Glycoproteomics della matrice extracellulare: Un metodo per l'analisi Intact Glycopeptide Utilizzando la spettrometria di massa

Sommario

Questo documento descrive un metodo per preparare campioni di tessuto cardiovascolari per analisi MS che permette di (1) l'analisi della composizione proteica ECM, (2) l'identificazione dei siti di glicosilazione, e (3) la caratterizzazione composizionale delle forme glicano. Questa metodologia può essere applicata, con piccole modifiche, allo studio della ECM in altri tessuti.

Abstract

Fibrosi è una caratteristica di molte malattie cardiovascolari ed è associata con la secrezione esacerbato e la deposizione di matrice extracellulare (ECM). Utilizzando proteomica, abbiamo precedentemente identificati oltre 150 ECM e proteine ​​ECM-associata in tessuti cardiovascolari. In particolare, molte proteine ​​ECM sono glicosilate. Questa modificazione post-traduzionale colpisce ripiegamento proteico, la solubilità, la rilegatura e degradazione. Abbiamo sviluppato un metodo di estrazione sequenziale e arricchimento per proteine ​​ECM che è compatibile con la successiva spettrometria di massa tandem cromatografia liquida (LC-MS / MS) Analisi dei glicopeptidi intatti. La strategia si basa su incubazioni sequenziali con NaCl, SDS per decellularization tessuti, e guanidina cloridrato per la solubilizzazione delle proteine ​​ECM. Recenti progressi nella LC-MS / MS includono metodi di frammentazione, come combinazioni di dissociazione collisione alta energia (HCD) e trasferimento elettronico dissociazione (ETD), che consentonol'analisi composizionale diretta dei glicopeptidi di proteine ​​ECM. Nel presente documento, si descrive un metodo per preparare l'ECM da campioni di tessuto. Il metodo consente non solo per la profilatura proteine, ma anche la valutazione e caratterizzazione di glicosilazione mediante analisi MS.

Introduzione

Fibrosi è una caratteristica di molte malattie. Fibroblasti proliferano e si differenziano verso fenotipi altamente sintetici, che sono associati con la secrezione esacerbato e la deposizione di matrice extracellulare (ECM) ^1. deposizione di ECM eccessiva può continuare, anche dopo la lesione iniziale è diminuita, con conseguente compromissione funzionale. Utilizzando proteomica, abbiamo precedentemente identificati oltre 150 ECM e proteine ECM-associata nel tessuto cardiaco ^{2, 3.} Essi non sono solo proteine ​​strutturali, ma anche proteine ​​matricellular e proteasi che contribuiscono alla rimodellamento continuo e adattamento dinamico del cuore. In particolare, molte proteine ECM sono glicosilate ^4. Questa modificazione post-traduzionale (PTM) comporta l'aggiunta di residui di zucchero a determinate posizioni amminoacidiche, e colpisce folding, la solubilità, la rilegatura e degradazione ⁵ .

Ci sono due principali tipi di glicosilazione che si verificano nei mammiferi. (1) N-glicosilazione avviene all'azoto carbossammido di residui di asparagina (Asn) all'interno della sequenza consenso Asn-Xaa-Thr / Ser, dove Xaa è un qualsiasi amminoacido tranne la prolina. (2) In O-glicosilazione, residui zuccherini attribuiscono alla serina e treonina residui (Ser, Thr) o, in misura molto minore, a idrossiprolina e idrossilisina. Mentre O-glicosilazione può verificarsi in una varietà di gruppi di proteine, N-glicosilazione è limitato alle proteine secrete o domini extracellulari di proteine di membrana ^5. Questo rende N-glicosilazione un bersaglio attraente quando si studia l'ECM.

Proteomica stabilisce un nuovo standard per l'analisi dei cambiamenti di proteine ​​nella malattia. Finora, la maggior parte proteomica studi si sono concentrati sulle proteine intracellulari ^6. Ciò è dovuto principalmente ai seguenti motivi. In primo luogo, abbondanti proteine ​​intracellulari ostacolano Pidentizione dei componenti ECM scarse. Ciò è particolarmente importante nel tessuto cardiaco, in cui rappresentano mitocondriali e myofilament proteine per gran parte del contenuto proteico ^7. In secondo luogo, le proteine ​​ECM integrali sono fortemente reticolato e difficile da solubilizzare. Infine, la presenza di PTM abbondanti (Per esempio, glicosilazione) altera la massa molecolare, carica, e le proprietà elettroforetiche di peptidi, che interessano sia la separazione e l'identificazione mediante cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa (LC-MS / MS). Negli ultimi anni, abbiamo sviluppato e migliorato estrazione sequenziale e metodo di arricchimento per proteine ​​ECM che è compatibile con la successiva analisi di spettrometria di massa (MS). La strategia si basa su incubazioni sequenziali.

La prima fase viene eseguita con NaCl, un buffer ionico che facilita l'estrazione delle proteine ​​ECM-associati e ECM debolmente legato, così come proteine ​​ECM di nuova sintesi. E is detersivo, non denaturante, senza interruzioni delle membrane cellulari, e suscettibile di ulteriori test biochimici ^8. Poi, decellularization si ottiene con sodio dodecilsolfato (SDS). A questo punto, una bassa concentrazione di SDS assicura destabilizzazione della membrana e il rilascio di proteine ​​intracellulari mentre impedire interruzioni dei componenti ECM non interi più solubili. Infine, proteine ​​ECM vengono estratti con un tampone guanidina cloridrato (GuHCl). GuHCl è efficace nell'estrarre proteine e proteoglicani fortemente reticolati da tessuti come tendini ^9, cartilagine, ¹⁰ vasi ^{11, 12, 13} e cuore ^{2, 3.} Abbiamo applicato questo frazionamento biochimico, in combinazione con la LC-MS / MS, per esplorare ECM rimodellamento nelle malattie cardiovascolari ^{2 , 3, 11, 12, 13, 14. I recenti progressi nella SM includono metodi di frammentazione innovativi, come combinazioni di dissociazione alta energia di collisione (HCD) e trasferimento di elettroni dissociazione (ETD), che consentono l'analisi diretta dei glicopeptidi intatte 3, 15.}

