Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

Sommario

Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell'assorbimento della vescicola.

Abstract

Durante endocitosi, fusione delle vescicole sinaptiche sono Estratto alle terminazioni nervose, permettendo per riciclo delle vescicole e quindi il mantenimento della trasmissione sinaptica durante la cottura ripetuto del nervo. Alterata endocitosi in condizioni patologiche conduce alle diminuzioni in funzioni sinaptiche di forza e cervello. Qui, descriviamo i metodi utilizzati per misurare la endocitosi delle vescicole sinaptiche alla sinapsi ippocampo mammifera in coltura neuronale. Abbiamo monitorato endocitosi proteine delle vescicole sinaptiche fondendo una proteina di membrana vescicolare sinaptica, compreso lo synaptophysin e VAMP2/sinaptobrevina, sul lato di lumenal vescicolare, con pHluorin, una proteina fluorescente verde di pH sensibili che aumenta la sua aumenta l'intensità di fluorescenza come il pH. Durante l'esocitosi, vescicolare lumen pH aumenta, mentre durante il lume vescicolare endocitosi pH è ri-acidificato. Così, un aumento dell'intensità di fluorescenza pHluorin indica fusione, mentre una diminuzione indica endocitosi della proteina marcata delle vescicole sinaptiche. Oltre a utilizzare il metodo di imaging pHluorin per registrare endocitosi, abbiamo monitorato endocitosi membrana vescicolare da misure di microscopia elettronica (EM) del rafano perossidasi (HRP) assorbimento dalle vescicole. Infine, abbiamo monitorato la formazione dei pozzi di membrana terminale del nervo in tempi diversi dopo la depolarizzazione indotta da potassio alta. Il corso di formazione di pozzo di assorbimento e membrana HRP tempo indica il corso di tempo dell'endocitosi.

Introduzione

Neurotrasmettitori sono memorizzati in vescicole sinaptiche e distribuiti dalla esocitosi. La membrana della vescicola sinaptica e la proteina sono quindi interiorizzati dal endocytosis e riutilizzati nel prossimo turno di esocitosi. Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono importante per il mantenimento piscine delle vescicole sinaptiche e rimuove vescicole sporgente dalla membrana plasmatica. PHluorin la proteina fluorescente verde sensibili al pH, che è spenta in circostanze acide e dequenched a pH neutro, è stato utilizzato per misurare il tempo di endocitosi corsi in diretta le cellule^1,2,

Protocollo

Nota: il seguente protocollo descrive i metodi di formazione immagine di pHluorin e metodi EM utilizzati in neuroni hippocampal coltivati. pHluorin monitor delle vescicole sinaptiche proteine l'assorbimento nelle cellule viventi ed EM rileva l'assorbimento delle vescicole sinaptiche e cambiamenti ultrastrutturali.

cura degli animali e procedura seguite linee guida NIH e sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali NIH.

1. pHluorin Imaging

1. cultura Neurone ippocampale
   1. preparare ippocampo Buffer (HB) combinando 4 NaHCO ₃ e 5 mM HEPES e regolare a pH 7....

Risultati

Utilizzando il metodo di elemento portante del lipido, SpH è stato espresso nei neuroni dell'ippocampo, che consenta l'identificazione dei boutons (Figura 1a). La stimolazione elettrica delle cellule indotto esocitosi e un corrispondente aumento in intensità di fluorescenza. L'aumento della fluorescenza (ΔF) è stato interrotto terminando lo stimolo (Figura 1b). L'aumento della fluorescenza è stata seguita da una lenta diminuzione.......

