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Articolo metodologico

Metodi per classificare i foci citoplasmatici come granuli di stress di mammiferi

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DOI:

10.3791/55656

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12 maggio 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Rheumatology, Immunology, and Allergy, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School, 3Department of Histology and Embryology, Poznan University of Medical Sciences, 4The Broad Institute of Harvard and M.I.T.

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Granuli di stress (SG) sono strutture citoplasmatiche non membrane che si formano in cellule esposte a varie sollecitazioni. Gli SG contengono mRNA, proteine ​​legate all'RNA, piccole subunità ribosomali, fattori correlati alla traduzione e varie proteine ​​di segnalazione cellulare. Questo protocollo descrive un flusso di lavoro che utilizza diversi approcci sperimentali per rilevare, caratterizzare e quantificare SG in buona fede .

Abstract

Le cellule sono spesso sfidate da improvvisi cambiamenti ambientali. I granuli di stress (SG), i complessi ribonucleoprotein citoplasmatici che si formano nelle cellule esposti a condizioni di stress, sono implicati in vari aspetti del metabolismo cellulare e della sopravvivenza. Gli SG modulano i percorsi di segnalazione cellulare, l'espressione genica post-trascrizionale e programmi di risposta allo stress. La formazione di questi granuli contenenti mRNA è direttamente connessa alla traduzione cellulare. L'assemblea SG viene attivata dall'iniziazione inibita della traduzione e lo smontaggio SG viene promosso tramite l'attivazione della traduzione o l'inibizione dell'allungamento della traduzione. Questa relazione è ulteriormente evidenziata dalla composizione SG. I componenti del core SG sono bloccati da complessi di pre-iniezione di traduzione, mRNA e proteine ​​RNA-binding (RBPs) selezionate. Lo scopo dell'assemblea SG è quello di risparmiare energia cellulare sequestrando i mRNA di manutenzione in fase di transazionalizzazione, permettendo una migliore traduzione delle proteine ​​sensibili allo stress. In additiSui componenti del nucleo, come i complessi di preiniziation della traduzione stallo, gli SG contengono una pletora di altre proteine ​​e molecole di segnalazione. I difetti nella formazione di SG possono compromettere l'adattamento cellulare allo stress e possono quindi promuovere la morte cellulare. SG e simili granuli contenenti RNA sono stati legati a una serie di malattie umane, compresi i disturbi neurodegenerativi e il cancro, portando al recente interesse per la classificazione e la definizione di sottotipi di granuli RNA. Questo protocollo descrive i dosaggi per caratterizzare e quantificare SG di mammiferi.

Introduzione

Le cellule impiegano molti meccanismi per rispondere allo stress. Alcune risposte si verificano al livello post-trascrizionale e riguardano la regolazione della traduzione e / o della stabilità del mRNA 1 , 2 . L'arresto e il degrado della traslazione mRNA modulati da stress sono associati alla formazione di focolai cellulari specifici non embrionali, il più caratteristico come Granuli di Stress (SG) 3 . Gli SG sono foci citoplasmatiche che concentrano mRNP non tradizionali in cellule arrestate a traslazione che rispondono allo stress ( ad esempio, ossidazione, shock termico, fame nutrizionale e infezione virale). Oltre ai mRNA non tradizionali, SG contengono fattori di inizio della traduzione, proteine ​​legate all'RNA e varie proteine ​​di segnalazione 5 . Gli SG sono biomarcatori di inibizione della proteina e alterazione del metabolismo RNA e sono stati legati alla sopravvivenza cellulare e all'apoptosi, il percorso di segnalazioneE dei processi nucleari 5 .

SG sono entità dinamica e la loro formazione è strettamente legata allo stato della traduzione cellulare 6 . Nonostante il loro aspetto apparentemente solido, la maggior parte dei componenti della proteina SG rapidamente navetta in e fuori, con un tempo di permanenza di secondi. Mentre SG persistono per minuti ad ore, la maggior parte dei loro componenti sono in flusso rapido. L'inibizione dell'iniziazione di traduzione e il conseguente smontaggio dei polisomi di traduzione favoriscono la formazione di SG; Quindi, gli SG sono in equilibrio con i polisomi di traduzione. Questo equilibrio di polysome / SG è la chiave per distinguere gli SG in buona fede da altri foci indotti da stress 6 , 7 .

L'arresto dell'iniziativa di traduzione comporta la conversione di complessi di pre-iniziazione competenti per la traduzione che contengono mRNA, fattori di inizio della traduzione (eIF) e subunità ribosomali 40S O cosiddetti complessi 48S) in complessi stallati a traslazione (cosiddetti complessi 48S *) che possono coalesciare in SG 4 , 6 . Gli SG vengono promossi con arresto traslazionale a due diverse fasi a monte della formazione di complessi 48S: interferenza con le funzioni del complesso di eIF4F legato al cappuccio ( ad es. Targeting della sua sottosistema eIF4A) o fosforilazione della subunità α del fattore di inizio della traduzione eIF2 mediata da una O più delle quattro chinasi eIF2. La presenza di complessi 48S in stallo ( es. Subunità ribosomali 40S e fattori di inizio di traduzione selezionati) è un segno distintivo di SG 8 , 9 .