Qui si descrive un metodo per preparare ECM per l'analisi MS che permette l'analisi di composizione proteica, l'identificazione dei siti di glicosilazione, e la caratterizzazione delle forme glicano. Rispetto alle precedenti analisi di ECM glicosilazione ^16, questa metodologia consente la valutazione diretta dei cambiamenti di composizione nei profili di glicosilazione in modo specifico del sito utilizzando MS. Abbiamo applicato questa metodologia ai tessuti cardiovascolari. Tuttavia, si può alcosì essere applicato, con piccole modifiche, allo studio della ECM in altri campioni di tessuto e può fornire intuizioni senza precedenti in biologia ECM.

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico locale Research Wandsworth (numero di riferimento: 06 / Q0803 / 37) e l'approvazione istituzionale inviato dall'ufficio ricerca e sviluppo. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato scritto.

1. Estrazione di matrice extracellulare proteine

NOTA: I tessuti atriali umani usati per questi esperimenti sono stati ricavati dalle appendici atriali durante il bypass cardiopolmonare, subito dopo l'arresto cardioplegico del cuore. Tutti i campioni sono stati raccolti presso il St George Hospital, London, UK. Tutti i campioni di tessuto devono essere congelati a -80 ° C. Non utilizzare campioni conservati con fissativi, come ad esempio paraformaldeide, che le proteine ​​cross-collegamento.

1. Preparare tutti i buffer di estrazione in anticipo di esperimenti, come da Tabella 1, al fine di minimizzare il tempo tra le fasi di estrazione. Eseguire tutte le incubazioni a temperatura ambiente (RT) in un ambiente a temperatura controllata(Cioè, ~ 20 ° C) per garantire la coerenza tra le estrazioni.
2. Pesare 20-50 mg di tessuto. Se più campioni vengono estratti tagliare e pesare uno ad uno per evitare lo scioglimento completo dei tessuti. Usando un bisturi, dadini il tessuto in 3-4 pezzi più piccoli (cioè, 2-3 mm) e metterli insieme in provette da 1,5 mL.
3. Aggiungere 500 ml di ghiacciata salina tamponata con fosfato (PBS; vedi Tabella 1 e la Tabella dei Materiali) ed eseguire cinque lavaggi per minimizzare la contaminazione del sangue.
4. Estrazione Fase 1: Incubazione con NaCl tampone
   1. Dopo lavaggio con PBS, collocare i campioni in provette da 1,5 ml con tappo a vite. Aggiungere tampone NaCl (vedi Tabella 1) a 10 volte (v: w) il peso del tessuto. Vortex le provette a RT per 1 h alla velocità minima (ad esempio, 600 rpm).
      NOTA: Una bassa velocità vortice è fondamentale per evitare la distruzione meccanica del tessuto durante questa fase.Utilizzare una scheda di schiuma per posizionare tutti i tubi durante l'estrazione.
   2. Trasferire gli estratti a nuove provette e centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C. Conservare gli estratti a -20 ° C fino al momento dell'uso. Brevemente lavare il pellet di tessuto rimanenti con tampone NaCl fresco. Utilizzare lo stesso tipo di tampone (cioè, 100 microlitri di tampone NaCl) per il lavaggio per evitare l'estrazione di altre proteine con differenti solubilità (cioè le proteine non estraibili con NaCl).
   3. Dopo il lavaggio, garantisce la completa rimozione del buffer per minimizzare la sovrapposizione di contenuto proteico con le successive fasi di estrazione. Scartare il tampone NaCl utilizzata per il lavaggio.
      NOTA: Il rapporto tra il volume del tampone ed il peso del tessuto è importante per un'estrazione riproducibile. Un rapporto di 10: 1 (v: w) per le estrazioni NaCl e SDS e 5: 1 per la fase GuHCl fornire quantità sufficienti di proteina senza saturare il buffer. concentrazioni di proteine ​​sono circa 1-2 mg / mL dopo extraction.
5. Estrazione Fase 2: Decellularization con SDS Buffer
   1. Aggiungere SDS tampone (Tabella 1) a dieci volte (v: w) il peso del tessuto; l'uso di concentrazioni basse SDS (cioè, 0,1%) è fondamentale per evitare la perdita di proteine ECM durante decellularization. Vortex le provette a RT per 16 h alla velocità minima (ad esempio, 600 rpm).
      NOTA: A bassa velocità vortice intralci meccanica della ECM.
   2. Trasferire gli estratti di nuovi tubi. Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C; conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso. Brevemente lavare il pellet di tessuto rimanenti con _dd H ₂ O per rimuovere SDS. Garantisce la completa rimozione del liquido dopo il lavaggio.
6. Estrazione Fase 3: Incubazione con GuHCl tampone
   1. Aggiungere GuHCl tampone (Tabella 1) a cinque volte (v: w) il peso del tessuto. Vortex le provette a RT per 72 h alla massima velocità (cioè, 3.200 giri al minuto); vortex vigorosa facilita la distruzione meccanica della ECM.
   2. Trasferire gli estratti di nuovi tubi. Centrifugare a 16.000 xg per 10 min a 4 ° C e conservare a -20 ° C fino al momento dell'uso.

2. Proteine ​​Quantificazione e precipitazioni

NOTA: A causa della presenza di detergenti, il buffer SDS è incompatibile con la quantificazione di proteine ​​diretta sulla base di misure di assorbimento a 280 nm. Per garantire la quantificazione riproducibile, utilizzare test colorimetrici per tutti gli estratti proteici ^17.

