Articolo metodologico

Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di

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DOI:

10.3791/55558

⸱

28 marzo 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University, 2Division of Infectious Diseases, Weill Cornell Medical College, 3Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

In questo articolo

Sommario

Qui si descrive un protocollo per l'estrazione di metaboliti da Staphylococcus aureus e la loro successiva analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa.

Abstract

Nel tentativo di contrastare i batteri patogeni, ospita spesso limitano la disponibilità di nutrienti nel sito di infezione. Questa limitazione può alterare le abbondanze dei metaboliti principali alle quali fattori regolatori rispondono, regolando il metabolismo cellulare. Negli ultimi anni, un certo numero di proteine ​​e RNA sono emersi come importanti regolatori dell'espressione genica virulenza. Ad esempio, la proteina CODY risponde a livelli di amminoacidi ramificati e GTP ed è ampiamente conservato in basso G + C batteri Gram-positivi. Come regolatore globale Staphylococcus aureus, Cody controlla l'espressione di decine di virulenza e geni metabolici. Ipotizziamo che S. aureus utilizza Cody, in parte, per alterare il suo stato metabolico nel tentativo di adattarsi alle condizioni di nutrienti limitativo potenzialmente presenti nell'ambiente ospitante. Questo manoscritto descrive un metodo per l'estrazione e l'analisi metaboliti da S. aureus mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massaspettrometria, un protocollo che è stato sviluppato per verificare questa ipotesi. Il metodo evidenzia anche migliori pratiche che garantiranno rigore e riproducibilità, come il mantenimento stato stazionario biologica e costante aerazione senza l'uso di colture chemostato continue. Rispetto alle USA200 meticillina-sensibili S. aureus isolare UAMS-1 ceppo parentale, il isogenico CODY mutante esposto aumenti significativi amminoacidi derivati da aspartato (ad esempio, treonina e isoleucina) e diminuisce nei loro precursori (ad esempio, aspartato e O -acetylhomoserine ). Queste scoperte correlano bene con i dati trascrizionali ottenuti con l'analisi di RNA-seq: geni in questi percorsi sono up-regolata tra 10 e 800 volte nel mutante nullo Cody. Accoppiamento analisi globali del trascrittoma e il metaboloma può rivelare come i batteri alterano il loro metabolismo di fronte a stress ambientale o nutrizionale, permettono di approfondire il potenziale nelle Physmodifiche iological associati a esaurimento degli elementi nutritivi sperimentato durante l'infezione. Queste scoperte possono aprire la strada per lo sviluppo di nuovi agenti anti-infettivi e terapeutica.

Introduzione

batteri patogeni devono affrontare molte sfide all'interno dell'ambiente host. Oltre a attacco diretto da parte delle cellule immunitarie, l'host sequestra anche nutrienti essenziali per la sopravvivenza batterica e la replicazione, generando immunità nutrizionale 1, 2. Per sopravvivere a questi ambienti ostili, batteri patogeni distribuire fattori di virulenza. Alcuni di questi fattori permettono ai batteri di eludere la risposta immunitaria; Altri fattori includono secreti enzimi digestivi, come ialuronidasi, termonucleasi, e lipasi, che possono permettere ai batteri di riempire le sostanze nutrienti mancanti consumando costituenti derivate dal tessuto 3, 4, 5. Infatti, i batteri hanno sviluppato sistemi regolatori che legano lo stato fisiologico della cella per la produzione di fattori di virulenza 6, 7, up class = "xref"> 8, 9, 10.