Gli SG sono stati collegati a vari stati patologici, quali infezioni virali, neurodegenerazione, autoimmunità e cancro 3 , 10 , 11 ,Ss = "xref"> 12 , 13 . Le forme mutate di diversi componenti SG sono associate a malattie neurodegenerative ( es. Sclerosi laterale amyotrofica) in cui i neuroni presentano inclusioni patologiche intracellulari che possono svolgere ruoli attivi nella morte neuronale 13 . Alcuni virus intaccano i componenti SG per inibire la formazione di SG e migliorare la replica virale 14 . Recenti studi anche collegano SG al cancro 15 e alla sopravvivenza delle cellule tumorali in trattamenti chimico e radioterapico 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Mentre tali risultati hanno stimolato grande interesse per la biologia SG, molte delle relazioni pubblicate non dispongono di controlli importanti per distinguere la formazione di SG in buona fede da altri foci indotti da stress.

Le SG sono state inizialmente descritte come foci citoplasmatiche non membrane composte da proteine ​​legate alla mRNA (RBPs), incluse l'antigene ntracellulare 1 T-cellula (TIA-1) e la proteina legante Poly-A (PABP); Fattori di inizio della traduzione; MRNA poliadenilato; E piccole sottopelle ribosomali 4 , 6 , 21 , 22 . Tradizionalmente, la loro composizione è stata determinata da tecniche come l'immunostaining e l'espressione ectopic of protein fluorescently tagged 23 , 24 . A causa della loro natura altamente dinamica, l'immunolocalizzazione di proteine ​​SG e / o mRNA rimane la metodologia di definizione per la rilevazione degli SG 23 , 24 . Ad oggi, molti RBP e altre proteine ​​(oltre 120 proteine ​​distinte) sono descritte come componenti SG 11 . Come molti SLe proteine ​​localizzate da G modificano la loro localizzazione in modo stressato e indipendente e possono accumularsi in altri compartimenti e foci intracellulari, è importante scegliere corretti marcatori SG e utilizzare criteri funzionali per distinguere gli SG da altri tipi di stress indotti foci. Gli SG in buona fede contengono mRNA, fattori di inizio della traduzione e piccole subunità ribosomali e sono in equilibrio dinamico con la traduzione.

Questo semplice flusso di lavoro è progettato per determinare se i foci indotti da stress sono SG in buona fede . Questo flusso di lavoro comprende diversi approcci sperimentali che utilizzano le cellule U2OS, le cellule comunemente utilizzate per studiare SG. Queste cellule sono ideali, in quanto presentano un grande citoplasma, sono relativamente piatti e si attaccano fortemente ai vetrini di vetro. Altri tipi di cellule possono essere utilizzati per studiare SG, ma è importante essere consapevoli che le differenze di temporizzazione, concentrazione di farmaci e abbondanza delle proteine ​​nucleanti SG possono alterare la cinetica e il composizione. Inoltre, alcune cellule rispondono alla fissazione della paraformaldeide, formando delle bolle di superficie delle cellule, dando così un aspetto arruffato che provoca la localizzazione punctata di alcuni marcatori SG; Senza analisi accurata, queste possono essere classificate in modo errato come SG. Ciò evidenzia la necessità di valutare tutti i criteri necessari per identificare i focolai indotti da stress come SG in buona fede . Vinorelbina (VRB), un terapeutico per il cancro che promuove SGs 20 , come pure Sodium Arsenite (SA), un robusto e ben caratterizzato induttore SG, sono utilizzati come sollecitazioni per gli esperimenti in questo protocollo.

Canonical SG contengono più marcatori SG (sia proteine ​​che mRNA) che colocalizzano nei focoli citoplasmatici. Questo protocollo utilizza sia l'immunofluorescenza che l'ibridazione in fluorescenza in situ (FISH) per rilevare la localizzazione di marcatori proteici e rispettivamente di mRNA 22 poliadenilati. In breve, l'immunofluorescenza indiretta usa anticorpi (ad es .e. Anticorpi primari) specifici per una determinata proteina per rilevarla all'interno della cellula. Quindi, gli anticorpi secondari (generalmente specie-specifici) legati ai fluorocromi riconoscono l'anticorpo primario e rivelano la localizzazione della proteina bersaglio. La microscopia fluorescente viene usata per rilevare il segnale localizzato all'interno della cella. Utilizzando anticorpi prodotti in diverse specie e rilevandoli con anticorpi secondari colorati diversamente consentiti, è possibile rilevare la colocalizzazione di anticorpi multipli, indicando che i loro bersagli proteici si trovano nella stessa posizione 23 . È importante selezionare marcatori che sono stati verificati per colocalizzare a SG in buona fede .

FISH utilizza una sonda etichetta che accoppia le basi di una specifica sequenza di RNA o DNA 25 . Per rilevare l'mRNA, questo protocollo utilizza una sonda oligo (dT) 40 biotinilata che ibridizza (o le coppie di base) alla coda poliA di mRNA ( cioè poliA FISH). La sonda biotinilata viene quindi rilevata usando streptavidina fluorescente coniugata, poiché streptavidina ha un'elevata affinità per la biotina. Nel valutare SG, è importante associare poliA FISH con immunofluorescenza che rileva un marker SG, come nelle SG in buona fede , i due segnali dovrebbero essere colocalizzati.