1. Quantificazione.
   1. Preparare standard per una curva di calibrazione utilizzando albumina di siero bovino (BSA) diluito serialmente in tampone di estrazione appropriata (cioè, NaCl, SDS, o GuHCl) ^17. Durante questo tempo, scongelare gli estratti dei campioni.
   2. Diluire i campioni in tampone di estrazione per ottenere concentrazioni all'internoil campo lineare di assorbanza; una diluizione 1:10 (v: v) produce risultati soddisfacenti. Diluire i campioni GuHCl con una quantità uguale di DDH ₂ O per la quantificazione, come il saggio colorimetrico non è compatibile con concentrazioni> 4 M GuHCl.
   3. Utilizzare un acido bicinconinico (BCA) -based colorimetrico test ¹⁷ (vedere la tabella dei materiali), seguendo le istruzioni del produttore per test in piastre da 96 pozzetti; si raccomanda di effettuare le misurazioni almeno duplicati.
   4. Dopo incubazione per 30 minuti, le letture di assorbanza alla lunghezza d'onda di 570 nm per calcolare la concentrazione di proteine utilizzando la curva di calibrazione standard BSA ^17.
2. proteine Precipitazioni
   1. Scongelare GuHCl estratti a temperatura ambiente. Aliquota 10 mcg di proteine ​​per ogni campione in nuovi tubi. Per un'analisi diretta glicopeptide, aliquota 50 ug. Aggiungere 10 volte il volume di etanolo e incubate notte a -20 ° C.
      NOTA: GuHCl non è compatibile con altre reazioni enzimatiche e maggior parte delle applicazioni elettroforetiche. La rimozione di GuHCl è necessario prima deglycosylation e tripsina digestione. La solubilità di GuHCl in etanolo e, viceversa, la bassa solubilità delle proteine consentire la rimozione efficace di GuHCl ma produce circa un recupero del 98% di proteine ^18.
   2. Centrifugare i campioni a 16.000 xg per 30 min a 4 ° C e aspirare il surnatante. Fare attenzione a non disturbare il pellet precipitato. Essiccare i granuli per 15 min usando un concentratore a vuoto (vedere la tabella dei materiali) a RT.
      NOTA: Il protocollo può essere fermato qui ei pellet secchi conservato a -20 ° C fino al momento dell'uso.
   3. Facoltativamente, eseguire un'elettroforesi su gel come controllo di qualità (QC, vedere i metodi supplementari).

3. sequenziale Deglycosylation per laValutazione della N-glicosilazione occupazione del sito

1. Durante l'essiccazione del campione (vedere fase 2.2.2), preparare il tampone contenente deglycosylation deramificante enzimi Deglycosylation, come da Tabella 1. Vedi tabella dei materiali per i dettagli del prodotto.
2. Aggiungere 10 ml di tampone deglycosylation contenenti enzimi per ogni campione. Garantire la risospensione del pellet appropriato eseguendo un vortice rapido e spin-down di campioni.
   NOTA: La rimozione dei monomeri di zucchero usando enzimi deramificante è essenziale per la successiva e completa rimozione di saccaridi complessi O-linked e facilita la scissione successiva di zuccheri N-collegati da PNGase-F.
3. Incubare per 2 ore a 25 ° C per permettere la rimozione di eparan solfato dal eparinasi II.Increase la temperatura a 37 ° C e incubare per 36 ore con agitazione.
   NOTA: Dati i volumi di reazione e tempi di incubazione prolungati, agitatori incubatori uso e strettamente confezione multipla 1,5 mL vascaes all'interno di un tubo conico da 50 mL, sporgente all'interno della incubatore a circa 45 °.
4. Dopo 36 h, centrifugare i campioni per 1 min a 16.000 xg ed evaporare il H ₂ O dai campioni usando un concentratore a vuoto a temperatura ambiente per circa 45 min.
5. Risospendere campioni essiccati con 10 ml di H ₂ O ¹⁸ contenente 50 U / mL PNGase-F, che scinde tutti glicani asparagina-linked in una reazione deammidazione.
   NOTA: L'acido aspartico risultante segua una massa eccesso di 2,98 Da, indicativo della presenza di N-glicosilazione durante l'analisi MS.
6. Incubare per 36 ore a 37 ° C sotto costante agitazione incubatore shaker.

4. Nella soluzione tripsina digestione

NOTA: Questa operazione deve essere eseguita per entrambi (cioè utilizzati per l'analisi diretta glicopeptide,) e deglicosilate campioni non deglicosilata (cioè, utilizzato per la valutazione di oc glicanocupancy).

1. Utilizzare 10 mg di proteina totale per la valutazione di occupazione sito N-glicosilazione (come indicato nel passaggio precedente). Per i campioni destinati ad analisi diretta glicopeptidi, utilizzare 50 ug di proteina come l'importo iniziale.
   NOTA: Le seguenti operazioni sono descritti per 10 mg di proteina. Scalare evolumes Th (cioè 5 volte per 50 ug) come richiesto.
2. Denaturare le proteine in ciascuna aliquota campione utilizzando 9 M urea e tiourea 3 M, con concentrazioni finali di 6 M urea e 2 M tiourea, rispettivamente (ad esempio, per un campione di 10 microlitri, 20 ml di urea / tiourea).
3. Ridurre le proteine ​​aggiungendo 100 mM ditiotreitolo (DTT, 3,33 ml, concentrazione finale: 10 mM). Incubare a 37 ° C per 1 ora con agitazione a 240 rpm.
4. Raffreddare i campioni a RT prima di eseguire l'alchilazione aggiungendo 0,5 M iodoacetamide (3,7 ml, concentrazione finale 50 mM). Incubare al buio per 1 ora.
5. Utilizzare pre-raffreddata (-20° C) di acetone (6 volte il volume del campione) di incubare i campioni notte a -20 ° C. Precipitare per centrifugazione a 14.000 xg per 25 min a 4 ° C.
6. Aspirare il surnatante. Fare attenzione a non disturbare il pellet precipitato. Essiccare i granuli proteina usando un concentratore a vuoto per 30 minuti a RT.
7. Risospendere in 20 ml di 0,1 M trietilammonio bicarbonato (Teab) tampone, pH 8,2, contenente tripsina (0,01 mg / mL) e digerire notte a 37 ° C e 240 rpm.
8. Interrompere la digestione mediante acidificazione campioni con acido trifluoroacetico 10% (TFA, 2 microlitri per una concentrazione finale di 1% TFA).