Un crescente corpo di evidenze indica Cody come un regolatore fondamentale che collega il metabolismo e virulenza. Sebbene scoperto nel Bacillus subtilis come repressore del gene 11 dipeptide permease (DPP), Cody è ormai noto per essere prodotto da quasi tutti i bassi batteri G + C Gram-positivi 12, 13 e regola decine di geni coinvolti in carbonio e azoto metabolismo 14, 15, 16, 17, 18, 19. In specie patogene, Cody controlla anche l'espressione di alcuni tra i più importanti geni di virulenza 20, 21,. ef "> 22, 23, 24, 25, 26, 27 Cody è attivata come una proteina legante il DNA da due classi di ligandi: amminoacidi ramificati (BCAA, isoleucina, leucina e valina [ILV]) e GTP . Quando questi nutrienti sono abbondanti, Cody reprime (o in alcuni casi, stimola) trascrizione. Poiché questi nutrienti diventano limitato, attività Cody è progressivamente ridotto, con conseguente risposta trascrizionale graduata che ri-rotte precursori attraverso varie vie metaboliche legate al metabolismo centrale 28, 29, 30.
Tandem cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS) è una tecnica potente che può identificare accuratamente e quantificare piccole molecole metaboliti intracellulari 31. Quando è accoppiato con transcAnalisi riptome (ad esempio, RNA-Seq), questo flusso di lavoro di analisi in grado di fornire una conoscenza delle cambiamenti fisiologici che si verificano in risposta a stress ambientale o nutrizionale. Qui, presentiamo un metodo per l'estrazione metabolita da cellule di Staphylococcus aureus e successiva analisi mediante LC-MS. Questo approccio è stato utilizzato per dimostrare gli effetti pleiotropici di Cody su S. aureus fisiologia.

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Protocollo

1. Preparazione del Buffer Solutions

  1. Preparare salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) diluendo una soluzione stock di 10x PBS ad una concentrazione finale di 1x con ultrapura (distillata e deionizzata) acqua.
  2. Preparare la soluzione quenching combinando 2 mL di acetonitrile, 2 mL di metanolo, 1 mL di H 2 O ultrapura, e 19 microlitri (0,1 mM di concentrazione finale) di acido formico.
  3. Preparare LC-MS solvente A per aggiunta di acido formico (0,2% [v / v] concentrazione finale) per acqua ultrapura.
  4. Preparare LC-MS solvente B per aggiunta di acido formico (0,2% [v / v] concentrazione finale) per acetonitrile.
    NOTA: Tutte le soluzioni dovrebbero essere preparate utilizzando i reagenti più alto grado di purezza disponibile (in genere ad alte prestazioni di prima scelta cromatografia liquida). Le soluzioni devono essere preparate fresco prima di ogni esperimento e conservati in ghiaccio prima dell'uso.

2. Istituzione di steady-state S. aureus Crescita

  1. Streak S. aureuceppi s di interesse per l'isolamento sul Tryptic Soy Agar (TSA) da uno stock di glicerolo congelato. Incubare a 37 ° C per 16-24 h.
  2. Seminare 4 mL di brodo Tryptic Soy (TSB) o altro mezzo idoneo in provette di incubazione vetro sterili con singole colonie di ciascun ceppo. Incubare inclinata (~ 70 ° angolo) con rotazione a 60 giri al minuto (rpm) a 37 ° C per 16-20 ore.
    NOTA: culture di notte sono inclini a gradienti di ossigeno utilizzando metodi standard, comprese quelle descritte nella fase 2.2, che influenzano fisiologia cellulare. Così, ci avvaliamo di una strategia multipla back-diluizione al fine di garantire a regime biologico (vedere i passi 2.4-3.2, di seguito).
  3. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica delle colture dal punto 2.2 a 600 nm (OD 600). Utilizzare mezzo sterile come riferimento ottico (vuoto). Diluire le cellule ad una OD 600 di 0,05 a 50 ml di terreno TSB sterile (preriscaldata a 37 ° C) in separato, 250 mL DeLong fiaschi.
  4. incubate le colture a 37 ° C in un bagno d'acqua con agitazione a 280 rpm.
  5. Ogni 30 minuti, prendere OD 600 misurazioni; all'aumentare delle densità ottiche, può essere necessario diluire le culture con TSB modo che rimangano nell'intervallo assorbanza lineare dello spettrofotometro.
  6. Quando le culture dal punto 2.5 raggiungono un OD 600 di ~ 0.8-1.0, li subcoltura in 50 ml di 37 ° C TSB ad un OD 600 di 0,01-0,05 e ripetere i punti 2.4 e 2.5.