Utilizzando questo protocollo, la colocalizzazione viene valutata in più modi. In un'immagine multi-canale ( ossia RGB: rosso, verde e blu), la colocalizzazione modifica il colore del segnale sovrapposto ( ad esempio, rosso e verde colocalizzati appaiono gialli) 23 . Inoltre, la colocalizzazione viene quantificata graficamente utilizzando l'analisi della linea di scansione, dove l'intensità di ciascuno dei colori viene misurata su una determinata linea 8 , 20 . Questo protocollo descrive due procedure di analisi di scansione linee usando ImageJ 26 . Una procedura è manuale e passa attraverso l'intero processo, whiL'altro utilizza una macro o un semplice programma che automatizza i passaggi manuali. È importante passare attraverso il programma manuale per comprendere la procedura macro.

Le SG si formano in cellule in cui la traduzione viene repressa; Quindi, le cellule con SG dovrebbero visualizzare livelli di traduzione più bassi rispetto alle cellule non trattate. Esperimentalmente, è utilizzata la ribopuromicilazione. La puromicina e l'emetina vengono aggiunti alle cellule per una breve durata prima della fissazione, permettendo alla puromicina di incorporarsi in polipeptidi attivi, causando la terminazione 27 , 28 . Il trattamento con emetina è necessario per impedire la riapertura 29 . Puromicina può essere rilevata usando anticorpi anti-puromicina, fornendo una istantanea di traduzione attiva. Questo metodo viene utilizzato perché è veloce, non richiede pre-affamando con un mezzo privo di un particolare aminoacido (e potenzialmente prevenendo le cellule), e rivela ilLocalizzazione subcellulare della traduzione di proteine. Altri metodi, in particolare utilizzando analoghi aminoacidi modificati, come l'analogica metionina L-azidohomoalaina (AHA), accoppiati con la chimica "click-it" 30 , sono stati utilizzati per dimostrare che le cellule contenenti SG presentano una traduzione molto più bassa delle cellule vicine 31 . Tuttavia, questa tecnica richiede la fame di metionina seguita da un impulso per 15-30 minuti. La fame di metionina costituisce un ulteriore stress, mentre il lungo tempo di etichettatura ( cioè 15-30 minuti) determina la misurazione della traduzione cumulativa piuttosto che continua e consente anche alle proteine ​​appena sintetizzate di passare dal loro sito di sintesi alla loro destinazione finale all'interno della cellula. Al contrario, la ribopuromicilazione è molto più veloce ed è compatibile con qualsiasi mezzo, come il mezzo privo di glucosio usato per indurre gli SG attraverso la fame di glucosio.

Canonical SGs sono in equilibrio dinamicoCon attivamente traducendo polisomi. Questo può essere valutato sperimentalmente trattando campioni con i farmaci che stabilizzano o destabilizzano i polisomi, ribaltando così l'equilibrio tra SG e polisomi 23 . Cycloheximide (o emetina, che si comporta in modo analogo) blocca l'allungamento da ribosomi "congelando" su mRNA, diminuendo così la massa di mRNP non polisomali disponibili in grado di formare SG. Sperimentalmente, questo può essere utilizzato in due modi: aggiungendo cycloheximide (o emetina) prima di stress per prevenire la formazione di SG o aggiungendo cycloheximide (o emetina) dopo gli SGs sono formate, anche senza rimuovere l'agente di sollecitazione, causando lo smontaggio SG, come stallo I complessi di preiniziamento vengono assunti lentamente nella frazione di polisomi. Al contrario, la puromicina provoca terminazioni premature e favorisce il disassemblaggio dei polisomi, aumentando la quantità di mRNA innescante in grado di assemblare in SG. Sperimentalmente, il trattamento con puromicina aumenta il numero di SG o abbassa il thresholD alla quale formano in risposta allo stress o al dosaggio della droga. Nella valutazione dell'effetto della puromicina è importante utilizzare un livello sub-maximal del farmaco interessato, in quanto la puromicina dovrebbe aumentare l'effetto del farmaco e aumentare il percentuale delle cellule che visualizzano SG - questo non può verificarsi se il farmaco / Stress causa SG nel 100% delle cellule inizialmente. Ciò è in contrasto con il trattamento cicloesimide, che smonta SG e funziona meglio quando ~ 95% delle celle visualizzano inizialmente SGs in modo che la più grande diminuzione possibile possa essere osservata e quantificata accuratamente.

Questo protocollo fornisce un quadro per studiare SG in cellule di mammiferi. I metodi comprendono: (1) colorazione immunofluorescenti e analisi ImageJ per valutare la colocalizzazione nei classici SG associati eIF4G, eIF3b e proteina legante proteina-attivante Ras GTPase (G3BP1) nei SG supposti; (2) oligo (dT) fluorescenza in ibridazione in situ (polyA FISH) per rilevare mRNA poliadenilata; (3) cicloesimide e puromicina per determinare se i foci indotti da stress sono in equilibrio dinamico con i polisomi; E (4) la ribopuromicilazione per valutare lo stato di traslazione delle cellule contenenti SG supposti. Insieme, questi dosaggi possono determinare se i foci indotti da stress possono essere classificati come SG in buona fede .

