Selezione-dipendente e generazione indipendente di CRISPR / Cas9-mediata Gene Knockouts nelle cellule di mammiferi

Sommario

I recenti progressi nella capacità di manipolare geneticamente le linee cellulari somatiche hanno un grande potenziale per la ricerca di base e applicata. Qui presentiamo due approcci per la produzione e lo screening generati da CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari mammiferi, con e senza l'uso di marcatori selectable.

Abstract

Il sistema di ingegneria del genoma CRISPR / Cas9 ha rivoluzionato la biologia permettendo di modificare il genoma in modo preciso e con poco sforzo. Guidato da una singola guida RNA (sgRNA) che conferisce specificità, la proteina Cas9 ferma entrambi i fili di DNA nel luogo di destinazione. La rottura del DNA può scatenare un collegamento non terminale (NHEJ) o una riparazione diretta (HDR) omologica. NHEJ può introdurre piccole delezioni o inserzioni che portano a mutazioni di fotogrammi, mentre HDR consente perturbazioni più grandi e più precise. Qui presentiamo i protocolli per la generazione di linee di cellule di knockout accoppiando i metodi CRISPR / Cas9 stabiliti con due opzioni per la selezione / screening a valle. L'approccio NHEJ utilizza un singolo sito di taglio sgRNA e uno screening indipendente dalla selezione, in cui la produzione di proteine ​​viene valutata mediante immunoblot dot in modo ad alto rendimento. L'approccio HDR utilizza due siti di taglio sgRNA che spaziano sul gene di interesse. Insieme a un modello HDR fornito, questo metodo può raggiungere la cancellazioneDi decine di kb, aiutato dal marker di resistenza selezionabile inserito. Vengono discusse le opportune applicazioni ei vantaggi di ciascun metodo.

Introduzione

Le alterazioni genetiche stabili offrono un vantaggio rispetto ai metodi transitori di perturbazione cellulare, che possono essere variabili nella loro efficienza e durata. L'editing genomico è diventato sempre più comune negli ultimi anni a causa dello sviluppo di nucleasi specifiche di target, quali le nucleasi di zinco-dito ^{, 1 , 2 , 3 , 4 , 5} , nucleasi efficace (TALEN) simili all'attivatore di trascrizione ^{6 , 7 ,....}

Protocollo

1. Identificazione delle regioni di omologia intorno alla desinenza desiderata

NOTA: necessaria solo se si utilizza la modifica basata su selezione.

1. Selezionare due regioni, inizialmente 1.5-2 kb, da entrambi i lati del locus di deselezione desiderato, che servirà come armi di omologia nel modello HDR ( Figura 1A ). Identificare le regioni che non dispongono di siti di riconoscimento BsaI su uno strato (GGTCTC) per facilitare la clonazione. Se i siti BsaI sono inevitabili, utilizzare un enzima di restriction di tipo IIs (BsmBI, SapI, BbsI) e modificare i siti corrispondenti nel plasmide destinatari....

Risultati

Per la generazione di linee di eliminazione ELAVL1, è stato disponibile un anticorpo robusto, in modo da eseguire la modifica usando sgRNA singoli ( figura 1A , sinistra), seguita da immunoblot dot. Tre sgRNAs sono stati trasfettati in modo indipendente per confrontare efficienze e per escludere gli effetti target nei cloni risultanti. Dopo aver raccolto e blottato i lisati delle cellule dalle popolazioni clonali su due membrane di nitrocellulosa, le macchie.......

Discussione

Il sistema CRISPR / Cas9 ha permesso un'efficace generazione di modifiche genomiche stabili, che forniscono un'alternativa più coerente ad altri metodi di manipolazione transitoria. Ecco, abbiamo presentato due metodi per la rapida identificazione dei colpi di origine CRISPR / Cas9 nelle linee cellulari di mammiferi. Entrambi i metodi richiedono un piccolo materiale cellulare, pertanto i test possono essere eseguiti nelle fasi iniziali della coltura clonale, risparmiando tempo e reagenti. Per aumentare l'eff.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
preparazione
E. coli cellule
pSpCas9(BB) plasmide	Addgene	42230	Ran et al. 2013, clonazione di sgRNA
BbsI enzima	ThermoFisher	FD1014	Ran et al. 2013, clonazione di sgRNA
T7 DNA ligasi	NEB	M0318L	Ran et al. 2013, clonazione di sgRNA
Tango Buffer		ThermoFisher BY5	Ran et al. 2013, clonazione di sgRNA
PlasmidSafe exonuclease	Epicentre	E3105K	Ran et al. 2013, clonazione di sgRNA
Q5 hot start polimerasi ad alta fedeltà	NEB	M0494A	HA amplificazione
pUC19-BsaI			Plasmide pUC19 modificato, sito BsaI esistente mutato e inserito due siti BsaI rivolti verso l'esterno dopo la digestione di BamHI/EcoRI
pGolden-Neo	Addgene	51422	Cassetta di resistenza
pGolden-Hygro	Addgene	51423	Cassetta di resistenza
Enzima BsaI	NEB	R3535S	Costruzione del braccio di omologia
T7 DNA ligasi	NEB	M0318L
PlasmidSafe esonucleasi	Epicentro	E3105K
Stuzzicadenti			PCR batterica
Taq polimerasi			colonia batterica PCR
HEK293 cellule
DMEM	Corning	10-013-CV
FBS	Corning	MT35010CV
Penicillina-Streptococco (opz.)	Gibco	15140-122
piastre a 6 pozzetti	BioLite	12556004
Reagente di trasfezione TransIT-LTI	Mirus	MIR2300	solo per lipofezione
Opti-MEM	ThermoFisher	31985062	solo per lipofezione
G418 (Neomicina)	Sigma Aldrich	A1720-5G
Igromicina	Sigma Aldrich	H3274-250MG
Piastre a 96 pozzetti	ThermoFisher	12556008
tampone di lisi passiva, 5x	Promega
1x SDS ricetta del tampone			descritta nel protocollo
Membrana di nitrocellulosa	Bio-Rad	162-0115
Ricetta TBST			descritta nel protocollo
Latte disidratato
Substrato SuperSignal West Dura a lunga durata	ThermoFisher	34075	per anticorpi secondari coniugati con HRP
Extracta Preparazione del DNA per PCR	Quantabio	95091-025
KOD polimerasi	Novagen	71316