Setup Collection 3. Il campione

  1. Preparare un letto di ghiaccio secco tritato in un recipiente appropriato (ad esempio, vetro piatto, ghiaccio, o raffreddamento).
  2. Poiché le densità ottiche delle culture avvicinano al punto di raccolta desiderata, aggiungere 1 ml di soluzione di tempra 35 mm greggia Petri e pre-raffreddamento in ghiaccio secco per ≥5 min.
    NOTA: Il "punto di raccolta desiderato" varierà a seconda degli obiettivi sperimentali. Ad esempio, se si dovesse verificare metabolites durante la crescita aerobica, indicatori chiave di questo stato includono escrezione acetato e ri-assimilazione del acetato durante la fase di crescita post-esponenziale 32, 33. Generalmente, questo punto dovrebbe essere all'interno di una fase di crescita specifico (ad esempio, fase esponenziale). Le specifiche OD 600 valori associati a questo stadio può variare tra i diversi ceppi batterici e mezzi di crescita.
  3. Posizionare una fritta filtro in acciaio inox (pre-raffreddata a -20 ° C) in un tappo di gomma e posizionarlo in cima una beuta da vuoto collegata ad un vuoto casa o pompa a vuoto.
  4. Applicare il vuoto e posizionare un misto estere di cellulosa membrana (0,22 um dimensione dei pori) sulla parte superiore.
    NOTA: È fondamentale utilizzare un filtro con un diametro uguale a quello della fritta e per centrare correttamente questo filtro per garantire che il campione viene fatto passare attraverso il filtro, piuttosto che sul bordo. Bagnare la membrana con ghiacciata, H 2 O sterile può aiutarecon il posizionamento della membrana.

4. Esempio Harvest

  1. A un OD 600 di ~ 0,4-0,5, utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere 13 ml di coltura dal pallone e di applicare il campione al filtro.
  2. Dopo che l'intero campione è stato filtrato, immediatamente lavare il filtro con ≥5 mL di PBS ghiacciato per lavare via metaboliti medie associata.
  3. Scollegare il vuoto e usare un paio di pinzette sterili per rimuovere il filtro dal fritta. Invertire il filtro (cella rivolto verso il basso) nella soluzione di raffreddamento pre-raffreddata.
    NOTA: È importante eseguire i passaggi sopra rapidamente (cioè entro secondi) e appena il liquido è stato rimosso per assicurare il raffreddamento rapido delle cellule, arrestando l'attività metabolica.
  4. Incubare il filtro in soluzione di raffreddamento in ghiaccio secco per ≥20 min.
  5. Con una pinzetta sterili, invertire il filtro (cella rivolta verso l'alto) nella capsula di Petri e utilizzare una micropipetta per sciacquare le cellule fuori di tegli membrana nella soluzione di tempra.
  6. Risospeso le cellule in soluzione di raffreddamento e poi trasferire la sospensione cellulare in una provetta 2 mL antiurto sterile contenente ~ 100 ml di perline di silice 0,1 mm. Conservare questo in ghiaccio secco o a -80 ° C.

5. Estrazione Metabolite

  1. campioni scongelamento in ghiaccio e distruggere le cellule in un omogeneizzatore con quattro 30 s raffica a 6.000 rpm, con periodi di raffreddamento 2 min in ghiaccio secco tra cicli.
  2. Chiarire i lisati per 15 min in un pre-raffreddata, microcentrifuga refrigerata alla massima velocità (cioè, 18.213 xga ≤4 ° C).
  3. Trasferire il surnatante in una provetta pulita.
  4. Usando una micropipetta, trasferire una piccola porzione del campione in una provetta per la quantificazione del contenuto peptide residuo nel passaggio 6; memorizzare il residuo a -80 ° C.
    NOTA: Il volume del campione riservato varia, a seconda del dosaggio BCA utilizzato nel passaggio 6.1. Questocampione deve essere conservato in ghiaccio per l'analisi immediata o congelato a -80 ° C.

6. Acido bicinconinico (BCA) Assay

  1. Eseguire un saggio BCA come raccomandato dal produttore del kit, utilizzando campioni dal punto 5.4 per determinare la concentrazione del peptide residuo per ogni campione.

