Qui riportiamo un metodo per l'isolamento delle popolazioni di cellule progenitrici di Adipocyte (APC) da tessuto adiposo perivascolare (PVAT) utilizzando la selezione delle cellule magnetiche (MCS). Questo metodo consente un aumento dell'isolamento di APC per grammo di tessuto adiposo se confrontato con la selezione delle cellule attivate con fluorescenza (FACS).
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Articolo metodologico
L'espansione e l'adipogenesi dell'induzione di progenitori adipociti da tessuto adiposo perivascolare isolati da cellule magnetiche attivate
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'espansione del tessuto adiposo perivascolare (PVAT), un importante regolatore della funzione vascolare attraverso la segnalazione paracrina, è direttamente correlata allo sviluppo dell'ipertensione durante l'obesità. La portata dell'ipertrofia e dell'iperplasia dipende dalla localizzazione del deposito, dal sesso e dal tipo di fenotipi di APC (Adipocyte Progenitor Cell) presenti. Le tecniche utilizzate per l'APC e l'isolamento dei preadipociti negli ultimi 10 anni hanno drasticamente migliorato l'esattezza in cui le singole cellule possono essere identificate in base a determinati marcatori di superficie cellulare. Tuttavia, l'isolamento di APC e di adipociti può essere una sfida a causa della fragilità della cellula, soprattutto se la cellula intatta deve essere mantenuta per le applicazioni di coltura cellulare.
La selezione delle cellule magnetiche ( MCS) fornisce un metodo per isolare un maggior numero di APC vitali per unità di peso del tessuto adiposo. L'APC raccolto da MCS può essere utilizzato per i protocolli in vitro per espandere la preaDipociti e li differenzia in adipociti attraverso l'uso di cocktail di fattori di crescita che permettono l'analisi del potenziale prolifico e adipogenico conservato dalle cellule. Questo esperimento si è concentrato sui depositi PVAT aortici e mesenterici, che svolgono ruoli chiave nello sviluppo della malattia cardiovascolare durante l'espansione. Questi protocolli descrivono metodi per isolare, espandere e differenziare una popolazione definita di APC. Questo protocollo MCS consente l'utilizzo dell'isolamento in qualsiasi esperimento in cui è necessaria la classificazione delle celle con attrezzature minime o addestramento. Queste tecniche possono aiutare ulteriori esperimenti per determinare la funzionalità di popolazioni cellulari specifiche in base alla presenza di marcatori della superficie cellulare.
Introduzione
Il tessuto adiposo perivascolare (PVAT), grazie alla sua prossimità ai vasi sanguigni, è una componente principale di segnalazione paracrina nella funzione vascolare 1 . L'espansione di questo tessuto adiposo dipende dal fenotipo delle cellule progenitrici adipociti (APC) presente 2 , 3 . L'isolamento delle cellule da tessuti adiposi è difficile, poiché gli adipociti primari sono fragili, fluttuanti e di dimensioni variabili. Alcune tecniche di isolamento possono anche alterare il fenotipo e la morfologia delle cellule aumentando la sintesi proteica infiammatoria e riducendo l&....
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Protocollo
Tutte le procedure descritte in questo documento seguono le linee guida stabilite dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Michigan State University. Tutti i buffer e i media devono essere protetti dalla luce.
1. Preparazione di buffer, supporti e strumenti
- Preparare la soluzione di Krebs Ringer Bicarbonato-Buffered (KRBB): 135 mM di cloruro di sodio, 5 mM di potassio, 1 mM di solfato di magnesio, 0,4 mM di fosfato di potassio fosfato, 5,5 mM di glucosio, 1% di antibiotico / antimicotico (10,000 unità / ml di penicillina, 10,000 μg / ML streptomicina, 25 μg / mL di amfotericina B) e 10 mM H....
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Risultati
La capacità proliferativa dei preadipociti e il potenziale adipogenico dei precursori adipociti sono caratteristiche che vengono mantenute in vitro 11 . La proliferazione in vitro di SVF e APC isolati da aPVAT, mPVAT e GON di ratti maschi è stata valutata a 8, 24, 48 e 96 h dopo la placcatura usando un saggio quantitativo del DNA. Nessuna differenza di sito nel tasso di espansione di SVF è stata osservata in qualsiasi momento tranne che .......