5. Peptide Cleanup utilizzando colonne C18

NOTA: La rimozione di contaminanti interferenti dalla miscela peptidica dopo digestione riduce ione soppressione e migliora rapporti segnale-rumore e la copertura sequenza. Questa operazione deve essere effettuata sia per sa non deglicosilata e deglicosilatamples.

1. Attivare la resina sulla piastra C18 rotazione (vedere la tabella dei materiali) utilizzando 200 ml di metanolo per pozzetto e centrifugare a 1000 xg per 1 min.
2. Lavare aggiungendo 200 microlitri per pozzetto di 80% acetonitrile (ACN) e 0,1% TFA in H ₂ O. Centrifugare a 1000 xg per 1 min.
3. Equilibrare aggiungendo 200 microlitri per pozzetto di 1% ACN e 0,1% TFA in H ₂ O. Centrifugare a 1000 xg per 1 min. Ripetere questa operazione altre due volte.
4. Caricare i campioni (l'intero volume) da passaggio 4 nei pozzetti contenenti la resina e centrifugare a 1500 xg per 1 min. Ricaricare il flusso attraverso una seconda volta e ripetere la centrifugazione.
5. Lavare aggiungendo 200 microlitri per pozzetto di 1% ACN e 0,1% TFA in H ₂ O. Centrifugare a 1500 xg per 1 min. Ripetere questa operazione altre due volte.
6. Eluire i campioni con 170 microlitri per pozzetto di 50% ACN, 0,1% TFA in H ₂ O. Centrifugare a 1500 xg per 1 min. Ripetere il passaggio precedentee combinare l'eluato raccolto.
7. Asciugare l'eluato usando un concentratore a vuoto per 2 ore a temperatura ambiente. Se non viene utilizzato immediatamente, mantenere i campioni essiccati a -80 ° C fino al momento dell'uso.
   NOTA: campioni deglicosilata destinati per l'identificazione di proteine ​​sono pronti all'uso per LC-MS / MS dopo questo passaggio soltanto. I punti 6 e 7 non sono necessari per questi campioni.
8. Scongelare e risospendere campioni deglicosilate a 2% ACN e 0,05% TFA in H ₂ O a una concentrazione proteica finale di 0,5 mg / mL. Procedere con il passaggio 6 per l'analisi glicopeptidi diretta di campioni non deglicosilate.
9. Opzionalmente, filtrare i peptidi prima della marcatura con tag massa tandem (TMT); vedere i metodi supplementari per peptide filtraggio ottimale.

6. Etichettatura con TMT (per l'analisi diretta Glycopeptide solo)

1. Disgelo e risospendere il pellet secchi in 50 ml di 50 mM Teab per ottenere una concentrazione di 1 mg / mL.
2. ResusPED flaconcino 0,8 mg di TMT zero ⁽⁰ TMT, vedere la tabella dei materiali) reagente in 41 ml di ACN. Seguire recommendantions del produttore per la risospensione.
3. Etichettare i campioni peptide ad un rapporto di 50 pg peptidi a 0,4 mg TMT ⁰ (cioè, 50 ml di peptidi a 20,5 ml di TMT ^0). Incubare a RT per 1 h.
4. Spegnere la reazione etichettatura aggiungendo 5% idrossilammina con un rapporto 6: 100 (cioè 4,23 ml di 5% idrossilammina). Incubare a RT per 15 min.
5. Asciugare i campioni peptidici TMT ⁰ -marcato per 1 h a temperatura ambiente usando un concentratore a vuoto. Risospendere in 10 ml di DDH ₂ O.
   NOTA: A causa dei residui glycan, glicopeptidi visualizzare una massa molecolare superiore a peptidi non glicosilata. TMT ⁰ aumenta lo stato di carica dei glicopeptidi. Questo riduce la massa relativa di addebitare ratio (m / z) e facilita ETD frammentazione.