7. LC-MS

  1. Mescolare 75 ml di S. aureus estratto con 75 ml di LC-MS solvente B, preparato al punto 1.4.
  2. Vortex per miscelare e far girare a 13.000 xg per 5 min.
  3. Posizionare 100 ml di surnatante in una cromatografia liquida (LC) fiala e tappare esso. Assicurarsi che non bolle d'aria intrappolate nel campione.
  4. Caricare le fiale LC sul campionatore automatico LC-MS e modificare l'elenco in esecuzione nel software "Offline Worklist Editor".
    1. Compila il "Nome del campione" (ad esempio, wild-type-1), "Sample Position" (ad esempio, P1-A1), "Metodo" (ad esempio, formico Acid-negativi Method), e (per esempio, wild-type-1) colonne di "File di dati". Fare clic sul pulsante sul pulsante "Salva lista di lavoro". Aprire il software "Spettrometria di Massa Data Acquisition Workstation" e inserire la lista di lavoro salvato in precedenza. Fare clic sul pulsante "Start lista di lavoro Run" per avviare la misurazione continua LC-MS.
  5. Separare i campioni su una colonna, collegare la colonna a un tempo di spettrometro di volo (TOF), e coppia lo spettrometro TOF con il sistema LC. Utilizzare un gradiente di fase mobile come segue: 0-2 min, 85% di solvente B; 3-5 min, 80% di solvente B; 6-7 min, 75% di solvente B; 8-9 min, 70% di solvente B; 10-11,1 min, 50% di solvente B; 11,1-14 min, 20% di solvente B; e 14,1-24 min, 5% di solvente B; terminare con un punto riequilibrio 10 min a 85% di solvente B e una velocità di flusso di 0,4 mL min -1.
  6. Utilizzando una pompa isocratica, infondere una soluzione massa di riferimento con la corsa per consentire la calibrazione simultanea asse massa.
    NOTA: questo passaggiosi basa sul manuale spettrometro TOF standard.
    1. Utilizzare la miscela di acido acetico e D4 esakis (1H, 1H, 3H-tetrafluoropropoxy) phosphazine come soluzione massa di riferimento per eseguire la calibrazione in tempo reale. Usare la pompa isocratica con velocità di flusso di 2.5 mL min -1 per l'infusione.

8. Batch Correzione di Conti Ion

  1. Designare qualsiasi campione per servire come campione di riferimento per la correzione batch (ad esempio, di tipo selvaggio, replicare 1).
  2. Calcolare la somma dei conteggi di ioni per tutti i metaboliti all'interno del campione di riferimento. Ripetere questo calcolo per tutti i campioni.
  3. Dividere il numero totale di ioni di ciascun campione dal conteggio ionica totale del campione di riferimento per generare un rapporto.
  4. Dividere il numero di ioni per ogni metabolita all'interno di un campione dal rapporto campione / riferimento per ottenere un numero di ioni lotti corretta per ciascun metabolita.

9. Peptide Normalizzazione

  1. Divide i valori di conteggio ionico lotti corretta per ciascun campione ottenuto nel passaggio 8 per la concentrazione del peptide determinata con il saggio BCA nel passaggio 6 per ottenere un valore normalizzato per ciascun metabolita.
    NOTA: I normalizzati, batch lotto corretto conteggio ionico per ciascun metabolita ottenuto nello stadio 9.1 può essere direttamente confrontata tra ceppi e sottoposto ad analisi statistica (ad esempio, una U di Mann-Whitney -test). In alternativa, un metabolita caratterizza per essere invariato sia attraverso un trattamento o background genetico può essere utilizzato come un normalizzatore per rilevare le variazioni dovute al metabolita decomposizione. L'inclusione di una quantità nota di L-norvalina o acido gluraric nel tampone di estrazione può essere utilizzato per correggere la perdita durante l'elaborazione del campione 34.

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Risultati

Abbiamo analizzato piscine metaboliti intracellulari di S. aureus durante la crescita in vitro in una ricca, mezzo complesso. Come prova di principio, abbiamo confrontato i profili dei metaboliti tra il sensibile alla meticillina di S. aureus osteomielite isolare UAMS-1 (wild-type [WT]) e un ceppo isogenico manca il regolatore trascrizionale globale Cody (Δ Cody) 26. Stato stazionario, culture esponenziali dei ceppi WT e Cod...

