La capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine nei tessuti della drosofila è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo. Ecco la descrizione di una procedura semplice per dissecare pupale ali. Queste ali possono essere utilizzate come campioni in diverse tecniche (immunohistochemistry, analisi di PCR, ecc.).
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Articolo metodologico
Un metodo rapido ed efficiente per sezionare Pupal ali della drosofila adatto per Immunodetections o analisi di PCR
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo sviluppo dell'ala in Drosophila melanogaster è un modello ideale per studiare la morfogenesi a livello del tessuto. Queste appendici si sviluppano da un gruppo di cellule che si chiamano dischi immaginali ala formate durante lo sviluppo embrionale. In stadi larvali si sviluppano i dischi immaginali, aumentando il numero delle cellule e formando strutture epiteliali monostrati. All'interno del caso pupal, i dischi immaginali bud fuori e piegare in doppii strati lungo una linea che diventa il futuro margine dell'ala. Durante questo processo, le vene longitudinali primodia provengono vena cellule sulle superfici dorsali e ventrali prospettica dell'ala. Durante la fase di pupa le strisce delle cellule della vena di ogni superficie comunicano al fine di generare tubi stretti; allo stesso tempo, la croce-vene iniziano la loro formazione.
Con l'aiuto di marcatori molecolari appropriati, è possibile identificare gli elementi principali che compongono l'ala durante il suo sviluppo. Per questo motivo, la capacità di rilevare con precisione le trascrizioni o proteine in questa struttura è fondamentale per lo studio della loro abbondanza e localizzazione relazionati al processo di sviluppo dell'ala.
La procedura qui descritta si concentra sulla manipolazione pupale Ali, fornendo istruzioni dettagliate su come sezionare l'ala durante la fase di pupa. La dissezione del tessuto pupal è più difficile da eseguire rispetto alle loro controparti in terzo instar larve. Ecco perché questo approccio è stato sviluppato, per ottenere campioni di alta qualità rapido ed efficiente. Dettagli di come immunostain e Monte questi esempi di ala, per consentire la visualizzazione delle proteine o dei componenti delle cellule, vengono forniti nel protocollo. Con poca esperienza è possibile raccogliere Ali pupal di alta qualità di 8-10 in un breve lasso di tempo.
Introduzione
Ali di Drosophila sono sviluppate dai dischi immaginali ala. La primordiale di questi dischi ala vengono messe da parte durante lo sviluppo embrionale come piccoli gruppi di 20-30 cellule immaginale che invaginano dall'epitelio embrionale. Mentre la larva cresce alla terza fase instar, mitosi si verifica nelle cellule immaginale in specifici momenti caratteristici alzando i suoi numeri (circa 50000 cellule) e formando l'ala disco1,2,3, 4. Come le cellule proliferano, essi moda un epitelio tubulare, risultante in una spirale auto-pi....
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Protocollo
1 ° giorno
1. raccolta e coltura pupe.
- 0 h dopo formazione pupario (APF) o membranose usando un pennello bagnato dai flaconcini colte e adagiatele in new fiale a quasi completa il periodo di sviluppo (Vedi 2.1 e 2.2).
Nota: Una popolazione sana di mosche dovrebbe essere mantenuta utilizzando protocolli standard di coltura. Dopo tre o quattro giorni in cui le uova vengono deposte, gli adulti possono essere rimossi dai flaconcini per consentire uno sviluppo ottimale degli individui. Sono mantenute a temperatura costante fino a quando le larve instar terza avviare impupamento. La transizione larvale/pupa è contr....
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Risultati
Il protocollo offre un metodo semplice per ottenere campioni di pupal ala che conservano la morfologia familiare dell'ala. Da queste preparazioni è possibile ottenere gli stack di immagini che potrebbero essere proiettati all'esterno come 2D o 3D, per studiare la distribuzione e/o l'arricchimento di proteine durante la differenziazione dell'ala. Un protocollo simile (vedere la nota in 2.9) consente di raccogliere il campione di grande ala pupale (che coinvolge 50-80 pupal Ali) necessario .......
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Discussione
Il metodo della dissezione descritto in questo video può essere utilizzato per preparare campioni di alta qualità di Drosophila pupale ali dalle fasi differenti di sviluppo per molti tipi di tecniche (ad es., immunofluorescenza, sintesi di cDNA per analisi di PCR, in vitro sviluppo di ala). In termini di questo metodo lo scienziato coinvolto hanno usato 24-30 h APF. Tuttavia, non ci dovrebbe essere nessun ostacolo entro i passi essenziali nella dissezione di pupa più giovane o più anziani. Le .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare CSIC per il sostegno finanziario dato a questo progetto, a Mariana Di Doménico per la sua assistenza tecnica con microscopia confocale; per José Leonardo Báez per correzioni suo manoscritto; a Luciano Correa per la sua dedizione alla creazione di video; a Natalia Rosano per prestando la sua voce per il video e Bloomington Drosophila Stock Center per fornire le scorte utilizzate in questo studio. La PA1 monoclonale anti-Ptc sviluppato da Isabel Guerrero è stato ottenuto da inerente allo sviluppo studi Hybridoma Bank (DSHB) sotto l'egida del NICHD e gestito dal dipartimento di scienze biologiche, The University of Iowa, Iowa City, IA 52242.....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Stereomicroscopio con illuminazione a luce fredda | Nikon | ||
| Piattaforma oscillante | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Vetrini per microscopio | StarFrost | 8037/1 | |
| Occhiali di copertura (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Pinza | F.S.T | 11252-00 | |
| Forbici | Lawton | 63-1400 | |
| Piatto in plastica multipozzetto | Thermo Pipetta scientifica | 144444 | |
| p100 o p200 | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldeide | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glicerolo | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagente | Ambion | 15596026 | |
| DEPC acqua trattata | MO. BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 capra anti-topo IgG (H+L), 2 mg/mL (diluizione di lavoro 1/800) | Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonale anti-Ptc (Apa-1) 54 μ g/mL (diluizione di lavoro 1/100) | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Di Isabel Gerrero del DSHB sotto gli auspici del NICHD e gestito dall'Università dell'Iowa, Dipartimento di Scienze Biologiche, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (diluizione di lavoro 1/5000) | Invitrogen | 62248 | |
| Falloidina coniugata ad Alexa 488, 300 U/1,5 mL metanolo (diluizione di lavoro 1/600) | Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
Riferimenti
- Serrano, N., O'Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T.
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Ristampe e permessi