Discussione

Qui dimostriamo due metodi per il monitoraggio di endocitosi delle vescicole sinaptiche. Nel primo metodo, abbiamo monitorato pHluorin fuse con una proteina della vescicola sinaptica nei neuroni trasfettati e successivamente elettricamente stimolata. In secondo luogo, abbiamo usato la formazione immagine EM dell'assorbimento HRP come indotto da KCl. Abbiamo usato diversi stimoli per due motivi. In primo luogo, applicazione di potassio induce la depolarizzazione di tutti i neuroni nella cultura. Questo facilita l'esame EM.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lipofectamina LTX con Plus	Thermo Fisher	15338-100	Trasfezione di DNA plasmidico tra cui sinaptofisina o VAMP2-pHluorin
terreno neurobasale	Thermo Fisher	21103-049	Terreno di crescita per neurone, Riscaldamento fino a 37 gradi; C prima dell'uso
B27	Thermo Fisher	17504-044	Gradiente per differenziazione neuronale
Glutamax	Thermo Fisher	35050-061	Gradiente per coltura neuronale
Vetrino coprioggetti rivestito in poli-D-lisina	Neuvitro	GG-25-pdl	Substrato per la crescita neuronale e l'imaging di pHluorin
Tripsina XI da pancreas bovino	Sigma	T1005	Neuronal Tessuti ippocampali con digestione di coltura
Desossiribonucleasi I da pancreas bovino	Sigma	D5025	Coltura neuronale inibisce lo
stimolatore di impulsi	Sistemi A-M	modello 2100	Applicare la stimolazione elettrica
Bagno a fessura con stimolazione di campo	Warner Instruments	RC-21BRFS
l'unità di isolamento dello stimolo	Warner Instruments	SIU102	Applicare
il lubrificante	Dow corning	111	pHluorin imaging-seal con vetrino coprioggetto e camera di imaging, evitare perdite dalla camera
AP5	Tocris	3693	Gradiente per soluzione salina normale, antagonista selettivo del recettore NMDA, inibire l'attività postsinaptica che ha un potenziale per attività ricorrente
CNQX	Tocris	190	Gradiente per soluzione fisiologica normale, antagonista competitivo del recettore AMPA/kainato, inibisce l'attività postsinaptica che ha un potenziale di attività ricorrente
Illuminatore	Nikon	C-HGFI	Sorgente luminosa ad alogenuri metallici per fotocamera pHluorin
EMCCD	Imaging Andor	iXon3	pHluorin, rileva l'intensità della fluorescenza pHluorin
Microscopia invertita Nikon		Ti-E	Imaging per cellule trasfettate con sinaptofisina o VAMP2 pHluorin
NIS-Elements AR	Nikon	NIS-Elements	Software di ricerca avanzata per l'acquisizione e l'analisi dell'imaging
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software per l'analisi dell'imaging e la presentazione dei dati
camera di imaging	Warner Instruments	RC21B	pHluorin imaging, applicare la stimolazione di campo sulle cellule viventi
poli-l-lisina	Sigma	P4832	Microscopia elettronica, substrato per la crescita neuronale, applicare su piastra multipozzetto per 1 ora a temperatura ambiente, quindi lavare con acqua sterilizzata 3 volte
Perossidasi di rafano (HRP)	Sigma	P6782	Microscopia elettronica, marcatura di vescicole sinaptiche endocitose catalizzando DAB in presenza di perossido di idrogeno, la concentrazione finale è di 5 mg/mL in soluzione fisiologica normale, preparare fresco prima dell'uso
Na cacodylato	Microscopia elettronica Scienze	12300	Microscopia elettronica, tampone per fissativi e lavaggio, concentrazione finale 0,1 N
3,3′-Diaminobenzidina (DAB)	Sigma	D8001	Microscopia elettronica, marcatura di vescicole sinaptiche endocitose, substrato per HRP, concentrazione finale è 0,5 mg / mL in DDW e filtrato, fare fresco prima dell'uso
Soluzione di perossido di idrogeno	Sigma	H1009	Microscopia elettronica, marcatura delle vescicole sinaptiche endocitose inducendo la reazione HRP-DAB, la concentrazione finale è dello 0,3% in DDW, fare fresco prima dell'uso
glutaraldeide Scienze	microscopia elettronica	16365	Microscopia elettronica, fissativi, la concentrazione finale è del 4% in tampone Na-cacodylato, fare fresco prima dell'uso, agitare bene prima di usare
TEM	JEOL	200CX	Microscopia elettronica, imaging di vescicole endocitose e alterazioni ultrastrutturali
Fotocamera digitale CCD	AMT	XR-100	Microscopia elettronica, acquisizione di immagini
Citrato di piombo	Microsystems Leica	16707235	Microscopia elettronica, colorazione a griglia

a sospensione cellulare viscosa Applicare di stimolazione elettrica per stimolazione elettrica della