L'espansione e l'adipogenesi dell'induzione di progenitori adipociti da tessuto adiposo perivascolare isolati da cellule magnetiche attivate

Sommario

Qui riportiamo un metodo per l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici di Adipocyte (APC) da tessuto adiposo perivascolare (PVAT) utilizzando la selezione delle cellule magnetiche (MCS). Questo metodo consente un aumento dell'isolamento di APC per grammo di tessuto adiposo se confrontato con la selezione delle cellule attivate con fluorescenza (FACS).

Abstract

L'espansione del tessuto adiposo perivascolare (PVAT), un importante regolatore della funzione vascolare attraverso la segnalazione paracrina, è direttamente correlata allo sviluppo dell'ipertensione durante l'obesità. La portata dell'ipertrofia e dell'iperplasia dipende dalla localizzazione del deposito, dal sesso e dal tipo di fenotipi di APC (Adipocyte Progenitor Cell) presenti. Le tecniche utilizzate per l'APC e l'isolamento dei preadipociti negli ultimi 10 anni hanno drasticamente migliorato l'esattezza in cui le singole cellule possono essere identificate in base a determinati marcatori di superficie cellulare. Tuttavia, l'isolamento di APC e di adipociti può essere una sfida a causa della fragilità della cellula, soprattutto se la cellula intatta deve essere mantenuta per le applicazioni di coltura cellulare.

La selezione delle cellule magnetiche ( MCS) fornisce un metodo per isolare un maggior numero di APC vitali per unità di peso del tessuto adiposo. L'APC raccolto da MCS può essere utilizzato per i protocolli in vitro per espandere la preaDipociti e li differenzia in adipociti attraverso l'uso di cocktail di fattori di crescita che permettono l'analisi del potenziale prolifico e adipogenico conservato dalle cellule. Questo esperimento si è concentrato sui depositi PVAT aortici e mesenterici, che svolgono ruoli chiave nello sviluppo della malattia cardiovascolare durante l'espansione. Questi protocolli descrivono metodi per isolare, espandere e differenziare una popolazione definita di APC. Questo protocollo MCS consente l'utilizzo dell'isolamento in qualsiasi esperimento in cui è necessaria la classificazione delle celle con attrezzature minime o addestramento. Queste tecniche possono aiutare ulteriori esperimenti per determinare la funzionalità di popolazioni cellulari specifiche in base alla presenza di marcatori della superficie cellulare.

Introduzione

Il tessuto adiposo perivascolare (PVAT), grazie alla sua prossimità ai vasi sanguigni, è una componente principale di segnalazione paracrina nella funzione vascolare ¹ . L'espansione di questo tessuto adiposo dipende dal fenotipo delle cellule progenitrici adipociti (APC) presente ^{2 , 3} . L'isolamento delle cellule da tessuti adiposi è difficile, poiché gli adipociti primari sono fragili, fluttuanti e di dimensioni variabili. Alcune tecniche di isolamento possono anche alterare il fenotipo e la morfologia delle cellule aumentando la sintesi proteica infiammatoria e riducendo l'espressione genica adipogenica ⁴ , sottolineando l'importanza di un protocollo che mantiene l'integrità delle cellule.

La cultura delle cellule primarie e delle sottopopolazioni specifiche preadipocitiche fornisce un approccio riduzionista alla crescita in vivo e mantiene un equivalente equipaggiamento genetico cellulare ⁵ , anche se ilMe con queste cellule è limitata a causa del deterioramento con l'invecchiamento, o senescenza ⁶ . I preadipociti provenienti da vari depositi adiposi, compresi i depositi sottocutanei e omentali, mostrano anche differenze nella proliferazione ⁷ , che sottolinea l'importanza di raccogliere le cellule da siti anatomici specifici. Le cellule dei precursori dai depositi adiposi bianchi non PVAT sono stati caratterizzati negli studi precedenti ^{7 , 8 , 9} , ma meno conosciuti sui fenotipi PVAT APC.

Le tecniche qui descritte consentono l'analisi di popolazioni APC specifiche e definite con un impatto minimo sulla loro morfologia, sulla loro vitalità e sul potenziale di proliferare e differenziare. La selezione di celle magnetiche attivata (MCS) è suscettibile di applicazioni a valle, come la cultura, in quanto le perle si dissolvono senza alterare la cella. MCS è anche economico, e una volta che l'anticorpo conLe centrazioni sono state standardizzate, la necessità di analisi della citometria a flusso è minima. Studi in vitro con precursori PVAT possono anche dare un'occhiata al potenziale che queste cellule primarie possono avere.

Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo documento seguono le linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Michigan State University. Tutti i buffer e i media devono essere protetti dalla luce.

1. Preparazione di buffer, supporti e strumenti

1. Preparare la soluzione di Krebs Ringer Bicarbonato-Buffered (KRBB): 135 mM di cloruro di sodio, 5 mM di potassio, 1 mM di solfato di magnesio, 0,4 mM di fosfato di potassio fosfato, 5,5 mM di glucosio, 1% di antibiotico / antimicotico (10,000 unità / ml di penicillina, 10,000 μg / ML streptomicina, 25 μg / mL di amfotericina B) e 10 mM HEPES (pH = 7,4). Questa soluzione è stabile per 3 settimane se conservata sterile e a 4 ° C.
2. Preparare collagenasi tipo 1 Soluzione: 1 mg / mL in KRBB con 4% albumina bovina serum (BSA). Questa soluzione deve essere mantenuta a 37 ° C ed è stabile per 4 ore.
3. Preparare la soluzione di tampone di lisi di eritrociti: 154 mM di ammonio cloruro, 10 mM di bicarbonato di potassio, E 0,1 mM EDTA. Conservare a 4 ° C per un massimo di un mese.
4. Preparare il buffer di blocco MCS: Base media DMEM / F12, 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 5% serum asino normale, 40 μL / mL F (ab) Fragmento Donkey IgG anti-ratto. Conservare a 4 ° C per un massimo di un mese.
5. Preparare la soluzione di buffer MCS: salina fosfata-bufferizzata (PBS, pH = 7,5), 0,5% BSA e 2 mM EDTA. Conservare a 4 ° C per un massimo di un mese. La soluzione di de-gas riscaldando a 37 ° C in un contenitore di vetro e poi applicando un vuoto per 15 s. Lasciare inutilizzato tamponato sigillato.
6. Preparare il substrato basale di Fraction vascolare Stromal (SVF): il mezzo di equilibrio Dulbecco-modificato (DMEM): F12, 15% Fetal Calf Serum (FCS), 1% antibiotico / antimicotico (10.000 unità / ml penicillina, 10.000 μg / mL streptomicina, 25 μg / ML amfotericina B), 44,05 mM bicarbonato di sodio, 100 μM ascorbico, 33 μM biotina, 17 μM pantotenato, 2 mM L-glutammina e 20 mM HEPES. Conservare sterile e a 4 ° C fino a 2 settimane.
7. Preparare APC &(10 ng / mL), fattore di crescita BB (10 ng / mL) e fattore di crescita di fibroblasti di base ( 5 ng / ml). Conservare sterile e a 4 ° C fino a 2 settimane.
8. Preparare APC Media: APC Media con 10% FBS, 2,5 μg / mL insulina, 0,5 mM 2-isobutil-1-metillaxantina (IBMX), 1 μM dexametasone e 200 pM T3 (ormone tiroideo triiodotironina). Conservare sterile e a 4 ° C fino a 2 settimane.