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Discussione

Tutti i metaboliti piccole molecole sono collegate tra di loro attraverso le loro origini comuni in vie metaboliche centrali. Durante la crescita esponenziale, le cellule batteriche sono a regime biologico e metabolico, fornendo una fotografia dello stato fisiologico in condizioni specifiche. Cody monitora sufficienza nutrienti rispondendo a IBT e GTP. Come ILV e GTP piscine goccia, attività Cody è probabile progressivamente ridotto, regolando l'espressione dei suoi geni bersaglio per adattarsi alla crescente esauri...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato in parte da un NIH Pathway to Independence Award (Grant GM 099.893) ei fondi di avvio facoltà di SRB, nonché un progetto di assegno di ricerca (Grant GM 042.219). I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta dei dati e l'interpretazione, o la decisione di presentare il lavoro per la pubblicazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Materiale/Attrezzaturaa
DeLong Pallone per colture (250 mL)Belco2510-00250
, 500 mLPyrex5340
#7Fisher14-131E
Portafiltro/fritta in acciaio inossidabileVWR89428-936
Piastra di Petri, 35 mmCorning430588Non trattato con coltura tissutale
Membrana mista di estere di cellulosa, 0,22 μ m dimensione dei poriMilliporeGSWP02500
Provette resistenti agli urti, 2 mLUSA Scientific1420-9600
Perle di silice, 0,1 mmBiospec Products Inc11079101Z
Omogeneizzatore Precellys 24Bertin InstrumentsEQ03119-200-RD000.0
Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCAPierce (Thermo Scientific)23235
Colonna Cogent Diamond idruro di tipo CAgilent70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, pompaQuat AgilentG6230B
AgilentG4204Aserie 1290
Pompa per bidoni, serie 1290AgilentG4220A 
Azionamento valvole, serie 1290AgilentG1107A 
Pompa isocratica, serie 1290AgilentG1310B 
TCC, Serie 1290AgilentG1316C 
Campionatore, Serie 1290AgilentG4226A 
Termostato, Serie 1290AgilentG1330B 
Chimico
Triptico Brodo di soiaBecton Dickinson211825
Difco Agar, GranulatoBecton Dickinson214530Il terreno solido contiene l'1,5% [p/v] di agar
Soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,4) 10xAmbionAM9624Diluire fresco a 1x con acqua ultrapura
AcetonitrileFisher ScientificA955-500Optima LC-MS
MetanoloFisher ScientificA456-500Optima LC-MS; tossico
Acido FormicoSigma Aldrich94318Per spettrometria di massa, 98%
Software
MassHunterAgilentG3337AA
Ceppo battericoSpecieCeppoGenotipo
SRB 337Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1tipo selvatico
SRB 372Staphylococcus aureusUSA200 MSSA UAMS-1Δ codY::erm
aI prodotti chimici e i materiali elencati sono specifici per il metodo descritto e non includono prodotti chimici o forniture standard di laboratorio.
Pallone per armi da fianco Tappo in gomma a 3 fori , serie 6200, ;