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Protocollo

1. Preparazione delle cellule

  1. Aggiungere coperchi autoclavati a 12 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, come indicato in figura 1A ; Questo può essere fatto usando una pipetta sterile Pasteur attaccata ad un vuoto per raccogliere ciascuna copertina. Toccare delicatamente la copertura sul lato del pozzetto per rilasciare l'aspirazione, lasciando cadere la copertura nel pozzetto.
  2. Piastra 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) le cellule di osteosarcoma per pozzetto ad un volume finale di 500 μL di mezzo. Spostare il lato piastra a lato e su e giù diverse volte per assicurare che le celle siano distribuite uniformemente.
  3. Premere delicatamente le copertine con una punta pulita P1000 per assicurarsi che la copertura sia sul fondo del pozzetto e che non ci siano bolle sotto la copertura.

2. Stressing Cells

  1. Il giorno successivo, controllare visivamente la piastra per assicurare che le celle siano disperse uniformemente e uniformemente confluenti attraverso il coperchio, come varianti tra saI mples possono avere un impatto negativo sulla riproducibilità dei risultati. Utilizzare un obiettivo 10x su un microscopio in tessuto di cultura invertito.
  2. Preriscaldare il mezzo a 37 ° C. Evitare l'applicazione di freddo o caldo nelle cellule, in quanto causano rispettivamente urti di calore o scosse di calore.
  3. Diluire le droghe nei mezzi preriscaldati. Per ogni diversa concentrazione di farmaci, preparare 2 pozzetti contenenti 500 μl di mezzo. Preparare un ulteriore 500 μL per consentire la perdita durante la pipettazione. Aliquot 4 tubi, ciascuno contenente 1,5 mL.
    1. Per l'arsenito di sodio: ad ogni pozzetto contenente 500 μL, aggiungere 1,5 μL di 100 mM sodio arsenito (concentrazione finale: 100 μM) o aggiungere 0,75 μL di 100 mM sodio arsenito (concentrazione finale: 50 μM).
    2. Per vinorelbina: ad ogni pozzetto contenente 500 μL, aggiungere 22,5 μL di 10 mM vinorelbina (concentrazione finale 150 μM) o aggiungere 18,75 μL di 10 mM vinorelbina (concentrazione finale: 100 μM).
      NOTA: Arsenito di sodio È un induttore di granuli di sollecitazione ben caratterizzato e comunemente usato e viene quindi utilizzato classico come un controllo positivo.
  4. Rimuovere e scartare i supporti dai pozzetti B1-4 e C1 - 4. Aggiungere i supporti con i farmaci e attendere 60 minuti (figura 1A).
    1. Aggiungere 500 μl di media con 100 μM di sodio arsenito ai pozzetti B1 e B2. Aggiungere 500 μL di media con 50 μM di sodio arsenito nei pozzetti B3 e B4.
    2. Aggiungere 500 μL di mezzo con 150 μM vinorelbina ai pozzetti C1 e C2. Aggiungere 500 μl di mezzo con 125 μM vinorelbina ai pozzetti C3 e C4.
  5. 30 minuti prima della fissazione, trattate i pozzetti della colonna 2 con 5 μL di cicloesimide (1 mg / ml di scorta) ei pozzetti nella colonna 4 con 2 μL di puromicina (1,25 mg / ml di scorta). Rasatura delicatamente la lastra per mescolare prima di posizionare la piastra nel 37 ° C incubatore.

3. Fissazione cellulare e immunofluorescenza

NOTA: Prima dell'esperimento, accertarsi che il metanolo sia raffreddato a -20 ° C. Fare buchi, compreso il salino fosforato-tamponato (PBS), il 5% di cavallo normale (NHS) in PBS e 4% di paraformaldeide (PFA ) In PBS.

