare dosaggio radioimmunoprecipitazione (RIPA) tampone (150 mM NaCl, 0.5% desossicolato sodico, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0). Supplemento con cocktail inibitore della proteasi prima dell'uso e mantenere tampone sul ghiaccio quando è in uso. Con....
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Risultati
Schema per l'induzione MET in cellule di sarcoma
Una cronologia generale per l'induzione di modifiche MET simili in cellule di sarcoma è mostrato in Figura 1. Il protocollo inizia trasduzione GRHL2 (Figura 1A), seguita da trasfezione della famiglia miR-200 (Figura 1B). familiari GRHL2 o miR-200 non erano in grado di influenzare l'aspetto delle cellule RD quando espres.......
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Discussione
I sarcomi sono rari, ma altamente aggressivi tumori di un lignaggio mesenchimale. Nonostante la loro lignaggio mesenchimali, un sottogruppo di sarcomi sembra subire una transizione fenotipica ad un epiteliale stato simile più. Questo interruttore TEM-like ha rilevanza prognostica, come pazienti con più tumori epiteliali-simili sono meno aggressivi 24. Nonostante la loro rilevanza clinica, ci sono pochi studi che riguardano i meccanismi molecolari mappa queste transizioni fenotipiche in sarcomi. <.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
JAS riconosce il sostegno del duca Cancer Institute, The Duke University genito-urinario Laboratorio di Oncologia, e il Dipartimento di Ortopedia dell'Università Duke. HL è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) Centro di Fisica Teorica biologica (NSF PHY-1.427.654) e NSF DMS-1.361.411, e come un CPRIT (prevenzione del cancro e Research Institute del Texas) Scholar Ricerca sul Cancro dello Stato del Texas alla Rice University. KEW stato supportato dal NIH F32 CA192630 MKJ e HL beneficiato utili discussioni con Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta, e Donald S. Coffey.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Contatore automatizzato Countess | Life technologies | AMQAX1000 | |
| Vetrini per camera di conteggio cellulare Countess | Invitrogen | C10283 | |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Thermo Fisher | A24811 | |
| Odyssey Fc | LI-COR Inc | ||
| ViiA7 Sistema di PCR in tempo reale | Thermo Fisher | 4453536 | |
| PCR micropiastra | Corning | 321-29-051 | |
| KAPA SYBR Kit qPCR universale veloce | KAPA Biosystems | KK4602 | |
| Blocco iniziale (PBS) Tampone di blocco | Thermo Fisher | 37538 | Tampone di blocco a base di BSA |
| Agarosio Uso generale LE | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0732 | Tampone di corsa |
| 10x Tris/Glycine Buffer | Bio-Rad Laboratories Inc | 161-0734 | Tampone di trasferimento |
| RIPA | Buffer Sigma Life Sciences | SLBG8489 | |
| Amersham Protran 0.45 μ m nitrocellulosa | GE Healthcare Lifesciences | 10600012 | |
| Kit MiniPrep Quick-RNA | Genesee Scientific | 11-358 | |
| Laemmli Sample Buffer (4X) | Bio-Rad Laboratories Inc | 1610747 | |
| Mini Trans-Blot Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1703930 | |
| Mini-Protean Tetra Cell | Bio-Rad Laboratories Inc | 1658005EDU | |
| DPBS | Life technologies | 14190-144 | |
| 0,05% Tripsina-EDTA | Life technologies | 11995-065 | |
| DMEM | Life technologies | 11995-065 | |
| Lipofectamine RNAi Max | Thermo Fisher | 13778150 | |
| Lipofectamine 2000 Ragents | Thermo Fisher | 11668019 | |
| Penicillina Streptomicina | Life technologies | 15140-122 | |
| miRVana miRNA miRNA mimic controllo negativo #1 | Thermo Fisher | 4464058 | neg miRNA |
| has-miR-200 mirVana miRNA miMike | Thermo Fisher | 4464066 | miR200A |
| has-miR-200 mirVana miRNA miMik | Thermo Fisher | 4404066 | miR200B |
| has-miR-200 mirVana miRNA miMike | Thermo Fisher | 4404066 | miR200C |
| Opti-MEM | Life technologies | 11088-021 | terreni senza siero |
| anticorpo anti-Ecaderina | BD Bioscience | 610182 | |
| anti-beta actina | Santa Cruz Biotechnology | sc-69879 | |
| anti-EpCam | Ab Serotec | MCA18706 | |
| anti-ZO1 | Invitrogen | 402200 | |
| IRDye 800W | LI-COR Inc | 925-32210 | |
| IRDye 680 | LI-COR Inc | 926-32223 | |
| anti-topo AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | A211241 | |
| anti-coniglio AlexaFluor 647 | Thermo Fisher | ab150075 | |
| Halt Proteasi e Inibitore della fosfasi | Thermo Fisher | 1861281 | |
| Precision Plus Protein Dual Color | Bio-Rad Laboratori Inc | 161-0374 | |
| Partec CellTrics | Sysmex | 04-004-2326 | 30 μ m filtro per flusso |
| GAPDH-F | IDT | AGCCACATCGCTCAGACAC | |
| GAPDH-R | IDT | GCCCAATACGACCAAATCC | |
| Ecadherin-F | IDT | TGGAGGAATTCTTGCTTTGC | |
| Ecadherin-R | IDT | CGCTCTCCCCAAGAAAC | |
| ZEB1-F | IDT | GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC | |
| ZEB1-R | IDT | CGATTACACCCAGACTGC | |
| NOTCH-F | IDT | GGCAATCCGAGGACTATGAG | |
| NOTCH-R | IDT | CTCAGAACGCACTCGTTGAT | |
| nitro blu tetrazolio | Sigma | N5514 | |
| bromuro di esadimetrina | Sigma | H9268 | in polibrene |
| da 3 mL | BD Bioscience | 309657 | |
| Filtro per siringa sterile | VWR | 28145-505 | |
| Provette per citometria | fondo tondo in polipropilene da 5 ml | 352063 | |
| Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità | Thermo Fisher | Kit di trascrizione inversa | 4368814 |
| 4% paraformaldiide | Santa Cruz Biotechnology | sc-281612 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93443 | |
| albumina sierica bovina | Sigma | A7906 |
Riferimenti
- Weber, C. E., Li, N. Y., Wai, P. Y., Kuo, P. C. Epithelial-mesenchymal transition, TGF-beta, and osteopontin in wound healing and tissue remodeling after injury. J Burn Care Res. 33 (3), 311-318 (2012).
- Galichon, P., Finianos, S., Hertig, A. ....
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells
Posted by JoVE Editors on 7/03/2018. Citeable Link.
An erratum was issued for: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells. An author name was updated.
One of the authors' names was corrected from:
Shenghan Xu
to:
Shengnan Xu