2. Isolamento dei progenitori adipociti

1. Anestetizzare il ratto secondo gli orientamenti istituzionali. Posizionare il ratto nella ricostruzione dorsale. Confermare la profondità dell'anestesia attraverso un pizzico e la perdita di risposta riflessi a questo doloroso stimolo.
   NOTA: Questo protocollo utilizza ratti da 10 settimane di Sprague Dawley e 70 mg / kg di pentobarbital consegnati tramite un'iniezione intraperitoneale.
2. Effettuare un'incisione mediana verticale wIth forbici lungo lo sterno nell'area toracica e nell'area perineale. Accedere alla cavità addominale ed esporre l'arteria mesenterica superiore, i piccoli vasi di resistenza mesenterica (mPVAT) e l'aorta toracica (aPVAT).
   1. Eliminate tutte le connessioni alla mesenteria e l'aorta e rimuovete le navi dagli animali. Isolare PVAT usando un microscopio di dissezione e un piatto di Petri riempito con KRBB per visualizzare le vaschette e isolare PVAT.
   2. In questo esperimento, raccogliere l'adiposità gonadale (GON) per rappresentare un deposito adiposo non-PVAT. Inserire i rilievi grassi isolati su ghiaccio in KRBB con 10 mM HEPES (pH = 7,4).
   3. In un cappuccio di biosicurezza, trasferire circa 50 mg di tessuto in un tubo da 1,7 ml con 1 ml di collagene tipo I e mescolare con forbici di tessuto (da 1 a 3 mm pezzi).
3. Esempi di digestione mediante incubazione a 37 ° C in un incubatore a rotisserie (o incubatore con un agitatore orbitale) per 1 h. In un cappuccio di biosicurezza, filtrare in sequenza il materiale digerito attraverso 100 e 40 Μm in un tubo da 50 ml. Centrifugare filtrato a 4 ° C per 10 min a 300 × g.
   NOTA: Tutte le fasi del protocollo da qui in avanti devono essere eseguite in un cappuccio di biosicurezza per mantenere le cellule sterili.
4. Versare il supernatante e risospendere i pellet che contengono le cellule SVF in 1 mL di 1X Erythrocyte Lysis Buffer Solution e trasferire in un tubo microfuge da 1,7 mL. Incubare le cellule per 5 minuti a RT protetto dalla luce e centrifugare a 4 ° C per 5 min a 300 x g.
5. Versare il supernatante e risospendere il pellet di cellule rimanenti in SVF Basal Media. Raccogliere un sotto-campione da 20 μL per contare le cellule vive con Trypan Blue Solution.
   NOTA: il numero di celle SVF isolabili varia per sito. I numeri medi di SVF raccolti per mg di tessuto sono: aPVAT = 5,0 ± 2,0x10 ³ , mPVAT = 1,04 ± 0,62x10 ⁴ , GON = 2,4 ± 1,2x10 ⁵ .

3. Selezione delle cellule magnetiche attivate

_content "> NOTA: isolare APC da SVF sulla base dei marker di superficie delle cellule CD34 e PDGFRα eseguendo tutte le fasi a 4 ° C.

1. Le cellule di spin per 5 minuti a 300 x g. Versare il supernatante e risospendere il pellet di cellule nel buffer di blocco MCS a 1 x 10 ⁶ cellule / ml e incubare per 20 minuti.
   NOTA: Le sospensioni cellulari di 1 x 10 ⁶ - 2 x 10 ⁸ cellule / mL possono essere separati in modo efficace.
2. Incubare le cellule con 5 μL di miele anti-CD34 coniugato con FITC (1 μg / 1 x ¹⁰⁶ cellule) per 30 minuti a 4 ° C. Le cellule di spin per 5 minuti a 300 xg e 4 ° C.
   1. Incubare con 4 μL microbeads anti-FITC e 96 μL di buffer MCS (volume totale di 100 μL) per 5 minuti a 4 ° C nel buio per separare le cellule CD34 ⁺ e CD34.
3. Collegare il separatore magnetico al supporto e collocare la colonna MultiSort (MS), con le ali della colonna in avanti, nel separatore. Mettere un 5 mlTubo di raccolta sotto la colonna MS nel supporto tubo superiore.
4. Preparare la colonna MS risciacquando con la soluzione MCS Buffer. Applicare 500 μL di buffer MCS in cima alla colonna e lasciare che il buffer scorra. Scartare l'effluente e sostituire il tubo di raccolta.
5. Caricare la sospensione cellulare contrassegnata con anticorpi sulla colonna MS preparata. Raccogliere il flusso che contiene le cellule non contrassegnate.
6. Lavare la colonna MS con 500 μL di MCS Buffer A3 degasato. Raccogli le cellule non contrassegnate che passano e si combinano con il flusso passato dalla fase precedente.
7. Rimuovere la colonna MS dal separatore magnetico e collocarla su un nuovo tubo di raccolta. Pipettare 1 ml di MCS Buffer sulla colonna MS. Immediatamente sciacquare la frazione con le cellule etichettate magneticamente saldamente, ma lentamente, applicando lo stantuffo fornito con la colonna per non permettere gas in eccesso nella colonna.
   NOTA: I numeri di cellule isolati variano per sito. Numero medio di CD34 ⁺ APC isolati dalla popolazione SVF perMg di tessuto sono: aPVAT = 2,6 ± 0,43x10 ² , mPVAT = 9,6 ± 1,4x10 ² , GON = 1,3 ± 0,22x10 ³ .
8. Le cellule di spin per 5 minuti a 300 × g e 4 ° C. Incubare la frazione CD34 ⁺ raccolta in 10 μL di una soluzione 1/200/1 x 106 cellule Rabbit anti-PDGFRα per 30 min a 4 ° C.
   1. Centrifugare di nuovo le cellule per 5 minuti a 300 xg e 4 ° C. Incubare le cellule etichettate con 4 μL microbeads IgG anti-coniglio e 96 μL di buffer MCS ripetendo i passaggi da 3.3 a 3.7 per isolare.
      NOTA: I numeri di cellule isolati variano per sito. Il numero medio di PDGFRα ⁺ APC isolati dalla popolazione CD34 ⁺ per mg di tessuto sono: aPVAT = 2,4 ± 0,64, mPVAT = 8,4 ± 2,4, GON = 10,4 ± 1,9, che è 0,5-10% della popolazione precedentemente isolata.

