I test di concorrenza del peptide sono ampiamente usati in una varietà di esperimenti molecolari ed immunologici. Questo documento descrive un metodo dettagliato per un test in vitro di oligopeptide-concorrenza e le relative procedure di convalida, che possono essere utili per trovare siti specifici di fosforilazione.
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Articolo metodologico
Analisi della concorrenza oligopeptide per la determinazione del sito di fosforilazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La fosforilazione della proteina in determinati siti determina la sua conformazione e l'interazione con altre molecole. Così, la fosforilazione delle proteine influenza le funzioni e le caratteristiche biologiche della cellula. Attualmente, il metodo più comune per la scoperta dei siti di fosforilazione è mediante analisi liquida / cromatografia / spettrometria di massa (LC / MS), un metodo rapido e sensibile. Tuttavia, le parti fosfatiche relativamente labili sono spesso rilasciate dai fosfopeptidi durante la fase di frammentazione, che spesso produce segnali falsi negativi. In questi casi, un test tradizionale in vitro di chinasi con mutanti localizzati sul sito sarebbe più preciso, ma questo metodo è laborioso e richiede tempo. Pertanto, un metodo alternativo che utilizza concorrenza peptidica può essere vantaggioso. Il motivo di riconoscimento del consenso di 5 'adenosina monofosfato-attivato proteina chinasi (AMPK) è stato stabilito 1 e è stato convalidato utilizzando una scansione di posizionamento peptide libreria asinoAy 2 . Così, i siti di fosforilazione AMPK per un nuovo substrato potrebbero essere predittuti e confermati dai test di concorrenza peptidica. In questa relazione descriviamo le fasi e le procedure dettagliate per il test di chinasi in concorrenza con oligopeptide in vitro illustrando la fosforilazione del fattore 2 (Nrf2) correlata con eritroide 2 a fattore nucleare mediata da AMPK. Per autenticare il sito di fosforilazione, abbiamo effettuato un test sequenziale in vitro di chinasi usando un mutante specifico del sito. Nel complesso, il test di concorrenza peptide fornisce un metodo per la screening di più potenziali siti di fosforilazione e per identificare siti per la convalida da parte dei mutanti del sito di fosforilazione.
Introduzione
La fosforilazione della proteina in un residuo specifico svolge un ruolo significativo in una vasta gamma di processi cellulari. Pertanto, una comprensione delle reti di segnalazione richiede l'individuazione di specifici siti di fosforilazione. Inoltre, il sito di fosforilazione determina l'effetto sulla funzione proteica perché i singoli domini all'interno di una proteina possiedono strutture e funzioni diverse. L'attività del fattore nucleare eritroide 2 correlato 2 (Nrf2), un fattore chiave di trascrizione antiossidante, è bi-direzionale regolata attraverso la fosforilazione in diversi siti. I nostri studi si sono concentrati sulle chinasi che cat....
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Protocollo
1. Sicurezza
ATTENZIONE: Questo protocollo utilizza [γ- 32 P] -ATP per valutare l'attività di AMPK. Fosforo-32 è un isotopo radioattivo, che emette in gran parte le radiazioni beta. Poiché la dimensione di una particella beta è estremamente piccola, può facilmente penetrare l'abbigliamento e la pelle. L'esposizione esterna ed interna a radiazioni beta possono essere dannose per la salute umana, anche causando ustioni cutanee e danni ai tessuti.
- Eseguire tutti i passaggi che richiedono l'uso di [γ- 32 P] -ATP utilizzando una protezione adeguata, come la schermatura acrilica.
- Assicu....
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Risultati
La Figura 1 e la Figura 2 mostrano i risultati di esperimenti ripetuti nella carta precedentemente riportata 8 . Sono stati sintetizzati tre differenti oligopeptidi di 10 residui che imitavano i siti di destinazione AMPK (# 1, 148-157 comprendenti Ser153; # 2, 330-339 composti da Ser335 e # 3, 553-562 composti da Ser558). Vitro chinasi. La fosforilazione di Nrf2 da AMPK è stata notevolmente dimin.......
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Discussione
Come un modo semplice e conveniente per valutare l'autenticità dei siti di fosforilazione previsti mediati da AMPK, qui descriviamo un dosaggio in vitro di chinasi che può essere utilizzato per scoprire uno specifico sito di fosforilazione utilizzando peptidi competitivi e per verificarlo usando un mutante specifico del sito . I dati rappresentativi ottenuti dal saggio di attività AMPK competitivo in vitro hanno raggiunto i risultati di un saggio utilizzando una proteina mutante diretta sul sito, i.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno niente da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Nazionale di Ricerca della Corea finanziata dal governo coreano (MSIP) (No. 2015R1A2A1A10052663 e No. 2014M1A3A3A02034698).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| HEPES | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 15630 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 208337 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E3889 | |
| DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D9779 | |
| β-glicerofosfato | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G9422 | |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 450243 | |
| Cocktail di inibitori della proteasi | Calbiochem, Nottingham, Regno Unito | 539134 | |
| ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2383 | |
| AMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A1752 | |
| AMPK | Upstate Biotechnology, Lago Placid, NY | 14-840 | |
| Nrf2 (WT) | Abnova, Taipei City, Taiwan | H00004780-P01 | |
| [γ-32P]-ATP | PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA | NEG502A | |
| Reagente di colorazione EZblue | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1041 | |
| Pfu turbo DNA polimerasi | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 600250 | |
| miscela dNTP | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | 200415-51 | Evitare il ciclo di scongelamento e congelamento multiplo |
| DpnI | New England Biolabs, Ipswich, MA | R0176S | |
| LB brodo | Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Paesi Bassi | L1704 | |
| Ampicillina | Affymetrix, Santa Clara, CA | 11259 | |
| Agarosio LE | iNtRON Biotechnology, Sungnam, Corea del Sud | 32034 | |
| HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit | Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan | QDF100 | |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 161-0400 | |
| Siero bovino Albumina | Bovogen Biologicals, Victoria, Australia | BSA100 | |
| Glutatione Sepharose 4B | GE Sanità, Marlborough, MA | 17-0756-01 | |
| Acido acetico glaciale | Duksan sostanze chimiche pure, Ansan, Corea | ||
| Alcool metilico | Daejung Chimica & Metals, Siheung, Corea del Sud | 5558-4410 | |
| [header] | |||
| Tifone FLA 7000 | GE Healthcare, Marlborough, MA | 28-9558-09 | |
| Kit SDS-PAGE Bio-Rad Laboratories | , Hercules, CA | 1658001FC | |
| Pompa a vuoto | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-178 | |
| Essiccatore di gel | Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | 165-1746 | |
| Agitatore danzante | FINEPCR, Seoul, Corea | CR300 | La macchina è necessaria per il lavaggio della macchina |
| PCR | a fasi Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA | T100 | |
| Incubatore/agitatore | N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Corea | NB-205L | |
| Microcentrifughe | LABOGENE, Seoul, Corea | 1730R | |
| Colonne | per cromatografiaLaboratori Bio-Rad, Ercole, CA | 732-1010 |
Riferimenti
- Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs. Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).
- Gwinn, D. M., et al. AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint. Mol Cell. 30, 214-....
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Ristampe e permessi
