Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Sommario

Qui si descrive un protocollo per l'estrazione di metaboliti da Staphylococcus aureus e la loro successiva analisi mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa.

Abstract

Nel tentativo di contrastare i batteri patogeni, ospita spesso limitano la disponibilità di nutrienti nel sito di infezione. Questa limitazione può alterare le abbondanze dei metaboliti principali alle quali fattori regolatori rispondono, regolando il metabolismo cellulare. Negli ultimi anni, un certo numero di proteine ​​e RNA sono emersi come importanti regolatori dell'espressione genica virulenza. Ad esempio, la proteina CODY risponde a livelli di amminoacidi ramificati e GTP ed è ampiamente conservato in basso G + C batteri Gram-positivi. Come regolatore globale Staphylococcus aureus, Cody controlla l'espressione di decine di virulenza e geni metabolici. Ipotizziamo che S. aureus utilizza Cody, in parte, per alterare il suo stato metabolico nel tentativo di adattarsi alle condizioni di nutrienti limitativo potenzialmente presenti nell'ambiente ospitante. Questo manoscritto descrive un metodo per l'estrazione e l'analisi metaboliti da S. aureus mediante cromatografia liquida accoppiata con spettrometria di massaspettrometria, un protocollo che è stato sviluppato per verificare questa ipotesi. Il metodo evidenzia anche migliori pratiche che garantiranno rigore e riproducibilità, come il mantenimento stato stazionario biologica e costante aerazione senza l'uso di colture chemostato continue. Rispetto alle USA200 meticillina-sensibili S. aureus isolare UAMS-1 ceppo parentale, il isogenico CODY mutante esposto aumenti significativi amminoacidi derivati da aspartato (ad esempio, treonina e isoleucina) e diminuisce nei loro precursori (ad esempio, aspartato e O -acetylhomoserine ). Queste scoperte correlano bene con i dati trascrizionali ottenuti con l'analisi di RNA-seq: geni in questi percorsi sono up-regolata tra 10 e 800 volte nel mutante nullo Cody. Accoppiamento analisi globali del trascrittoma e il metaboloma può rivelare come i batteri alterano il loro metabolismo di fronte a stress ambientale o nutrizionale, permettono di approfondire il potenziale nelle Physmodifiche iological associati a esaurimento degli elementi nutritivi sperimentato durante l'infezione. Queste scoperte possono aprire la strada per lo sviluppo di nuovi agenti anti-infettivi e terapeutica.

Introduzione

batteri patogeni devono affrontare molte sfide all'interno dell'ambiente host. Oltre a attacco diretto da parte delle cellule immunitarie, l'host sequestra anche nutrienti essenziali per la sopravvivenza batterica e la replicazione, generando immunità nutrizionale ^{1, 2.} Per sopravvivere a questi ambienti ostili, batteri patogeni distribuire fattori di virulenza. Alcuni di questi fattori permettono ai batteri di eludere la risposta immunitaria; Altri fattori includono secreti enzimi digestivi, come ialuronidasi, termonucleasi, e lipasi, che possono permettere ai batteri di riempire le sostanze nutr....

Protocollo

1. Preparazione del Buffer Solutions

1. Preparare salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4) diluendo una soluzione stock di 10x PBS ad una concentrazione finale di 1x con ultrapura (distillata e deionizzata) acqua.
2. Preparare la soluzione quenching combinando 2 mL di acetonitrile, 2 mL di metanolo, 1 mL di H ₂ O ultrapura, e 19 microlitri (0,1 mM di concentrazione finale) di acido formico.
3. Preparare LC-MS solvente A per aggiunta di acido formico (0,2% [v / v] concentrazione finale) per acqua ultrapura.
4. Preparare LC-MS solvente B per aggiunta di acido formico (0,2% [v / v] concentrazione finale) per acetonitrile.
   ....

Risultati

Abbiamo analizzato piscine metaboliti intracellulari di S. aureus durante la crescita in vitro in una ricca, mezzo complesso. Come prova di principio, abbiamo confrontato i profili dei metaboliti tra il sensibile alla meticillina di S. aureus osteomielite isolare UAMS-1 (wild-type [WT]) e un ceppo isogenico manca il regolatore trascrizionale globale Cody (Δ Cody) ^26. Stato stazionario, culture esponenziali dei ceppi WT e Cod.......

Discussione

Tutti i metaboliti piccole molecole sono collegate tra di loro attraverso le loro origini comuni in vie metaboliche centrali. Durante la crescita esponenziale, le cellule batteriche sono a regime biologico e metabolico, fornendo una fotografia dello stato fisiologico in condizioni specifiche. Cody monitora sufficienza nutrienti rispondendo a IBT e GTP. Come ILV e GTP piscine goccia, attività Cody è probabile progressivamente ridotto, regolando l'espressione dei suoi geni bersaglio per adattarsi alla crescente esauri.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Materiale/Attrezzaturaa
DeLong Pallone per colture (250 mL)	Belco	2510-00250
, 500 mL	Pyrex	5340
#7	Fisher	14-131E
Portafiltro/fritta in acciaio inossidabile	VWR	89428-936
Piastra di Petri, 35 mm	Corning	430588	Non trattato con coltura tissutale
Membrana mista di estere di cellulosa, 0,22 μ m dimensione dei pori	Millipore	GSWP02500
Provette resistenti agli urti, 2 mL	USA Scientific	1420-9600
Perle di silice, 0,1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Omogeneizzatore Precellys 24	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Kit per il dosaggio delle proteine Micro BCA	Pierce (Thermo Scientific)	23235
Colonna Cogent Diamond idruro di tipo C	Agilent	70000-15P-2
Accurate-Mass Time-of-Flight (TOF) LC-MS, pompa	Quat Agilent	G6230B
Agilent	G4204A	serie 1290
Pompa per bidoni, serie 1290	Agilent	G4220A
Azionamento valvole, serie 1290	Agilent	G1107A
Pompa isocratica, serie 1290	Agilent	G1310B
TCC, Serie 1290	Agilent	G1316C
Campionatore, Serie 1290	Agilent	G4226A
Termostato, Serie 1290	Agilent	G1330B
Chimico
Triptico Brodo di soia	Becton Dickinson	211825
Difco Agar, Granulato	Becton Dickinson	214530	Il terreno solido contiene l'1,5% [p/v] di agar
Soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,4) 10x	Ambion	AM9624	Diluire fresco a 1x con acqua ultrapura
Acetonitrile	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Metanolo	Fisher Scientific	A456-500	Optima LC-MS; tossico
Acido Formico	Sigma Aldrich	94318	Per spettrometria di massa, 98%
Software
MassHunter	Agilent	G3337AA
Ceppo batterico	Specie	Ceppo	Genotipo
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	tipo selvatico
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	Δ codY::erm
aI prodotti chimici e i materiali elencati sono specifici per il metodo descritto e non includono prodotti chimici o forniture standard di laboratorio.

Pallone per armi da fianco Tappo in gomma a 3 fori , serie 6200, ;