7. glicopeptide arricchimento

1. Usare tamponi di reazione forniti nel kit (vedere la tabella dei materiali).
2. Aggiungere 50 ml di tampone di legame per ogni campione 10 microlitri dal punto 6.5. Vortice soluzione di resina glycocapture fino a renderla omogenea. Utilizzare un zwitterionici interazione idrofilica cromatografia liquida (ZIC-HILIC) a base di catturare ^15.
3. Aliquotare 50 microlitri della sospensione di resina a nuove provette da 1,5 ml. Spin per 1 min a 2.500 xg e rimuovere il surnatante. Aggiungere 60 ml di campione (cioè, il campione con tampone di legame) alle provette contenenti i granuli di resina. Mescolare con una pipetta e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti in agitazione a 1.200 giri al minuto.
4. Centrifugare per 2 min a 2.000 xg e trasferire il surnatante in nuovi tubi. Mantenere i tubi. Aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio per i tubi di resina. Mescolare con una pipetta e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti in agitazione a 1.200 giri al minuto.
5. Spin per 2 min a 2500 x g. Trasferimentoil surnatante agli stessi tubi (dal punto 7.4). Ripetere il lavaggio passi due volte.
6. Aggiungere 75 ml di tampone di eluizione e mescolare con una pipetta. Agitare a 1200 rpm per 5 minuti a temperatura ambiente e quindi si centrifuga le provette per 2 min a 2500 x g. Trasferire il surnatante di nuovi tubi da 1,5 ml. Ripetere le fasi di lavaggio e poi trasferire il surnatante eluato al tubo stesso.
7. Centrifugare le provette contenenti l'eluato (cioè, glicopeptidi) per 2 min a 2500 x g. Trasferire il surnatante in nuove provette per assicurare la rimozione di qualsiasi resina rimanente nei passaggi precedenti.
8. Essiccare il totale 150 ml di eluato usando un concentratore a vuoto per circa 2 ore a temperatura ambiente. Risospendere le glicopeptidi essiccati scorrimento in 15 ml di 2% ACN e 0,05% TFA in DDH ₂ O.
9. Procedere per eseguire LC-MS / MS utilizzando HCD frammentazione per analizzare la composizione proteica ECM e LC-MS / MS utilizzando HCD e ETD frammentazione per la caratterizzazione glicopeptidi. Vedere la sezione 8.

Analisi 8. Spettrometria di Massa

1. Eseguire LC-MS / MS usando HCD frammentazione di analizzare la composizione delle proteine ​​ECM; vedere i metodi supplementari per i dettagli.
2. Eseguire LC-MS / MS usando HCD e ETD frammentazione per la caratterizzazione glicopeptide (vedere i metodi supplementari per i dettagli); il campione arricchito deve essere confrontata al materiale all'ingresso non arricchito ^15.
   NOTA: Le descrizioni dettagliate dei metodi LC-MS / MS per l'analisi indiretta glicopeptide, analisi diretta glicopeptide, e ricerca del database sono forniti nelle Metodi supplementari. I ricercatori interessati a caratterizzare ECM proteine e la composizione glycan utilizzando la spettrometria di massa sono invitati a fare riferimento alle precedenti pubblicazioni ^{3, 11, 15.}

Risultati

Un flusso schematico del protocollo è fornita in Figura 1.

protocollo di estrazione ECM

L'efficienza dell'estrazione può essere controllato eseguendo aliquote formano ciascun estratto su Bis-Tris gel di acrilamide e con colorazione con argento per la visualizzazione. La figura 2A mostra la complementarità del NaCl, SDS e GuHCl estratti dopo estrazione sequenziale. Questo controllo di qualità permette l'identificazione di potenziali problemi con la qualità del campione, come la degradazione delle proteine ​​eccessivo. Dopo l'estrazione, glicoproteine ECM sono abbondanti negli estratti GuHCl (Figura 2B).

deglycosylation

Per valutare l'efficacia di deglycosylation, un controllo non deglicosilata deve essere eseguito in parallel. Deglycosylation volte devono essere adatti per ottenere una rimozione completa e omogenea di residui di zucchero, come esemplificato in Figura 3A. La Figura 3B mostra un esempio rappresentativo di campioni efficientemente deglicosilata mediante l'aggiunta di enzimi per rimozione GAG e deglicosilazione enzimi che colpiscono piccole N- e O-oligosaccaridi legati.

Glycoproteomics

Il protocollo per la valutazione della occupazione di sequons NxT / S migliora la copertura sequenza proteica per glicoproteine ECM dopo MS (Figura 3C) e permette una selezione iniziale della presenza di glicoproteine. Questo aiuta a ridurre il tempo di ricerca di glicopeptidi, come i database possono essere personalizzati per contenere glicoproteine ​​precedentemente identificati. HCD-ETD frammentazione viene utilizzato per l'identificazione e la caratterizzazione composizionale di oligosaccaridi attaccato ECM g lycoproteins. Figura 4A mostra uno spettro rappresentativa risultante per un peptide marcato con ¹⁸ O dopo deglycosylation (analisi glicopeptide indiretto). La figura 4B è un esempio rappresentativo di uno spettro ottenuto dopo analisi dei glicopeptidi intatte da estratti ECM (analisi diretta glicopeptidi).

