Valutazione del reticolo sarcoplasmico calcio intracellulare e riserva diastolica calcio rimozione nei cardiomiociti ventricolari isolati

Sommario

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione del reticolo sarcoplasmico Ca^{2 +} riserva e funzione di rimozione del calcio diastolica in cardiomiociti da un sistema di imaging di calcio.

Abstract

Riciclaggio di calcio intracellulare svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti. Cardiaco reticolo sarcoplasmatico (SR) funge da Ca^{2 +} serbatoio per contrazione, che reuptakes intracellulare Ca^{2 +} durante il rilassamento. La SR Ca^{2 +} riserva disponibile per beats è determinata per contractibility cardiaco, e la rimozione di intracellulare di Ca^{2 +} è critica per la funzione cardiaca diastolica. In alcune condizioni fisiopatologiche, come il diabete e infarto, alterato del calcio liquidazione e SR Ca^{2 +} store nei cardiomyocytes possono essere coinvolti nel progresso della disfunzione cardiaca. Qui, descriviamo un protocollo per la valutazione SRCa^{2 +} riserva e diastolica Ca^{2 +} rimozione. Brevemente, un singolo dei cardiomiociti era enzimaticamente isolato, e l'intracellulare Ca^{2 +} fluorescenza indicata da Fura-2 è stata registrata da un sistema di imaging del calcio. Per assumere caffeina per indurre il rilascio totale di SR Ca^{2 +} , abbiamo preimpostato un programma di interruttore automatico di aspersione di interconnessione del sistema di stimolazione e il sistema di perfusione. Quindi, l'adattamento delle curve mono-esponenziale è stato utilizzato per analizzare le costanti di tempo di decadimento di calcio transitori e impulsi di calcio indotta da caffeina. Di conseguenza, il contributo del SR Ca^{2 +}-ATPasi (SERCA) e Na⁺-Ca^{2 +} scambiatore (NCX) alla rimozione del calcio diastolica è stato valutato.

Introduzione

Calcio intracellulare ([Ca^{2 +}]_i) riciclaggio svolge un ruolo critico nella regolazione della funzione sistolica e diastolica in cardiomiociti¹. Come sappiamo, il calcio Ca^{2 +} rilascio indotto avvia l'accoppiamento, di eccitazione-contrazione che traducono il segnale elettrico alla contrazione. La depolarizzazione della membrana attiva il sarcolemma Ca L-tipo^{2 +} canali, che inducono il Ca^{2 +} rilasciano da SR nel citoplasma attraverso recettori della rianodina 2 (RyR2). I transitori elevati citoplasmico Ca^{2 +} avvia la contrazione delle miofibrille. Durante la diastole, citoplasmici....

Protocollo

tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato di uso presso centro di ricerca sperimentale, Accademia delle scienze mediche cinese Cina e Università di Zhejiang e istituzionali Animal Care.

1. preparazione della soluzione

1. preparare tutte le soluzioni, come descritto nella tabella 1.

2. isolamento di sinistra ventricolare (LV) cardiomiociti

Nota: LV cardiomiociti sono isolati enzimaticamente utilizzando un sistema di perfusione Langendroff come descritto in precedenza ^{7 ,....}

Risultati

Qui, vi illustriamo streptozotocin (STZ) - ratti diabetici (DM) indotti e pari età Sprague - Dawley (SD) ad esempio i ratti. 8-settimana-vecchio maschio SD ratti (200 ± 20 g) hanno ricevuto una singola iniezione intraperitoneale di STZ (70 mg/kg, ip) per il buffer di gruppo o citrato di DM per il gruppo di controllo. Una settimana dopo amministrazione di STZ, ratti con glicemia > 16.7 mmol/L sono stati considerati diabetici. Dopo 8 settimane, i miociti di LV sono stati enzimaticamente.......

Discussione

Flusso di calcio rilasciato dal SR è il Ca^{2 +} fonte principale per sistole nel cuore. A una certa misura, l'ampiezza del SR Ca^{2 +} contenuto e frazionario Ca^{2 +} rilasciato dal SR riflettono la SR Ca^{2 +} riserva disponibile per la contrazione cardiaca. D'altra parte, il Ca^{2 +} riserva di SR dipende dalla capacità del loro equilibrio, Ca^{2 +} perdita di SR e SR Ca^{2 +} reuptake attraverso la SR durante la diastole^12,

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaCl	Alfa Aesar	012314
MgCl2	Alfa Aesar	012315
KCl	Alfa Aesar	11595
HEPEs	Sigma	H3375
D-Glucosio	Alfa Aesar	A16828
NaOH	Alfa Aesar	A18395
KOH	Alfa Aesar	A18854
KH2PO4	Alfa Aesar	011594
MgSO4	Alfa Aesar	3337
L-Glutamic	Alfa Aesar	A15031
Taurina	Alfa Aesar	A12403
EGTA	Sigma	E3889
Collagenasi A	Roche	10103586001
Collagenasi Tipo II	Worthington	LS004177
BSA	Roche	735094
caffeina	Sigma	C0750
Fura-2 AM	Invitrogen	F1201
Microscopio	Olympus	Olympus IX 71
Sistema Langendorff	Pechino Syutime Technology Co	PlexiThermo-S-LANGC
Micromanipolatore	Collegamenti Marchauser	MM33 Camera
di perfusione	IonOptix	FHD
perfusione a gravità controllata da valvola	ALA	VC 3-8
Software di comando valvole	ALA	VC 3 1.0.1.2
Regolatore di flusso di precisione	Delta Med	3204315
Manifold multi-barile Matita per perfusione	AutoMate Scientific	04-08-[360]
Punta rimovibile Micron	AutoMate Scientific	360um i.d.
Sistemi di misurazione della fluorescenza e dimensionamento delle cellule	IonOptix	Hyperswitch
Software di registrazione	IonOptix	IonWizard 6.2.59
Stimolatore	IonOptix	MyoPacer EP
Ratti Sprague-dawley	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co.	SCXK 2016-01-007436

Sistema di