Un approccio modulare alla sintesi di N- glicani per il collegamento ad un vetro rivestita di ossido di alluminio diapositiva (ACG) come è stato sviluppato un microarray glycan e suo utilizzo per la profilazione di un HIV anticorpo di neutralizzazione ampiamente è stata dimostrata.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Chemio-enzimatico di sintesi della N- glicani matrice dello sviluppo e dell'anticorpo HIV profilatura
In questo articolo
Sommario
Abstract
Vi presentiamo un modo altamente efficiente per la preparazione rapida di una vasta gamma di N-collegato oligosaccaridi (stimati a superare i 20.000 strutture) che si trovano comunemente sulle glicoproteine umane. Per ottenere il desiderato diversità strutturale, la strategia ha cominciato con il chemio-enzimatico di sintesi dei tre tipi di moduli di fluoruro di oligosaccharyl, seguite da loro graduale glycosylations α-selettivo presso la 3-O e 6-O posizioni della residui di mannosio del trisaccaride nucleo comune avendo un legame β-mannoside cruciale. Abbiamo attaccato ulteriormente gli N- glicani alla superficie di una lastra di vetro rivestita di ossido di alluminio (ACG) per creare un array misto covalente per l'analisi dell'interazione ligando-etero con un anticorpo HIV. In particolare, il comportamento di associazione di un nuovo isolato HIV-1 largamente anticorpo neutralizzante (bNAb), PG9, alla miscela di ravvicinate Man5GlcNAc2 (uomo5) e 2,6-di-sialilato bi-antennary complesso tipo N- glycan (SCT ) su una matrice ACG, apre una nuova strada per guidare la progettazione immunogen efficace per lo sviluppo del vaccino HIV. Inoltre, la nostra matrice ACG incarna un potente strumento per studiare altri anticorpi anti-HIV per il comportamento di etero-ligando.
Introduzione
N- glicani su glicoproteine sono covalentemente ad l'asparagina (Asn) residuo di sequon di Asn-Xxx-Ser/Thr di consenso, che interessano diversi processi biologici come il riconoscimento di conformazione, antigenicità, solubilità e lectina di proteina 1 , 2. la sintesi chimica di N-collegati oligosaccaridi rappresenta una sfida sintetica significativa a causa della loro enorme eterogeneità strutturale micro e architettura altamente ramificato. Un'attenta selezione di proteggere gruppi per ottimizzare la reattività di blocchi predefiniti, raggiungimento di selettività presso centri anomerici e ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. preparazione del D1/D2 braccio moduli22
- Preparazione di intermedi 2
- Pesare a partire del materiale 1 (illustrata nella Figura 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) in una provetta da 15 mL e sciogliere in Tris tampone (25 mM, pH 7.5) contenente Dicloruro di manganese (MnCl2, 10 mM) per ottenere una concentrazione finale glycan di 5 mM.
- Aggiungere 2 equivalenti di galattosio di uridina difosfato (UDP-Gal).
- Aggiungere 150 unità di en....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Una strategia modulare chemo-enzimatica per la sintesi di una vasta gamma di N -glicani è presentata nella Figura 1. La strategia è basata sul fatto che la diversità può essere creato all'inizio da chemio-enzimatico di sintesi dei tre moduli importanti, seguita dalla mannosilazione α-specifiche con il 3-O e/o 6-O posizione del residuo mannosio del comune trisaccaride nucleo di N- glicani. Considerando la diversità struttura.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Una classe di HIV-1 bNAbs tra cui PG9, PG16 e PGTs 128, 141-145 sono stati segnalati per essere altamente potente nel neutralizzare il 70-80% del circolante isolati HIV-1. Gli epitopi di questi bNAbs sono altamente conservati tra le varianti del gruppo intero di HIV-1 M, quindi si può guidare la progettazione immunogen efficace per un vaccino contro l'HIV suscitare anticorpi neutralizzanti23,24,25 . Come parte dei nostri sforzi .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano il Thin Film Technology Division, strumento Technology Research Center (ITRC) e laboratori di ricerca applicata nazionale, parco scientifico Hsinchu, Taiwan. Questo lavoro è stato supportato dal National Science Council (grant no. La maggior parte 105-0210-01-13-01) e Academia Sinica.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido acetico | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Anidride acetica | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Solfato di magnesio anidro | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Trifluoruro di boro etere etilico | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 poliacrilammide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(ciclopentadienil)afnio(IV) dicloruro | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 galattosil transferasi da latte bovino | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Tecnologia cartesion con perno robotico SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerio ammonio molibdato | TCI | C1794 | |
| Cerio nitrato di ammonio | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Vetrino pulito | Schott | ||
| Acido citidina-5&primo;-monofosfo-N-acetilneuraminico | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Cloroformio deuterato | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 coniugato | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Diclorometano | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Dietilamminosolforforato trifluoruro | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimetilformammide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Acetato di etile | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Glicole etilenico | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide camere di incubazione | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'- sale disodico difosfo-b-L-fucosio | Software Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 | Sezione 4 del protocollo | ||
| GenePix Pro 4300A reader (analisi delle immagini microarray) | dispositivi | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (elaborazione delle immagini) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Idrossido di litio | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Cloruro di manganese | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Metanolo | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanolo | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Acido ossalico | Acros Organico | 144627 | |
| Idrossido di palladio | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Fosfato tamponato soluzione salina | Thermo Fisher Scientific | ||
| Piridina | Sigma Aldrich | 110861 | |
| Acido P-Toluene Solfonato monoidrato | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Triflato d'argento | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Cloruro di sodio | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| carbonato acido | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Metossido di sodio | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Solfato di sodio | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Grado ultrapuro |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| uridina difosfato galattosio (UDP-galattosio) | Sigma Aldrich | 137868521 |
Riferimenti
- Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317(2009).
- Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