Figura 1: Metodo presentazione. (A) Dopo arricchimento sequenziale per proteine ECM, analisi LC-MS / MS sono eseguite sugli estratti deglicosilate. (B) In alternativa, estratti ECM non deglicosilate sono ulteriormente arricchito per glicopeptidi. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Estrazione di ECM proteine. (A) I 3 diversi estratti dalla procedura di estrazione sequenziale ( "English Quickstep") sono complementari nel loro contenuto proteico. Mentre estratti SDS sono arricchiti di proteine ​​intracellulari, estratti GuHCl contengono la maggior parte delle proteine ​​ECM. frazionamento di successo è visualizzato dal diverso modello d'argento colorazione. Proteine (B) ECM come la piccola ricco di leucina proteoglicani decorin, biglicano e mimecan sono prevalentemente rilevati negli estratti GuHCl, con scarsa presenza negli estratti SDS e NaCl. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Analisi di GLYCosylation. (A) i tempi di incubazione adeguati sono necessari per la completa deglycosylation. L'esempio mostra l'effetto del tempo di incubazione durante la rimozione delle catene di glicosaminoglicani dal decorin glicoproteina. Glicoproteine (B) ECM sono decorate con grandi e ripetitive glicosaminoglicano catene e N- brevi e diversificati e oligosaccaridi O-linked. Corsia 1 su ciascuna delle immunoblot rappresenta estratti cardiache non trattate. Corsia 2 contiene estratti trattati con enzimi che digeriscono glicosaminoglicani. Campioni in corsia 3 contengono, in aggiunta, enzimi per la rimozione di oligossacharides N- e O-legati. Galectina-1 non è glicosilata, quindi non v'è alcun cambiamento nella dimensione proteine. Adattato da Lynch M, et al. ⁴ (C) In LC-MS / MS, campioni trattati con PNGase-F in presenza di H ₂ O ¹⁸ ottenere una migliore copertura della sequenza (%, a destra) rispetto ai campioni non deglicosilate. Dark aree verdi rappresentano la copertura sequenza mediante LC-MS / MS. Le linee tratteggiate rosse rappresentano glycosites, con i numeri indicano la posizione amminoacidica. Rilevamento di glicosilazione di decorin alla posizione Asn ²¹¹ (N, evidenziato in grassetto) è mostrato in dettaglio come esempio in figura 4. Fare click qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Glycopeptide Analisi per MS. (A) Usando un approccio di proteomica fucile su ECM estratti arricchiti, glicopeptidi possono essere identificate dalla presenza di asparagina deamidati all'interno sequons NxT / S e marcate con ¹⁸ O. L'esempio mostra uno spettro HCD MS / MS per un peptide di decorin contenente la in precedenza glicosilata Asn ^211. I dati ottenuti possono essere utilizzatiper creare un database personalizzato di glicoproteine ​​ECM. (B) HCD-ETD frammentazione è utilizzata per analizzare il glicopeptide arricchito estratto ECM. Lo spettro ETD MS / MS permette la caratterizzazione della composizione glicano. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Soluzioni A. archivio
DTT (ditiotreitolo, C 4 H 10 O 2 S 2)	100 mM DTT in DDH 2 O. 1
EDTA (acido etilendiamminotetraacetico, C 10 H 16 N 2 O 8)	250 mM EDTA in DDH 2 O, pH 8,0.
GuHCl (guanidina cloridrato, CH 6 ClN 3)	8 M GuHCl inDDH 2 O.
IAA (Iodoacetamide, C 2 H 4 INO)	500 mM IAA in DDH 2 O. 1,2
Na acetato (acetato di sodio, C 2 H 3 NaO 2)	1 M Na acetato in DDH 2 O, pH 5,8.
NaCl (cloruro di sodio, NaCl)	1 M NaCl in DDH 2 O.
Na fosfato bibasico (Sodio fosfato, Na 2 H 2 PO 4)	1 M Na fosfato bibasico gg H 2 O, pH 6,8.
SDS (sodio dodecil solfato, NaC 12 H 25 SO 4)	1% SDS (35 mM) in DDH 2 O. 3
TFA (acido trifluoroacetico, C 2 HF 3 O 2)	10% TFA (1,2 M) in DDH 2 O.
Teab (trietilammonio bicarbonato, C 7 H 17 3)	1M Teab in in ddH2O, pH 8,5
Tiourea (tiourea, CH 4 N 2 S)	3 M tiourea in DDH 2 O.
Tris-HCl (Tris-idrocloruro (NH 11 C 4 O 3 [HCl])	100 mM Tris-HCl in DDH 2 O, pH 7,5.
Urea (Urea, CH 4 N 2 O)	9 M urea in DDH 2 O.
Tamponi di reazione B.
C18 tampone di equilibrazione clean-up	1% ACN, 0,1% TFA in DDH 2 O
C18 pulizia tampone di lavaggio colonna	80% ACN, 0,1% TFA in H 2 O
C18 tampone di eluizione clean-up	50% di acetonitrile, 0,1% TFA in DDH 2 O
Deglycosylation Buffer (4x)	600 mM NaCl e 200 mM Na fosfato in DDH 2 O, pH 6,8.
GuHCl tampone 4	4 M guanidina cloridrato, 50 mM di Na acetato e 25 mM EDTA in DDH 2 O, pH 5,8. Aggiungere 1: 100 (v: v) di cocktail di inibitori delle proteasi prima dell'uso.
NaCl tampone 4	0,5 M NaCl, 10 mM Tris-HCl 25 mM EDTA e in DDH 2 O, pH 7,5. Aggiungere 1: 100 (v: v) di cocktail di inibitori delle proteasi prima dell'uso.
PBS (1x)	1.7 mM KH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 150 mM NaCl, pH 7,4. Aggiungere 25 mM EDTA e 1: 100 (v: v) di cocktail di inibitori delle proteasi prima dell'uso.
tampone campione (4x)	100 mM Tris, 2% SDS, 40% glicerolo, 0,02% blu di bromofenolo in DDH 2 O, pH 6,8. Aggiungere 10% ß-mercaptoetanolo prima dell'uso.
SDS tampone 4	0,1% SDS e 25 mM EDTA in DDH 2 O. Aggiungere 1: 100 (v: v) di cocktail di inibitori delle proteasi BEFutilizzo del minerale.
C. enzimi
Condroitinasi ABC 5	0,5 U / mL in tampone deglycosylation (1x)
Keratanase 5	0,1 U / mL in tampone deglycosylation (1x)
Eparinasi II 5	0,1 U / mL in tampone deglycosylation (1x)
α2-3,6,8,9-neuraminidasi (sialidasi) 5	0.025 U / mL in tampone deglycosylation (1x)
β1,4-galattosidasi 5	0.015 U / mL in tampone deglycosylation (1x)
p-N-acetilglucosaminidasi 5	0,25 U / mL in tampone deglycosylation (1x)
Endo-α-N-acetilgalattosaminidasi (O-glicosidasi) 5	0,013 U / mL in tampone deglycosylation (1x)
(N-glicosidasi F-) 6 PNGase-F	50 U / mL in H 2 O 18
tripsina	0,01 mg / mL in tampone Teab
NOTE Tabella.
1 Mantenere soluzione madre congelato a -20 ° C.
2 IAA deve essere tenuto al riparo dalla luce.
3 SDS cristallizza facilmente a <20 ° C. Al fine di facilitare la solubilizzazione del 1% (soluzione madre) SDS, riscaldare il tampone sotto acqua calda.
4 buffer di estrazione possono essere conservati a temperatura ambiente. Aggiungere ampio spettro cocktail di inibitori delle proteasi come indicato prima dell'uso.
5 Questi enzimi dovrebbero essere aggiunti durante la prima fase deglycosylation.
6 PNGase-F deve essere aggiunto solo durante la seconda fase deglycosylation.

