Articolo metodologico

Un test a blot di 5 mc quantificando il livello di metilazione del DNA della dedifferentiation di condrociti In vitro

DOI:

10.3791/55565

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17 maggio 2017

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1Guangzhou Medical University, 2Shenzhen Key Laboratory of Tissue Engineering, Shenzhen Laboratory of Digital Orthopeadic Engineering, Department of Orthopedics, Shenzhen Second People's Hospital (The First Hospital Affiliated to Shenzhen University), 3Department of Chemistry, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Engineering, Shanghai Jiao Tong University, 5Renji Hospital Clinical Stem Cell Research Center, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, 6Shantou University Medical College

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un metodo per quantificare la metilazione del DNA in base alla macchia dot-5-metilcitosina (5-mc). Abbiamo determinato i livelli di 5 mC durante la dedifferentiation dei condrociti. Questa semplice tecnica potrebbe essere utilizzata per determinare rapidamente il fenotipo condrocitico nel trattamento ACI.

Abstract

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La dedifferentiation dei condrociti ialine nei condrociti fibroblastici spesso accompagna l'espansione monoselocca dei condrociti in vitro . Il livello globale di metilazione del DNA dei condrociti è considerato un biomarker adatto per la perdita del fenotipo condrocitico. Tuttavia, i risultati basati su metodi sperimentali diversi possono essere incoerenti. Pertanto, è importante stabilire un metodo preciso, semplice e rapido per quantificare i livelli globali di metilazione del DNA durante la dedifferentiation della condrociti.

Le tecniche di analisi di metilazione a livello genomico in gran parte dipendono dal sequenziamento genomico di bisolfito. A causa del degrado del DNA durante la conversione di bisolfito, questi metodi richiedono tipicamente un grande volume di campione. Altri metodi utilizzati per quantificare i livelli globali di metilazione del DNA includono la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC). Tuttavia, la HPLC richiede una completa digestione del DNA genomico. Inoltre, il costo proibitativamente elevato di HPLC inGli strumenti limitano l'applicazione più ampia di HPLC.

In questo studio, il DNA genomico (gDNA) è stato estratto da condrociti umani coltivati ​​con un numero variabile di passaggi. Il livello di metilazione del gDNA è stato rilevato utilizzando un test di macchia puntale specifico per la metilazione. In questo approccio dot blot, una miscela di gDNA contenente il DNA metilato da rilevare è stata individuata direttamente su una membrana N + come punto all'interno di un modello di schema circolare precedentemente disegnato. Rispetto ad altri approcci di blotting a base di elettroforesi a base di gel e ad altre procedure di blotting complesse, il metodo dot blot consente di risparmiare tempo significativo. Inoltre, le macchie a punti possono rilevare il livello generale di metilazione del DNA utilizzando un anticorpo a 5 mc commercialmente disponibile. Abbiamo scoperto che il livello di metilazione del DNA differiva tra le sottoculture monolayer e quindi potrebbe svolgere un ruolo fondamentale nella dedifferentiation condrocitica. La macchia a punti da 5 mc è un metodo affidabile, semplice e rapido per rilevare il livello generale di metilazione del DNA da valutareE fenotipo condrocitico.

Introduzione

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L'impianto di condrociti autologo (ACI) è una procedura relativamente nuova e all'avanguardia per curare i difetti della cartilagine articolare 1 , 2 . Uno dei punti cruciali in ACI è l'amplificazione dei condrociti attraverso la coltura monolayer in vitro . Durante l'amplificazione, i condrociti ialini facilmente perdono il loro fenotipo e diventano dedifferenziati, che è indesiderabile per il trattamento ACI 3 , 4 . Per ottimizzare l'esito del trattamento ACI, la dimensione della dedifferentiation dei condrociti dovrebbe essere determinata prima della reimpianto. È indispensabile stabilire un modo economico e rapido per determinare lo status di condrociti. Recentemente, l'associazione tra la metilazione del DNA e la dedifferentiation dei condrociti ha attirato molta attenzione 4 , 5 , 6 . La metilazione del DNA è un processo di whI gruppi metilici vengono aggiunti al DNA, con conseguente conversione di residui di citosina a 5-metilcitosina (5-mC).

Per chiarire la biologia della metilazione del DNA nella dedifferentiation condrocitica, il primo passo è valutare il livello di metilazione del DNA dei condrociti, che finora si è dimostrato difficile. La sequenza genomica bisulfite è la tecnica più utilizzata per analizzare la metilazione del DNA 7 , 8 . In questo saggio, la conversione di bisolfito provoca il degrado del DNA e quindi una quantità sostanziale di campione deve essere fornita per il dosaggio. Inoltre, la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è stata utilizzata per quantificare i livelli di metilazione del DNA a livello mondiale 9 , 10 . Tuttavia, l'analisi HPLC richiede la digestione genomica del DNA. Inoltre, sono necessari strumenti sperimentali avanzati e costosi. Pertanto, oltre al costo elevato, queste procedure sperimentali sono tempi di devastazioneUming. Gli anticorpi anti-5-mC sono ormai diventati commercialmente disponibili, il che ha creato la possibilità di bloccaggio immunitario di DNA genomico contenente 5 mC da genomi complessi.