  1. Scartare i supporti e lavare i pozzetti contenenti coverlips con PBS. A seconda dei farmaci utilizzati, potrebbe essere importante scartare correttamente i supporti contenenti farmaci; Contattare l'ufficio locale per la sicurezza ambientale per istruzioni specifiche. Per lavare in modo efficace, riempire una bottiglia di compressione con PBS, tagliare indietro la punta per consentire un flusso leggero piuttosto che un flusso stretto e utilizzare questo per aggiungere PBS a ciascun pozzetto dopo aspirare l'originale PBS.
  2. Fissare le cellule utilizzando ~ 250 μL di PFA al 4% per 15 minuti a RT sotto agitazione leggera. Completamente coprire la parte superiore del coperchio con PFA; Basta avere 250 μL, ma se no, aggiungere di più. Evitare sempre di pipettare direttamente sui coperchietti, poiché alcune cellule (o trattamenti di stress delle cellule) possono alterare l'attaccamento e tForza dalla pipetta può spogliare le cellule.
  3. Rimuovere il PFA e scartare correttamente. Rivolgersi all'ufficio locale per la sicurezza ambientale per dettagli su come eliminare correttamente la paraformaldeide.
  4. Aggiungere ~ 250 μl di metanolo (-20 ° C) e incubare per 5 minuti a RT sotto un leggero dondolo; Questo permeabilizza e appiattisce le cellule.
  5. Rimuovere e scartare il metanolo e bloccare le cellule applicando ~ 250 μL di 5% NHS per 1 h a RT O / N a 4 ° C. Rivolgersi all'ufficio locale per la sicurezza ambientale per dettagli su come eliminare correttamente il metanolo.
  6. Per gli anticorpi primari, diluire gli anticorpi nel 5% NHS.
    NOTA: L'uso di più marcatori SG è fondamentale per confermare se i granuli osservati sono SG in buona fede . Il numero di marcatori SG che possono essere utilizzati dipende dai filtri disponibili nel microscopio. Se sono disponibili standard set di filtri verde, rosso e rosso, utilizzare G3BP1, eIF4G e eIF3b con una diluizione di 1/250.
    1. Per questo esperimento (12 coperti a 250 μL ciascuno: 3 ml di NHS 5%), aggiungere 12 μL di ciascuno dei seguenti: anti-G3BP1, anti-eIF3b e anti-eIF4G. Incubare gli anticorpi primari con agitazione leggera per almeno 1 h a RT o O / N a 4 ° C.
  7. Lavare i pozzetti 3x con PBS e incubare ogni lavaggio per 5 minuti.
  8. Per gli anticorpi secondari, diluire tutti gli anticorpi secondari (1/250 diluizione) e Hoechst colorante (1/1000 diluizione) nel 5% NHS.
    1. Per questo esperimento (12 coperti a 250 μL ciascuno: 3 ml di NHS 5%), aggiungere 12 μL di ciascuno dei seguenti fattori: Cy2-Mouse, Cy3-Rabbit e Cy5-Goat (una diluizione di 1/250 di ciascuno ) E aggiungere 3 μl di colorante Hoechst.
    2. Incubare le copertine con gli anticorpi secondari per 1 h a RT. Durante questo e nei passaggi seguenti, proteggere i campioni dalla luce coprendo la piastra con una scatola o collocando la pellicola sulla parte superiore del piatto di coltura tissutale.
  9. Lavare noiTre volte con PBS per 5 minuti ciascuno.
  10. Montare le copertine su vetrini etichettati utilizzando il supporto di montaggio. Riscaldare il supporto di montaggio in un blocco termico di 37 ° C per 10 min; Questo riduce la viscosità e rende più facile la pipetta. Con una punta tagliata P200, pipettare 25 μL di supporto di montaggio per coperchio su una lastra di vetro; Le copertine 4-8 possono essere montate su una lastra di vetro, supponendo che lo stadio microscopico lo consente. Utilizzando delle pinze fine, trasferire la copertura dal pozzetto allo scivolo, assicurandosi di mettere il lato della cella sul supporto di montaggio. Utilizzando una punta pulita P200, premere il coperchio verso il basso.
  11. Una volta che tutti i coperchi sono stati montati, utilizzare un tessuto di laboratorio piegato per ripulire il mezzo di montaggio in eccesso premendo in modo molto saldamente il tessuto del laboratorio sullo scivolo. Usare una bottiglia di spremitura contenente H 2 O per sciacquare l'eccesso di supporto di montaggio e ripetere il blotting con un tessuto di laboratorio piegato per rimuovere l'acqua.

4. Fluorescenza in situ </ Em> ibridazione (FISH)

  1. Piastra e trattare le celle, utilizzando i passaggi 1 e 2.1-4 come guida; È necessario solo piegare le celle nella colonna 1, poiché sono necessarie solo 3 copertine nel seguente esperimento.
  2. Assicurarsi che tutti i tamponi siano preparati ( cioè 4% PFA in PBS, 70% etanolo in acqua, 2x Salina-Sodio-Citrato (SSC) e 5% NHS), che il metanolo viene raffreddato a -20 ° C Il forno di ibridazione viene riscaldato fino alla temperatura appropriata.
  3. Eseguire i punti 3.1-3.3 per lavare e fissare le celle.
  4. Permeabilizzare le cellule aggiungendo -20 ° C di metanolo per 10 min.
  5. Rimuovere il metanolo e incubare le copertine in etanolo al 70%. Posizionare la piastra a 4 ° C per una notte. Sigillare la piastra con il parafilm per evitare l'evaporazione.
  6. Il giorno seguente, rimuovere l'etanolo e reidratare le cellule aggiungendo 500 μL di 2x SSC. Incubare le copertine per 5 minuti con agitazione leggera a RT.
  7. Rimuovere il 2x SSC e aggiungere 500ΜL di 2X SSC. Incubare per 5 minuti con agitazione leggera.
  8. Posizionare un pezzo di parafilm sul fondo del forno di ibridazione. Pipettare 25 μl di tampone di ibridazione sul parafilm per ogni copertina. Rimuovere la copertura dal piatto da 24 pozzetti (a questo punto, le copertine sono rivolte verso l'alto a cella) e posizionare il coperchio con il lato della cella sul blocco di ibridazione. Fate questo a 42 ° C o, eventualmente, a 65 ° C per 15 minuti.
    NOTA: Completare questa fase a 65 ° C denota RNA cellulari; Questo può migliorare il segnale se la poliA è mascherata da interazioni con le proteine.
  9. Diluire la sonda Biotin-Oligo (dT) (100 ng / μL) in tampone di ibridazione a una concentrazione di 2 ng / μL; È sufficiente 25 μL per coperchio.
  10. Per ogni coperchio, pipettare 25 μl di tampone di ibridazione contenente Biotin-Oligo (dT) sul parafilm. Sollevare la copertura con le pinze e toccare delicatamente il bordo del coperchio su un tessuto di laboratorio per rimuovere l'eccessoTampone di ibridazione. Trasferire la copertina al buffer di ibridazione con Biotin-Oligo (dT); Ricorda di tenere il lato della cella verso il basso.
  11. Posizionare le copertine in una scatola di ibridazione per limitare l'evaporazione. Incubare le copertine con Biotin-Oligo (dT) in tampone di ibridazione per 60 min a 42 ° C.
  12. Posizionare 2x SSC nel forno di ibridazione per consentirgli di equilibrare a 42 ° C.
  13. Aggiungere ~ 500 μL di 2x SSC riscaldato ai pozzetti nel piatto da 24 pozzetti e usare pinze per trasferire le copertine al pozzetto. Incubare per 10 min.
  14. Ripetere due volte la fase di lavaggio a 42 ° C e poi due volte a RT.
  15. Completare i passaggi 3.5-3.10, assicurandosi di utilizzare uno streptavidina fluorochrome per rilevare la Biotin-Oligo (dT) anziché un anticorpo convenzionale.