Tabella 1: soluzioni di riserva, tamponi di reazione ed enzimi. Questa tabella elenca la composizione di ciascun tampone soluzione madre e di reazione richiesto per l'estrazione e la successiva elaborazione (compresa digestioni enzimatiche) di proteine ​​ECM cardiaci prima dell'analisi MS.

Discussione

Questo protocollo proteomica è stato ottimizzato nel corso degli ultimi anni nel nostro laboratorio. Qui, abbiamo usato il tessuto cardiaco, ma solo piccoli aggiustamenti possono essere richieste per la sua applicazione ad altri tessuti. Ad esempio, il protocollo di estrazione deve assumere la cellularità del tessuto in considerazione. tessuto cardiaco è altamente cellulare rispetto al tessuto vascolare. Quando si utilizza tessuto vascolare, la concentrazione SDS può essere inferiore (cioè 0,08%) e il tempo decellularization è più breve (cioè 4 h) ^{11, 12, 13.} L'uso di enzimi Deglycosylation è cruciale per l'analisi LC-MS / MS di composizione ECM. Tuttavia, i tempi di incubazione devono essere regolati per i diversi tipi di tessuto. Ad esempio, eparinasi II richiesti tempi di incubazione prolungati a 25 ° C se si usano campioni come pelle, che sono ricchi di proteine della membrana basale (es agrina, perlecan) (dati non mostrati). Analisi diretta glicopeptide può essere eseguita su mezzi condizionati da cellule in coltura ^15. potrebbe non essere necessaria procedura di arricchimento per l'analisi di questo subproteome semplificato. Simile agli estratti GuHCl, estratti NaCl sono anche suscettibili di analisi glycoproteomics con piccole modifiche. Altri protocolli di estrazione per l'arricchimento di proteine ECM possono essere adattati per caratterizzare glicopeptidi ECM ^{19, 20.}

La glicosilazione è il più complesso PTM ^5. Identificazione indiretta dei glicopeptidi è raggiunto dalla rilevazione di deamidato Asn con incorporato ¹⁸ O a NxT / S sequon. Deamidated Asn in altre posizioni può rappresentare falsi positivi. Analogamente, N-glicosilazione deve essere considerato nel contesto di ontologie proteine: proteine ​​intracellulari contenenti un / S sequon NxT non saranno glicosilate ma potrebbero dar luogo a falsi positivi. Come searc correnteh algoritmi non consentono la proiezione di PTM a sequenze predeterminate soltanto (cioè Asn a NxT / S), è richiesto il filtraggio manuale dei dati. Identificazione della presenza / assenza di glicosilazione in queste posizioni può essere confrontata tra campioni malattie e di controllo. Non v'è alcun enzima equivalente PNGase F per O-deglycosylation (cioè introducendo uno spostamento di massa su treonina o serina). Pertanto, l'identificazione di O-glicosilazione è limitata ad analisi diretta glicopeptide. Analisi diretta glicopeptide viene utilizzato per ottenere informazioni sulla composizione degli zuccheri attaccati alle proteine, ma non fornisce informazioni strutturali delle glicano. Inoltre, la composizione glicano è il risultato di sintesi glicano e lavorazione dopo la secrezione.

Il nostro metodo di estrazione 3 passaggi per proteine ECM ( "English Quickstep") ⁶ ha permesso che caratterizza l'ECM in una varietà di tessuti cardiovascolari. Frazionamento del tessutoin diversi estratti è necessario per ottenere un proteoma ECM semplificata come discusso altrove ^6. proteine ​​intracellulari altrimenti contribuire ad una gamma dinamica eccessiva di abbondanze proteici nei estratti che ostacolerebbe l'identificazione di proteine ​​ECM meno abbondanti. Inoltre, le proteine intracellulari portano O-glycosylations ⁵ che complicherebbero ECM glicopeptide arricchimento e successiva analisi MS. Altri autori applicati simili metodologie di estrazione di caratterizzare per esempio polmone ²¹ e tessuti cartilaginei ^10, tuttavia essi non perseguono l'analisi di glicosilazione. Precedente analisi di glicosilazione focalizzata sulla identificazione di soli glycosites, richiedono la rimozione del glicano dal nucleo proteina, e non può valutare O-glicosilazione ^{22, 23.} array lectina e arricchimento chimico sono disponibili per la valutazione di tip glycanes su campioni biologici in base alla loro specificità di legame, ma queste tecniche non possono assegnare i tipi glycan a specifiche proteine ²⁴ né possono valutare siti di glicosilazione.

Inizialmente, abbiamo utilizzato elettroforesi su gel prima LC-MS / MS di proteine ​​ECM. Sebbene separazione gel è utile per ottenere frazioni proteiche semplificate suscettibili di analisi LC-MS / MS, i più recenti strumenti offrono velocità di scansione più veloce. Così, la fase di separazione elettroforetica può essere omesso. Ciò fornisce un ulteriore vantaggio come grandi proteine ​​ECM, che vengono trattenuti sulla superficie del gel, vengono analizzate in modo più efficiente. Tuttavia, le informazioni riguardanti il ​​Mw delle proteine ​​intatte è perduto. La fase di evaporazione prima PNGase F deglycosylation assicura una rimozione completa di regolare H ₂ O per minimizzare falsi negativi. Residui di zuccheri (cioè masse glicani variabile) interferiscono con la separazione da LC e compromettono la successiva identificazione peptide MS / MS. A pan-deglycosylation protocollo viene consigliato anche per l'analisi proteomica di proteine ​​ECM non focalizzati su glicosilazione.