In questo rapporto, abbiamo estratto il DNA genomico dai condrociti coltivati ​​in una serie di colture monolayer. Abbiamo utilizzato un punteggio di punteggio per valutare il contenuto di 5 mc nei condrociti umani con diversi numeri di passaggi. Abbiamo riscontrato che il contenuto di 5 mC è aumentato in condrociti altamente dedifferenziati rispetto ai condrociti con dedifferentiation a basso grado. Inoltre, abbiamo identificato una relazione tra lo stato di dedifferentiation ei livelli di 5-mc. Infine, abbiamo riportato che le variazioni nel contenuto di 5 mc erano associate al fenotipo condrocitico. Pertanto, il test a blot di punti a 5 mc è un metodo affidabile, semplice e rapido per rilevare il livello di metilazione del DNA nei condrociti.

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Protocollo

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Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico Umano di Shenzhen Second People's Hospital.

1. Raccolta dei tessuti di cartilagine articolare umana e cultura condrocitica

  1. Preparazione dei materiali
    1. Preparare il mezzo modificato Dulbecco's medium di aquila (DMEM) integrato con 10% di siero fetale fetale e 1% di penicillina-streptomicina. Preparare 1 mg / mL collagenasi II, 0,25% trypsin-EDTA, salina fosfata-bufferata (PBS) e un filtro cellulare (40 μm nylon).
  2. Raccolta di tessuti articolari di cartilagine umana
    1. Isolare la cartilagine articolare dalle articolazioni del ginocchio dei pazienti donatori dopo il trauma. Ottenere un consenso informato da tutti i partecipanti.
    2. Tagliare la cartilagine in 1-2 mm 3 pezzi utilizzando un bisturi sterile e digerire condrociti dalla cartilagine macinata con 1 mg / mL collagenasi II in DMEM a 37 ° C per 12-16 h.
    3. Filtra il risultato ottenutoL sospensione attraverso un filtro cellulare (40 μm) e lavare due volte con PBS.
    4. Contare le cellule con un emocitometro e un seme ad una densità di 20.000-30.000 cellule / cm 2 in DMEM completato con 10% di siero fetale fetale (FBS) e 1% di penicillina-streptomicina.
    5. Coltura in un incubatore a 37 ° C.
  3. Espansione monocolore condrocita
    1. Seppellire le cellule sub-confluenti utilizzando 0.25% di trypsin-EDTA e ricaricare a una densità di 6.600 cellule / cm 2 . Cambiare il mezzo due volte alla settimana.
    2. Condurre i condrociti in monostrati per un massimo di sei passaggi e valutare ai passi 1, 2, 3, 4 e 5.

2. Estrazione del DNA genomico (gDNA)

  1. Raccogliere le cellule e risospendere in 500 μl di tampone di lisi (15 mM Tris pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,5% SDS, 200 μg / mL RNasi A) per 10 milioni di cellule. Riposizionare le cellule pipettando e rapida inversione, quindi incubare per 1 h a 37 ° C.
  2. UNDd proteinasi K ad una concentrazione di 160 μg / mL di lisato cellulare e invertire la miscela vigorosamente. Incubare 6 h a 55 ° C.
  3. Aggiungere un volume di Tris pH 7,9 fenolo saturo: cloroformio: isoamilico alcol (25: 24: 1) al campione. Vortice o scuotete il campione manualmente per circa 20 s.
  4. Centrifugare il campione a temperatura ambiente per 5 min a 13.000 × g. Rimuovere la fase acquosa superiore e trasferire lo strato su un tubo fresco.
  5. Estrarre con un uguale volume di cloroformio per rimuovere fenolo e trasferire la fase acquosa superiore in un tubo fresco.
  6. Precipitare il DNA con l'aggiunta di 0,1 campioni di 3 M di acetato di sodio pH 8,0 e 2 volumi di etanolo al 100%.
  7. Conservare il tubo a -20 ° C per la notte per precipitare il gDNA.
  8. Centrifugare il campione a 4 ° C per 10 min a 16.000 xg per gDNA di pellet.
  9. Lavare il campione tre volte con il 70% di etanolo e centrifugare a 4 ° C per 2 minuti a 13.000 x g.
  10. Rimuovere il soprannatanoT con attenzione e poi asciugata all'aria. Resuspendere il DNA in 10 mM Tris pH 8,0, 0,1 mM EDTA.