5. Analisi della ribopuromicilazione per valutare lo stato di transizione

  1. Le celle U2OS delle piastre sui coperchi, come indicato nel passaggio 1, ma solo una piastra di copertura per condizione (in questoCaso, 3 copertine: non trattato, 100 μM di sodio arsenito e 150 μM di vinorelbina) ( Figura 1 A).
  2. Le cellule di stress utilizzano il protocollo nel passaggio 2, completando i passaggi 2.1-2.4.
  3. 5 minuti prima della fissazione, aggiungere 2 μL di puromicina (azione: 1,25 mg / ml, diluire 2 μL in 500 μl per ottenere una concentrazione finale di puromicina di 5 μg / ml) e 2,9 μl di emetina (azione: 20 μg / ml; 2,9 μL alla stessa soluzione già contenente la puromicina) ad ogni pozzetto contenente 0,5 mL.
  4. Completare i punti 3.1-3.10 come sopra indicato, utilizzando un anticorpo anti-puromicina (1/1000 diluizione) per rilevare puromicina. Idealmente, utilizzare altri due marcatori SG nei rimanenti canali.
  5. Quando si quantifica il segnale puromicina, prendere tutte le immagini usando la stessa esposizione. Scegli questa esposizione usando il campione più luminoso (non stressato) e prendendo un'immagine il più luminosa possibile senza saturazione.
    NOTA: L'intensità del segnale fluorescente anti-puromicina represLa traduzione in corso, come sostituti di puromicina per un aminoacido, incorpora nella proteina nascente e impone la terminazione prematura della proteina.