La proteomica possono fornire informazioni senza precedenti nella ECM. Oltre il sostegno strutturale, glicani attaccati alla ECM sono essenziali per l'interazione ospite-patogeno, comunicazione cellulare e la risposta immunitaria ^25, cioè il rigetto di allotrapianto dopo trapianto d'organo. Glycoproteomics sarà uno strumento essenziale nella glycobiology.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
A. Sostanze chimiche
Acetonitrile, grado MS ( ACN, C2H3N)	Thermo Scientific	51101	5.2-5.8, 6.2, 7.11, Supp 2, 3, 4
Cocktail di inibitori della proteinasi	Sigma-Aldrich	P8340	1.3,  1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Fosfato disodico (Na2H2PO4)	Sigma-Aldrich	S7907	3.1
Ditiotreitolo (DTT, C4H10O2S2)	Sigma-Aldrich	D0632	4.3
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA, C10H16N2O8)	Sigma-Aldrich	E9884	1.3,   1.4.1, 1.5.1, 1.6.1
Etanolo (C2H6O)	VWR	437433T	2.2.1
Guanidina cloridrato (GuHCl, CH6ClN3)	Sigma-Aldrich	G3272	1.6.1
Glicerolo (C3H8O3)	Acros organics	158920025	Suppl 1.1
H2O LC-MS Cromasolv	Sigma-Aldrich	39253-1L-R	Durante il protocollo
H218O	Taiyo Nippon Sanso	FO3-0027	3.5
Idrossilammina (HA, H3NO)	Sigma-Aldrich	467804	6.4
Iodoacetamide (IAA, C2H4INO)	Sigma-Aldrich	A3221	4.4
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 10x	Lonza	51226	1.3
Acetato di sodio (C2H3NaO2)	Sigma-Aldrich	S7545	1.6.1
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	1.4.1, 3.2
Sodio dodecil solfato (SDS, NaC12H25SO4)	Sigma-Aldrich	466143	1.5.1
Bicarbonato di trietilammonio (TEAB, C7H17NO3)	Sigma-Aldrich	11268	4.7, 6.1
Acido trifluoroacetico (TFA, C2HF3O2)	Sigma-Aldrich	T62200	4.8, 5.2-5.8, 7.11, Supp 2, 3
Tiourea (CH4N2S)	Sigma-Aldrich	T8656	4.2
Tris-cloridrato (Tris-HCl, NH11C4O3[HCl])	Sigma-Aldrich	T3253	1.4.1, Suppl 1.
Urea (CH4N2O)	Sigma-Aldrich	U1250	4.2
Name	Azienda	Numero catalogo	Comments
B. Enzimi
α 2-3,6,8,9-neuraminidasi (sialidasi)	EDM Millipore	362280 (KP0012)	3.1
β 1,4-galattosidasi	EDM Millipore	362280 (KP0004)	3.1
β-N-acetilglucosaminidasi	EDM Millipore	362280 (KP0013)	3.1
Condroitinasi ABC	Sigma-Aldrich	C3667	3.1
Endo-&alfa;-N-acetilgalattosaminidasi (O-glicosidasi)	EDM Millipore	362280 (KP0011)	3.1
Heparinase II	Sigma-Aldrich	H6512	3.1
Keratanase	Sigma-Aldrich	G6920	3.1
PNGasi-F (N-glicosidasi F)	EDM Millipore	362280 (KP0001)	3.5
Tripsina	Thermo Scientific	90057	4.7
Name	Company	Catalog Number	Commenti
C. Kit di reagenti
30 kDa Filtri centrifughi MWCO	Amicon, Millipore	10256744	5.9, Suppl 2
Macro SpinColumn C-18, piastra a 96 pozzetti	Harvard Apparatus	74-5657	5.1
NuPAGE Novex BisTris Acrylamide Gels	Thermo-Scientific	NP0322PK2	Suppl 1
Pierce BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23227	2.1.3
Kit di arricchimento del glicopeptide ProteoExtract	Merk Millipore	72103	7
Etichetta di massa tandem 0 (TMT0)	Thermo Scientific	900067	6.2, 6.3
Nome	Azienda	Numero catalogo	Comments
D. Attrezzature e software
Trappola Acclaim PepMap100 C18, 5 mm x 300 & micro; m, 5 µ m, 100 & Aring;	Thermo Scientific	160454	Suppl 3, 4
Acclaim PepMap100 C18, 50 cm x 75 µ m, 3 µ m, 100 & Aring;	Thermo Scientific	164570	Suppl 3
Motore di ricerca byonic	Protein Metrics	Versione 2.9.30	Suppl 5
Dionex UltiMate 3000 RSLCnano	Thermo Scientific	n/a	Suppl 3, 4
Sorgente ionica EASY-Spray	Thermo Scientific	ES081	Suppl 4
EASY-Spray PepMap RSLC C18,  50 cm x 75 &; m, 2 μ m, 100 & Aring;	Thermo Scientific	ES803	Suppl 4
Mascotte Search Engine	Matrix Science	Versione 2.3.01	Suppl 3
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid Mass Spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMBHQ	Suppl 4
Proteome Discoverer Software	Thermo Scientific	Versione 2.1.1.21	Suppl 3, 5
Picoview Nanospray	Source Nuovo obiettivo	550	Suppl 3
Q Spettrometro di massa HF esattivo	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFALGMBFZ	Suppl 3
Savant SpeedVac Concentratore	Thermo Scientific	SPD131DDA	2.2.2, 3.4, 4.6, 5.7, 6.5, 7.11
Software per ponteggi	Software per proteomi	Versione 4.3.2	Suppl 3