3. Profilo di metilazione del DNA

  1. Utilizzare un kit di metilazione del DNA per eseguire la reazione di conversione bisolfita usando un totale di 500 ng del DNA genomico, secondo il protocollo del produttore. Eluire in 10 μl di tampone di eluizione (50 ng / μL).
  2. Eseguire la profilazione della metilazione del DNA utilizzando un kit commerciale secondo il protocollo del produttore.

4. Dot Blot Analysis

  1. Denatura il DNA isolato (1 mg per campione) in 0,1 M NaOH per 10 minuti a 95 ° C. Neutralizzare il DNA con 1 M NH 4 OAc su ghiaccio e quindi diluire due volte. Spot 2 μL del DNA genomico diluito seriale su una membrana N + .
  2. Blot la membrana a 80 ° C per 30 min.
  3. Bloccare i siti di legame non specifico dell'anticorpo imbevando la membrana N + nel 5% di BSA in TBS-T per 1 h. Utilizzare un piatto di Petri da 10 cm come reagireIon a temperatura ambiente.
  4. Dopo aver lavato 5 minuti tre volte in TBST, incubare la membrana con un anticorpo monoclonale anti-5-metilcitosina (5-mC) del mouse (1: 1,000) in TBS-T a 4 ° C per una notte.
  5. Lavare la membrana per 5 minuti tre volte in TBS-T e poi incubare con un anticorpo secondario, immunoglobulina IgG (Ig: 1: 5,000) anti-mouse pecore coniugato con HRP in TBS-T per 1 h a temperatura ambiente.
  6. Lavare la membrana per 5 minuti tre volte in TBS-T.
  7. Aggiungere il substrato enzimatico alla membrana e incubare per 5-10 min. Visualizzare il segnale secondario anticorpale usando un kit di chemiluminescenza secondo le istruzioni del produttore.

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Risultati

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I condrociti sono stati coltivati ​​in un monostrato fino al passaggio 6 (P6). I condrociti hanno mostrato progressi fenotipici con passaggi successivi della coltura monolayer. La morfologia dei condrociti P0 era rotonda, mentre le cellule sono diventate altamente schiacciate e appiattite con passaggi successivi fino a P6 ( Figura 1 ). Questo cambiamento morfologico è tipico del processo di dedifferentiation condrocitico. Nel frattempo, i risultati della mappa termica ha...

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Discussione

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La dedifferentiation condrocitica in vitro compromette gravemente l'esito dell'ACI nel trattamento della riparazione di difetti della cartilagine 11 , 12 . Per ottimizzare l'esito ACI, è fondamentale evitare l'uso di condrociti dedifferenziati 13 . Gli studi hanno suggerito che il livello generale di metilazione del DNA è associato all'estensione della dedifferentiation condroscica 4

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: Science Foundation of China (No. 81572198, No. 81260161, No. 81000460); Fondazione della Scienza Naturale della provincia di Guangdong, Cina (No. 2015A030313772); Progetto finanziato dalla Fondazione della scienza postduttorica cinese (n. 2013M530385); La Fondazione di ricerca medica della provincia di Guangdong, Cina (n. A2016314); Shenzhen Science and Technology Projects (No. JCYJ20160301111338144; No. JSGG20151030140325149; No. JSGG20140519105550503; No.GJHZ20130412153906739; No. JCYJ20140414170821160; No.JCYJ20140414170821200).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagenti
DMEMGibco Inc.11965– 092Caldo a 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)HyClone Inc.SH30256.01BD-PBS, privo di Ca2+/Mg2+
FBSGibco Inc.10099-141
0,25% tripsina/EDTAGibco Inc.25200-056
1% Penicillina-StreptomicinaGibco Inc.15140-122
CloroformioMallinckrodt4440
Alcool isoamilicoSigmaI-3643
FenoloGibco BRL15513-039
Proteinasi KGibco BRL24568-2
TAE tampone Bio Whittaker16-011V
Acqua DistillataGibco BRL15230-170
1 M Tris-HClBiosharp Inc.BL514A
Tween20Biotopped Inc.
BSAProliant Inc.68700
Collagenasi, Tipo IISigma-AldrichC6885
[header]
Equipment
HemocytometerISOLAB Inc.075.03.001
Piatto Falcon 100 mmCorning353003
Centrifuga TubeTPP AG91050Centrifuga
ad alta velocitàgamma Eppendorf5804R
ThermoMixerMIULABMTH-100
Incubatore cellulare ad anidride carbonicaThermo scientific3111
sistema di analisi per immagini chimicheUVITEC CambridgeALLIANCE
C58H114O26 sterilizzata a raggi

Riferimenti

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  1. Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med. 331, 889-895 (1994).
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Dot blot per la 5 metilcitosinaSaggio di metilazione del DNAEstrazione di DNA genomicoProcedura di dot blotRilevamento con anticorpo anti 5 mCAnalisi del fenotipo dei condrocitiTrapianto autologo di condrocitiMetodo di denaturazione del DNARilevamento per chemiluminescenza

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