Riferimenti

  1. Hood, M. I., Skaar, E. P. Nutritional immunity: transition metals at the pathogen-host interface. Nat. Rev. Microbiol. 10 (8), 525-537 (2012).
  2. Weinberg, E. D. Clinical enhancement of nutritional immunity. Comp. Ther. 1 (5), 38-40 (1975).
  3. Ibberson, C. B., et al. Staphylococcus aureus hyaluronidase is a CodY-regulated virulence factor. Infect. Immun. 82 (10), 4253-4264 (2014).
  4. Lee, C. Y., Iandolo, J. J. Mechanism of bacteriophage conversion of lipase activity in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 164 (1), 288-293 (1985).
  5. Olson, M. E., et al. Staphylococcus aureus nuclease is an SaeRS-dependent virulence factor. Infect. Immun. 81 (4), 1316-1324 (2013).
  6. Somerville, G. A., Proctor, R. A. At the crossroads of bacterial metabolism and virulence factor synthesis in Staphylococci. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 73 (2), 233-248 (2009).
  7. Seidl, K., et al. Staphylococcus aureus CcpA affects virulence determinant production and antibiotic resistance. Antimicrob. Agents Chemother. 50 (4), 1183-1194 (2006).
  8. Richardson, A. R., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Regulating the intersection of metabolism and pathogenesis in Gram-positive bacteria. Microbiol. Spectr. 3 (3), 1-27 (2015).
  9. Geiger, T., et al. Role of the (p)ppGpp synthase RSH, a RelA/SpoT homolog, in stringent response and virulence of Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 78 (5), 1873-1883 (2010).
  10. Gaupp, R., et al. RpiRc is a pleiotropic effector of virulence determinant synthesis and attenuates pathogenicity in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 84 (7), 2031-2041 (2016).
  11. Serror, P., Sonenshein, A. L. Interaction of CodY, a novel Bacillus subtilis DNA-binding protein, with the dpp promoter region. Mol. Microbiol. 20 (4), 843-852 (1996).
  12. Sonenshein, A. L. CodY, a global regulator of stationary phase and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 8 (2), 203-207 (2005).
  13. Brinsmade, S. R. CodY, a master integrator of metabolism and virulence in Gram-positive bacteria. Curr. Genet. , [Epub ahead of print] (2016).
  14. Molle, V., et al. Additional targets of the Bacillus subtilis global regulator CodY identified by chromatin immunoprecipitation and genome-wide transcript analysis. J. Bacteriol. 185 (6), 1911-1922 (2003).
  15. Moses, S., et al. Proline utilization by Bacillus subtilis: Uptake and catabolism. J. Bacteriol. 194 (4), 745-758 (2012).
  16. Lobel, L., Herskovits, A. A. Systems level analyses reveal multiple regulatory activities of CodY controlling metabolism, motility, and virulence in Listeria monocytogenes. PLoS Genet. 12 (2), 1-27 (2016).
  17. Belitsky, B. R., Sonenshein, A. L. CodY-mediated regulation of guanosine uptake in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 193 (22), 6276-6287 (2011).
  18. den Hengst, C. D., Buist, G., Nauta, A., Van Sinderen, D., Kuipers, O. P., Kok, J. Probing direct interactions between CodY and the oppD promoter of Lactococcus lactis. Microbiol. 187 (2), 512-521 (2005).
  19. Fisher, S. H. Regulation of nitrogen metabolism in Bacillus subtilis: vive la différence. Mol. Microbiol. 32 (2), 223-232 (1999).
  20. Dineen, S. S., McBride, S. M., Sonenshein, A. L. Integration of metabolism and virulence by Clostridium difficile CodY. J. Bacteriol. 192 (20), 5350-5362 (2010).
  21. Dineen, S. S., Villapakkam, A. C., Nordman, J. T., Sonenshein, A. L. Repression of Clostridium difficile toxin gene expression by CodY. Mol. Microbiol. 66 (1), 206-219 (2007).
  22. Hendriksen, W. T., et al. CodY of Streptococcus pneumoniae: Link between nutritional gene regulation and colonization. J. Bacteriol. 190 (2), 590-601 (2008).
  23. Bennett, H. J., et al. Characterization of relA and codY mutants of Listeria monocytogenes: Identification of the CodY regulon and its role in virulence. Mol. Microbiol. 63 (5), 1453-1467 (2007).
  24. Stenz, L., Francois, P., Whiteson, K., Wolz, C., Linder, P., Schrenzel, J. The CodY pleiotropic repressor controls virulence in Gram-positive pathogens. FEMS Immunol. and Med. Microbiol. 62 (2), 123-139 (2011).
  25. Majerczyk, C. D., et al. Direct targets of CodY in Staphylococcus aureus. J. Bacteriol. 192 (11), 2861-2877 (2010).
  26. Majerczyk, C. D., Sadykov, M. R., Luong, T. T., Lee, C., Somerville, G. A., Sonenshein, A. L. Staphylococcus aureus CodY negatively regulates virulence gene expression. J. Bacteriol. 190 (7), 2257-2265 (2008).