4. Induzione della cultura cellulare e dell'adipogenesi

1. Coltivi la SVFE APC in piastre di coltura a tessuto 6-Well nei supporti basali con sostituzione ogni 2 giorni. Dopo 3 passaggi seriali, piastre in piastre di coltura a tessuto 96-pozzetto nero a 1x10 ² cellule / pozzetto per i test di proliferazione, valutate a 8, 24, 48 e 96 h e a 50.000 cellule / pozzetto in piatti a 24 pozzetti o 10.000 cellule / pozzetto in piastre di coltura a tessuto 48-well per i test di adipogenesi, qualitativi e quantitativi.
2. Supplemento basale media APC per 48 h post-confluenza e prima dell'induzione con proteina morfogenica ossea 4 (3,3 nmol / L) come indicato ¹⁰ per la differenziazione. Indurre le cellule dopo 48 h di 100% di confluenza (giorno 0) utilizzando il supporto APC Induction per incubare le cellule.
3. Dopo 48 h, sostituire i supporti per mantenere le celle nei media APC Induction senza IBMX e deksametasone, per 14 giorni con i cambiamenti di media ogni 48 h.
4. Isolamento MCS convalidato da FACS.
   1. Prendere un campione sottile di 50 μL (50.000 celle) separato magneticamenteE lavare con soluzione FACS.
   2. Centrifugare le cellule e risospendere in 100 μl di una soluzione 1: 1.000 di IgG Dylight 405 anti-coniglio asina per etichettare le cellule PDGFRα ⁺ . Incubare per 30 min protetto dalla luce e a 4 ° C.
   3. Lavare le cellule e risospendere in 200 μL di soluzione di formaldeide al 2% fino al tempo per l'analisi usando filtri a 488 nm (FITC) e 405 nm (Dylight 405) su un citometro di flusso.
      NOTA: L'accumulo lipidico per cellule coltivate viene valutato quantitativamente utilizzando un saggio di fluorescenza adipogenesi lipofile in un microplate reader che misura la fluorescenza e utilizzando preadipociti come calibratori per l'accumulo lipidico. L'accumulo lipidico è anche misurato qualitativamente dalla colorazione dei lipidi e dall'immagine eseguita su un microscopio invertito dotato di una fotocamera, rendendo la percentuale di cellule totali che fanno o non contengono lipidi osservabili. Qualsiasi lettore di piastre che è in grado di misurare la fluorescenza con l'eccitazione a 485 nm e l'emissione a 572Nm è adatto per l'analisi e qualsiasi microscopio con una fotocamera in grado di catturare immagini digitali.

Risultati

La capacità proliferativa dei preadipociti e il potenziale adipogenico dei precursori adipociti sono caratteristiche che vengono mantenute in vitro ¹¹ . La proliferazione in vitro di SVF e APC isolati da aPVAT, mPVAT e GON di ratti maschi è stata valutata a 8, 24, 48 e 96 h dopo la placcatura usando un saggio quantitativo del DNA. Nessuna differenza di sito nel tasso di espansione di SVF è stata osservata in qualsiasi momento tranne che ...