6. Acquisizione e analisi di immagini

  1. Quantificare i granuli di stress
    1. Per quantificare gli SG, acquisite 3 - 5 immagini in totale> 100 celle per campione utilizzando un obiettivo 40X. In alternativa, acquisite immagini utilizzando altri obiettivi, ma assicurati che> 100 celle vengono contate per copertina e che l'ingrandimento sia abbastanza grande per visualizzare chiaramente i granuli. Fare questo dividendo la copertina in cinque regioni ugualmente uguali e selezionando casualmente un campo da ciascuna regione ( Figura 1B ); Le immagini dello stesso campo dovrebbero includere tutti i canali per valutare la colocalizzazione dei marcatori.
    2. Una volta acquisite tutte le immagini, unire i canali. Alcuni software della fotocamera faranno automaticamente questo, mentre altri richiedono unione manuale; Questo può essere fatto conImageJ aprendo tutte le immagini e selezionando [Immagine | Colore | Merge Channels].
    3. Contare manualmente il numero totale di celle contando il numero di nuclei, utilizzando Hoechst come marcatore del nucleo. Contare manualmente il numero di celle che contengono più di due SG per cella.
      NOTA: Ad esempio, utilizzando un canale sincrono a tre canali visualizzando G3BP1 (verde), eIF4G (rosso) e Hoechst (blu), conteggi i nuclei (o il numero di celle) utilizzando il canale blu. Quindi, contate le cellule SG-positive come quelle con due o più foci gialli per cella. I granuli appariranno gialli, come verdi da G3BP1 e rossi da eIF4G appaiono gialli se colocalizzati.
    4. Determinare la percentuale di cellule che sono SG positivi combinando i dati dalle 3-5 regioni indipendenti e quindi calcolare:
      Numero di SG positivo / numero di nuclei) * 100 = percentuale di cellule SG-positive
  2. Valutazione della colocalizzazione mediante analisi di scansione lineare - Metodo manuale
    1. ApertoImageJ. Scarica gratuitamente da ()
    2. Aprire il gestore ROI: [Analizza | Strumenti | Responsabile ROI ...].
    3. Aprire l'immagine incorporata in ImageJ: [File | Aperto].
    4. Utilizzando lo strumento di linea situato nella barra degli strumenti ImageJ, aggiungere una riga che passa attraverso un SG, assicurandosi di includere prima e dopo l'SG. Aggiungere questa riga al gestore ROI facendo clic su [Aggiungi] nella finestra del gestore ROI.
    5. Distribuire l'immagine fusa in canali separati per valutare la localizzazione di ciascun marcatore al granulo: [Image | Colore | Split Channel]; Questo divide l'immagine fusa in tre immagini in bianco e nero.
    6. Nell'immagine in bianco e nero, assicurarsi che la linea sia selezionata; La riga viene selezionata se appare nell'immagine. In caso contrario, nella finestra di gestione ROI, fare clic sulla riga nel pannello; Questo evidenzia la linea in blu nella finestra del gestore ROI e renderà visibile la riga sull'immagine in bianco e nero. Se la riga non viene ancora visualizzata, assicurarsi che "mostra tutto" sia chEcked nel gestore ROI e quindi clicca sulla riga nell'immagine.
    7. Analizza l'intensità della riga: [Analizza | Profilo di trama]; Questo porterà la finestra "Plot Profile", che traccia l'intensità del segnale in tutta la linea.
    8. All'interno della finestra "Plot Profile", fare clic su [Elenco], che visualizza una finestra contenente i dati grezzi dal grafico. Copia tutti i dati in questa finestra e incollalo in un file di foglio di calcolo. A tale scopo, selezionare tutti i dati nella finestra: [Modifica | Seleziona tutto]. Copiare la data: [Edit | Copia]. Aprire un file di foglio di calcolo e incollare i dati: [Modifica | Incolla].
    9. Completare i passaggi 6.2.6 - 6.2.8 per ciascun canale separatamente. Assicuratevi di tenere traccia del canale da valutare.
    10. In un foglio di calcolo, generare un grafico a linea dei risultati. Selezionare le colonne che includono i dati premendo [control] e facendo clic sulla lettera in alto a ogni colonna. Quindi, selezionare il grafico di linea: [Inserisci | Grafico a linee].
    11. Ripeti questa analisi per il multGranuli di stress su più esperimenti indipendenti.
  3. Valutazione della colocalizzazione mediante analisi di scansione lineare - Plugin ImageJ
    1. Scaricare e installare lo strumento del profilo RGB dal sito Web ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/macros/tools/RGBProfilesTool.txt); Quando correttamente installato, un'icona rossa, verde e blu (RGB) dovrebbe essere visualizzata sulla barra degli strumenti.
    2. Apri l'immagine ( ad esempio, Tiff, JPG) in ImageJ: [File | Aperto].
    3. Fare clic sull'icona RGB situata nella barra degli strumenti ImageJ.
    4. Fare clic e trascinare per aggiungere una riga che si estende attraverso un SG, assicurandosi di includere regioni adiacenti; Un'immagine dell'istogramma verrà visualizzata in una finestra pop-up.
    5. Salvare i dati come un'immagine: [File | Salva come | Tiff]. In alternativa, esportare e poi tracciare i dati in un altro programma di grafica utilizzando il passo 6.2.8 dall'alto.

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Risultati

I focolai indotti da stress non sono necessariamente SG. Gli SG sono classificati come foci citoplasmatici che contengono mRNA, fattori di inizio della traduzione e proteine ​​legate all'RNA e sono in equilibrio con la traduzione attiva. Il protocollo di cui sopra può essere utilizzato come un modello per caratterizzare se una determinata tensione induca SG in buona fede .

SGs colocalizzano con altri marcatori SG ...