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Discussione
L'obiettivo principale del presente esperimento è l'isolamento, l'espansione e l'induzione adipogenica di APC dai depositi PVAT. Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento di APC basato sull'identificazione delle cellule che esprimono i marker di superficie CD34 e PDGFRα. Queste proteine superficiali sono state precedentemente identificate in APC con elevati tassi di proliferazione e il potenziale di differenziarsi in adipociti bianchi o marroni in vari depositi adiposi 14.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Laboratori Contreras e Watt e Dr. William Raphael. Questi esperimenti sono stati supportati da NHLBI F31 HL128035-01 (standardizzazione del protocollo di digestione tissutale), NHLBI 5R01HL117847-02 e 2P01HL070687-11A1 (animali) e NHLBI 5R01HL117847-02 (isolamento e coltura cellulare).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Dissezione tissutale | |||
| Piastre di dissezione | Fatte a mano con | ||
| Pyrex | 7740 | ||
| Elastomero siliconico | Dow Corning | Sylgard 170 | Kit |
| Sutura in seta intrecciata | Harvard Apparatus | 51-7615 | SP104 |
| Stereomicroscopio MZ6 | Leica | 10447254 | |
| Stereomaster Microscopio Sorgente luminosa a fibre ottiche | Fisher Scientific | 12562-36 | |
| Vannas Forbici | George Tiemann & Co | 160-150 | |
| Pinze per schegge | George Tiemann & Co | 160-55 | |
| Forbici per tessuti | George Tiemann & Co | 105-400< | |
| strong>KRBB Soluzione | |||
| Cloruro di sodio | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| Cloruro di potassio | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| Solfato di magnesio | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| Fosfato di potassio bibasico | Sigma-Aldrich | 7758-114 | |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | 50-99-7 | |
| Antibiotico/Antimicotico | Corning | 30-004-CI | |
| HEPES | Corning | 25-060-CI | |
| Digestione dei tessuti | |||
| Collagenasi Tipo 1 | Worthington Biochimico | LS004196 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Fisher Scientific | 9048-46-8 | |
| Tampone per lisi dei globuli rossi | BioLegend | 420301 | 1X Soluzione di lavoro |
| Bagno d'acqua | Thermo-Fisher Scientific | 2876 | Bagno di agitazione reciproca |
| Cabina di biosicurezza | Thermo-Fisher Scientific | 1385 | |
| Incubatore girarrosto | Daigger | EF4894C | |
| 100 & micro; m Filtro cellulare | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-549 | Giallo |
| 40 µ m Filtro cellulare | Thermo-Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Emocitometro | Cole-Parmer | UX-79001-00 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | 93595 | |
| Isolamento cellulare | |||
| OctoMACS Kit | Miltenyi Biotech | 130-042-108 | |
| (DMEM):F12 Medium | Corning | 90-090 | |
| Siero fetale bovino a base media (FBS) | Corning | 35016CV | USA Origins |
| Siero d'asino normale | AbCam | AB7475 | |
| Anti-CD34 | Santa Cruz | SC-7324 | FITC-coniugato |
| Anti-PDGFR&alfa; | Thermo-Fisher Scientific | PA5-17623 | |
| Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 712-007-003 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 10X | Corning | 46-013-CM | 1X Soluzione di lavoro |
| EDTA | Fisher Scientific | 15575020 | |
| Cell Culture | |||
| CO Incubatore cellulare 2 | Thermo-Fisher Scientific | 51030285 | Heracell 160i |
| Piastre a 6 pozzetti | Corning | 3516 | a |
| 48 pozzetti | con TC Corning | 3548 | |
| Piastre a 96 pozzetti, parete nera | Corning | 353376 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich | 144-55-8 | |
| Siero fetale di vitello trattato con TC (FCS) | Corning | 35011CV | USA Origins |
| Acido ascorbico | Sigma-Aldrich | 50-81-7 | |
| Biotina | Sigma-Aldrich | 58-85-5 | |
| Pantotenato | Sigma-Aldrich | 137-08-6 | |
| L-Glutammina | Corning | 61-030 | |
| Proteina morfogenica ossea 4 (BMP4) | Prospec Bio | CYT-081 | |
| Fattore di crescita epidermica (EGF) | PeproTech | 400-25 | |
| Fattore inibitorio della leucemia | PeproTech | 250-02 | |
| Fattore di crescita derivato dalle piastrine BB | Prospec Bio | CYT-740 | |
| Fattore di crescita dei fibroblasti di base (bFGF) | PeproTech | 450-33 | |
| Insulina | Corning | 25-800-CR | Soluzione ITS |
| IBMX | Sigma-Aldrich | 28822-58-4 | |
| Desametasone | Sigma-Aldrich | 50-02-2 | |
| T3 (Triiodotironina) | Sigma-Aldrich | 6893-023 | |
| Analisi cellulare | |||
| CyQUANT Test di proliferazione | Thermo-Fisher Scientific | C7026 | |
| AdipoRed Reagente per test di fluorescenza | Lonza | PT-7009 | |
| Reagente colorante lipidico O rosso olio | Sigma-Aldrich | O1391 | In Soluzione |
| M1000 Lettore di Micropiastre | Tecan | ||
| Eclipse Microscopio Invertito | Nikon | ||
| Mirino Digitale DS-Qil Fotocamera | Nikon |
Riferimenti
- Watts, S. W., et al. Chemerin connects fat to arterial contraction. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (6), 1320-1328 (2013).
- Dodson, M. V., et al. Adipose depots differ in cellularity, adipokines produced, gene expression, and cell systems.
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Ristampe e permessi