Discussione

L'obiettivo principale del presente esperimento è l'isolamento, l'espansione e l'induzione adipogenica di APC dai depositi PVAT. Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento di APC basato sull'identificazione delle cellule che esprimono i marker di superficie CD34 e PDGFRα. Queste proteine ​​superficiali sono state precedentemente identificate in APC con elevati tassi di proliferazione e il potenziale di differenziarsi in adipociti bianchi o marroni in vari depositi adiposi ^14...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Dissezione tissutale
Piastre di dissezione	Fatte a mano con
	Pyrex		7740
Elastomero siliconico	Dow Corning	Sylgard 170	Kit
Sutura in seta intrecciata	Harvard Apparatus	51-7615	SP104
Stereomicroscopio MZ6	Leica		10447254
Stereomaster Microscopio Sorgente luminosa a fibre ottiche	Fisher Scientific	12562-36
Vannas Forbici	George Tiemann & Co	160-150
Pinze per schegge	George Tiemann & Co	160-55
Forbici per tessuti	George Tiemann & Co	105-400<
strong>KRBB Soluzione
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	7647-14-5
Cloruro di potassio	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Solfato di magnesio	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich	7758-114
Glucosio	Sigma-Aldrich	50-99-7
Antibiotico/Antimicotico	Corning	30-004-CI
HEPES	Corning	25-060-CI
Digestione dei tessuti
Collagenasi Tipo 1	Worthington Biochimico	LS004196
Albumina sierica bovina (BSA)	Fisher Scientific	9048-46-8
Tampone per lisi dei globuli rossi	BioLegend	420301	1X Soluzione di lavoro
Bagno d'acqua	Thermo-Fisher Scientific	2876	Bagno di agitazione reciproca
Cabina di biosicurezza	Thermo-Fisher Scientific	1385
Incubatore girarrosto	Daigger	EF4894C
100 & micro; m Filtro cellulare	Thermo-Fisher Scientific	22-363-549	Giallo
40 µ m Filtro cellulare	Thermo-Fisher Scientific	22-363-547
Emocitometro	Cole-Parmer	UX-79001-00
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	93595
Isolamento cellulare
OctoMACS Kit	Miltenyi Biotech	130-042-108
(DMEM):F12 Medium	Corning	90-090
Siero fetale bovino a base media (FBS)	Corning	35016CV	USA Origins
Siero d'asino normale	AbCam	AB7475
Anti-CD34	Santa Cruz	SC-7324	FITC-coniugato
Anti-PDGFR&alfa;	Thermo-Fisher Scientific	PA5-17623
Donkey Anti-Rabbit IgG	Jackson ImmunoResearch	712-007-003
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10X	Corning	46-013-CM	1X Soluzione di lavoro
EDTA	Fisher Scientific	15575020
Cell Culture
CO Incubatore cellulare 2	Thermo-Fisher Scientific	51030285	Heracell 160i
Piastre a 6 pozzetti	Corning	3516	a
48 pozzetti	con TC Corning	3548
Piastre a 96 pozzetti, parete nera	Corning	353376
Bicarbonato di sodio	Sigma-Aldrich	144-55-8
Siero fetale di vitello trattato con TC (FCS)	Corning	35011CV	USA Origins
Acido ascorbico	Sigma-Aldrich	50-81-7
Biotina	Sigma-Aldrich	58-85-5
Pantotenato	Sigma-Aldrich	137-08-6
L-Glutammina	Corning	61-030
Proteina morfogenica ossea 4 (BMP4)	Prospec Bio	CYT-081
Fattore di crescita epidermica (EGF)	PeproTech	400-25
Fattore inibitorio della leucemia	PeproTech	250-02
Fattore di crescita derivato dalle piastrine BB	Prospec Bio	CYT-740
Fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF)	PeproTech	450-33
Insulina	Corning	25-800-CR	Soluzione ITS
IBMX	Sigma-Aldrich	28822-58-4
Desametasone	Sigma-Aldrich	50-02-2
T3 (Triiodotironina)	Sigma-Aldrich	6893-023
Analisi cellulare
CyQUANT Test di proliferazione	Thermo-Fisher Scientific	C7026
AdipoRed Reagente per test di fluorescenza	Lonza	PT-7009
Reagente colorante lipidico O rosso olio	Sigma-Aldrich	O1391	In Soluzione
M1000 Lettore di Micropiastre	Tecan
Eclipse Microscopio Invertito	Nikon
Mirino Digitale DS-Qil Fotocamera	Nikon