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Discussione

Come evidenziato da studi immunohistologici in molteplici malattie, lo stress cronico porta alla formazione di differenti foci intracellulari. Ad esempio, la maggior parte delle malattie neurodegenerative sono caratterizzate da aggregati intracellulari di proteine ​​insolubili. La presenza di proteine ​​associate a SG in tali aggregati è spesso la base per concludere che tali foci sono SG. Una simile conclusione è anche tracciata quando si osservano foci citoplasmatiche positiva-SG in cellule trattate con nuovi stimoli ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i membri dei laboratori Ivanov e Anderson per la loro utile discussione e feedback su questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dagli Istituti Nazionali di Salute [GM111700 e CA168872 a PA, NS094918 a PI], il National Science Center in Polonia [concedere UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 a WS]. WS riconosce inoltre il Ministero della Scienza e dell'Istruzione Superiore in Polonia (Programma Mobility Plus) e la Commissione Polacca-Americana Fulbright per il loro sostegno finanziario alla sua ricerca negli Stati Uniti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
U-2 OSATCC ATCC® HTB-96&commercio;Comunemente scritto "U2OS"
Cultura a 37 anni ° C inferiore al 5% di CO2 in 10% FBS/DMEM
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Corning10-013-CVContiene 4,5 g/L di glucosio, piruvato e rosso fenolo
Integrato con il 10% di FBS, 10 mM di HEPES e penicillina/steptomicina
Preriscaldare la precedente diluizione del/i farmaco/i
Siero fetale bovino (FBS)SigmaF2442-500mlUtilizzato per integrare il terreno
HEPES (1 M)Thermo Fisher Scientific15630-080Utilizzato per integrare
streptomicina penicillinaSigmaP0781-100mlUtilizzato per integrare la piastra a
24 pozzettiCostar3524
tessuti da laboratorio (kimwipes)KIMTECH SCIENCE34120
Coverglass per occhiali di copertura per la crescitaFisher Scientific12-545-82Autoclavato prima dell'uso
Conservare sterile nella cappa di coltura tissutale
(meta)arsenito di sodio ≥ 90% (SA)SigmaS7400-100GSciogliere in acqua a una concentrazione di 1 M, quindi diluire a 100 &; micro; M come materiale di lavoro
Vinorelbina (VRB)TSZ CHEMRS055Sciogliere in acqua a 10 mM
PuromicinaSigmaP9620Utilizzato per valutare il livello di traduzione (ribofrenomilazione)
-Utilizzato per valutare la connessione SG con traduzione attiva
Diluire in acqua a 10 mg/mL
emetina dicloridrato idratoSigmaE2375Utilizzato in combinazione con puromicina per valutare il livello generale di traduzione
Utilizzato per valutare la connessione SG con traduzione attiva
-Diluire in acqua a 10 mg/mL
Cicloesimide (CHX)SigmaC4859Utilizzato per valutare la connessione SG con traduzione attiva
Diluire in acqua a 10 mg/mL
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Lonza / VWR95042-486Tampone di lavaggio per immunofluorescenza
Reagente di paraformaldeide, cristallino (PFA)SigmaP6148-500GPreparare una soluzione al 4% in PBS caldo in cappa aspirante, agitare fino a dissoluzione
Le aliquote possono essere conservate a -20 ° C per diversi mesi
Pericoloso, utilizzare la ventilazione
Gettare nei rifiuti speciali
Metanolo, ACSBDH / VWRBDH1135-4LPPreraffreddare a -20 ° C prima dell'uso
Gettare nei rifiuti speciali
Normal Horse Serum (NHS)Thermo Fisher Scientific31874Diluire al 5% in PBS
Aggiungere sodio azide per la conservazione a 4 gradi; C
Soluzione bloccante per immunofluorescenza
Etanolo, puro, 200 Proof (100%),USP, KOPTECDecon Labs / VWR89125-188Diluire al 70% con acqua
Fisherbrand Superfrost Plus Vetrini per microscopio Fisherbrand12-550-15
topo anti anticorpo G3BP1 (TT-Y)Santa Cruzsc-81940Conservare a 4 gradi; C
1/100 diluizione
coniglio anti eIF4G anticorpo (H-300)Santa Cruzsc-11373Conservare a 4 gradi; C
1/250 diluizione
capra anti eIF3η (N-20) anticorpoSanta Cruzsc-16377eIF3η è anche noto come eIF3b
Negozio a 4 ° deg; C
1/250 diluizione
topo anti puromicina 12D10 anticorpoMilliporeMABE343Conservare a 4 gradi; C
1/1.000 diluizione
Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)Jackson Immunoresearch715-225-150Recostituire in acqua per produttore' s istruzioni quindi conservare a 4 ° C
1/250 diluizione
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson Immunoresearch711-165-152Ricostituire in acqua secondo il produttore' s istruzioni quindi conservare a 4° C
1/2.500 diluizione
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson Immunoresearch705-175-147Ricostituire in acqua secondo il produttore' s istruzioni quindi conservare a 4° C
1/250 diluizione Soluzione
Hoechst 33258Sigma94403-1MLIncubare con anticorpi secondari
Soluzione madre 0,5 mg/mL in dH20, proteggere dalla luce
-Conservare a 4 gradi; C
Cy3 StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-084Ricostituire in acqua per produttore ' s istruzioni, quindi conservare a 4 gradi C
1/250 diluizione
-(dT)40x sonda biotinilataIntegrated DNA Technologies (IDT)/Ricostituire in acqua a 100 ng/mL, aliquotare e conservare a -20 ° C
Diluire in tampone di ibridazione 1/50 prima dell'uso
Scatola
di ibridazione/Creare una camera di umidità con qualsiasi scatola di vetrini aggiungendo carta umidificata sul fondo
- preriscaldare la scatola prima dell'uso
20x tampone SSCThermo fisher AmbionAM9763Diluire a 2x SSC utilizzando acqua priva di RNasi (trattata con DEPC)
Conservare presso RT
Tampone di lavaggio per FISH
PerfectHybPlus Tampone di Ibridazione SigmaH7033-50mlTampone di incubazione a blocco e sonda per
terreni di montaggio di vetrinifatti in casa/Mix 5 g di " solubile a freddo" poli(alcol vinilico) in 20 mL di PBS
Miscelare mediante sonicazione, quindi agitando O/N a RT
Aggiungere 5 mL di glicerolo e 0,2 mL di azoturo di sodio al 20 % e agitare per 16 ore a RT
Centrifugazione a 20.000 g per 20 minuti, scartare il pellet grande
Aliquot liquido viscoso, Stoccaggio a lungo termine a -20 gradi C, 1 settimana a 4 gradi C
Parafilm "M"SigmaP7793-1EA
Poli(alcol vinilico)SigmaP-8136-250GReagente per fare vinol
GliceroloSigmaG5516-100MLReagente per fare vinol
azoturo di sodioFisher ScientificS2002-5GConservante per soluzione bloccante e vinol
Effettuare una diluizione del 20% in acqua
la media di oligo su ordinazione / FISH

Riferimenti

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