  27. Pohl, K., et al. CodY in Staphylococcus aureus: A regulatory link between metabolism and virulence gene expression. J. Bacteriol. 191 (9), 2953-2963 (2009).
  28. Sonenshein, A. L. Control of key metabolic intersections in Bacillus subtilis. Nat. Rev. Microbiol. 5 (12), 917-927 (2007).
  29. Brinsmade, S. R., et al. Hierarchical expression of genes controlled by the Bacillus subtilis global regulatory protein CodY. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 111 (22), 2-7 (2014).
  30. Waters, N. R., et al. A spectrum of CodY activities drives metabolic reorganization and virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol. Microbiol. 101 (3), 495-514 (2016).
  31. Zhou, B., Xiao, J. F., Tuli, L., Ressom, H. W. LC-MS-based metabolomics. Mol. Biosyst. 8 (2), 470-481 (2012).
  32. Somerville, G. A., et al. Staphylococcus aureus aconitase inactivation unexpectedly inhibits post-exponential-phase growth and enhances stationary-phase survival. Infect. Immun. 70 (11), 6373-6382 (2002).
  33. Somerville, G. A., Said-Salim, B., Wickman, J. M., Raffel, S. J., Kreiswirth, B. N., Musser, J. M. Correlation of acetate catabolism and growth yield in Staphylococcus aureus: Implications for host-pathogen interactions. Infect. Immun. 71 (8), 4724-4732 (2003).
  34. Brinsmade, S. R., Kleijn, R. J., Sauer, U., Sonenshein, A. L. Regulation of CodY activity through modulation of intracellular branched-chain amino acid pools. J. Bacteriol. 192 (24), 6357-6368 (2010).
  35. Kaiser, J. C., Omer, S., Sheldon, J. R., Welch, I., Heinrichs, D. E. Role of BrnQ1 and BrnQ2 in branched-chain amino acid transport and virulence in Staphylococcus aureus. Infect. Immun. 83 (3), 1019-1029 (2015).
  36. Ledala, N., Zhang, B., Seravalli, J., Powers, R., Somerville, G. A. Influence of iron and aeration on Staphylococcus aureus growth, metabolism, and transcription. J. Bacteriol. 196 (12), 2178-2189 (2014).
  37. Novick, R. P. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Micorbiol. 48 (6), 1429-1449 (2003).
  38. Pesek, J. J., Matyska, M. T., Fischer, S. M., Sana, T. R. Analysis of hydrophilic metabolites by high-performance liquid chromatography-mass spectrometry using a silica hydride-based stationary phase. J. Chromatog. A. 1204 (1), 48-55 (2008).
  39. Guan, X., Hoffman, B., Dwivedi, C., Matthees, D. P. A simultaneous liquid chromatography/mass spectrometric assay of glutathione, cysteine, homocysteine and their disulfides in biological samples. J. Pharm. Biomed. Anal. 31 (2), 251-261 (2003).
  40. Sporty, J. L., Kabir, M. M., Turteltaub, K. W., Ognibene, T., Lin, S. J., Bench, G. Single sample extraction protocol for the quantification of NAD and NADH redox states in Saccharomyces cerevisiae. J. Sep. Sci. 31 (18), 3202-3211 (2008).
  41. Rabinowitz, J. D., Kimball, E. Acidic acetonitrile for cellular metabolome extraction from Escherichia coli. Anal. Chem. 79 (16), 6167-6173 (2007).
  42. Somerville, G. A., Powers, R. Growth and preparation of Staphylococcus epidermidis for NMR metabolomic analysis. Methods Mol. Biol. 1106, 71-91 (2014).
  43. Roux, A., Todd, D. A., Velazquez, J. V., Cech, N. B., Sonenshein, A. L. CodY-Mediated regulation of the Staphylococcus aureus Agr system integrates nutritional and population density signals. J. Bacteriol. 196 (6), 1184-1196 (2014).
  44. Guillet, J., Hallier, M., Felden, B. Emerging functions for the Staphylococcus aureus RNome. PLoS Pathog. 9 (12), 1003767(2013).
  45. Sauer, U., et al. Metabolic flux ratio analysis of genetic and environmental modulations of Escherichia coli central carbon metabolism. J. Bacteriol. 181 (21), 6679-6688 (1999).
  46. Niittylae, T., Chaudhuri, B., Sauer, U., Frommer, W. B. Comparison of Quantitative Metabolite Imaging Tools and Carbon-13 Techniques for Fluxomics. Methods Mol. Biol. 553 (1), 355-372 (2009).
  47. de Carvalho, L. P. S., Fischer, S. M., Marrero, J., Nathan, C., Ehrt, S., Rhee, K. Y. Metabolomics of Mycobacterium tuberculosis reveals compartmentalized co-catabolism of carbon substrates. Chem. Biol. 17 (10), 1122-1131 (2010).
  48. Weisenberg, S. A., Butterfield, T. R., Fischer, S. M., Rhee, K. Y. Suitability of silica hydride stationary phase, aqueous normal phase chromatography for untargeted metabolomic profiling of Enterococcus faecium and Staphylococcus aureus. J. Sep. Sci. 32 (13), 2262-2265 (2009).

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