Articolo metodologico

Indagando von Willebrand fattore patofisiologia utilizzando un modello di flusso di camera di von Willebrand Factor-PIASTRINOGENESI. String

DOI:

10.3791/55917

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14 agosto 2017

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1Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Department of Medicine, Queen's University

In questo articolo

Sommario

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In questo articolo, descriviamo un metodo per valutare endoteliale von Willebrand fattore rilascio e la successiva della piastrina catturare sotto sollecitazione di taglio fluido in risposta a stimoli infiammatori, utilizzando un sistema di alloggiamento del flusso in vitro .

Abstract

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Fattore di von Willebrand (VWF) è un fattore di coagulazione di glicoproteina multimerica che media l'adesione della piastrina e l'aggregazione in siti di danno endoteliale e che trasporta il fattore VIII nella circolazione. VWF è sintetizzato dalle cellule endoteliali e viene rilasciato sia costitutivamente nel plasma o viene memorizzato in organelli specializzati, chiamati corpi di Weibel-Palade (disfunzione), per il rilascio su richiesta in risposta alla sfida emostatica. Stimoli proinfiammatori e procoagulant possono indurre rapidamente WPB esocitosi e rilascio VWF. La maggior parte del VWF rilasciato dalle cellule endoteliali circola nel plasma; Tuttavia, una proporzione di sindrome di Raynaud è ancorata alla superficie delle cellule endoteliali. In condizioni di taglio fisiologico, endoteliali ancorato VWF possibile associare alle piastrine, formando una stringa di VWF-piastrine che può rappresentare il nidus della formazione di trombi. Un sistema dell'alloggiamento di flusso può essere utilizzato per osservare visivamente il rilascio di VWF da cellule endoteliali e la successiva della piastrina catturare in un modo che è riproducibile e pertinenti alla patofisiologia della formazione dell'embolo VWF-mediata. Utilizzando questa metodologia, le cellule endoteliali sono coltivate in una camera di flusso e sono successivamente stimolate con secretagoghi per indurre esocitosi WPB. Piastrine lavate sono perfusi quindi sopra l'endotelio attivato. Le piastrine sono attivate e successivamente associare a stringhe di VWF allungate in direzione di flusso del fluido. Usando gli istoni extracellulari come stimolo procoagulante e proinflammatory, abbiamo osservato formazione aumentata di stringa VWF-piastrine sulle cellule endoteliali istone-trattati rispetto alle cellule endoteliali non trattate. Questo protocollo descrive una valutazione quantitativa, visual e in tempo reale di attivazione dell'interazione VWF-piastrine in modelli di trombosi ed emostasi.

Introduzione

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La trombosi è delle cause principali di mortalità nel mondo1 e può svilupparsi in risposta todysregulated generazione della piastrina attivazione e trombina in entrambe le arterie varicosee. I livelli del plasma di sindrome di Raynaud sono un regolatore chiave della coagulazione del sangue, per cui bassi livelli (< 50%) provocare i disturbi emorragici conosciuto come von Willebrand (VWD) la malattia2 e livelli elevati (> 150%) sono associati con un rischio aumentato di venosa3 e trombosi arteriosa4 .

Sindrome di Raynaud è una glicoproteina multimerica sintetizzato dalle cellule endoteliali e megacariociti e archiviati in α-granuli della piastrina e disfunzione, rispettivamente. Al momento di sfida emostatica, VWF può essere liberato dalla disfunzione endoteliale Tether piastrine circolanti a cellule endoteliali attivate5 o collagene esposto sulla nave parete6. Ancoraggio del VWF alle cellule endoteliali ha dimostrato di essere mediato daP-selectin 7 e integrina αvβ38. Il rilascio successivo di negozi α-granuli delle piastrine può aumentare ulteriormente le concentrazioni localizzate di VWF per stabilizzare le interazioni della piastrina-piastrina per formazione della spina della piastrina, l'impalcatura necessaria per la propagazione della cascata della coagulazione e della fibrina deposizione. L'attività della piastrina-associazione di sindrome di Raynaud è regolata dalla relativa struttura multimerica, con multimeri ad alto peso molecolare che possiede maggiore attività emostatiche9,10. In circolazione, VWF funge anche da un elemento portante per il fattore VIII della coagulazione.

Sollecitazione di taglio fluido è un regolatore essenziale della fisiologia VWF. In assenza di sollecitazione di taglio, VWF esiste in una forma globulare, celando domini di legame per la glicoproteina piastrinica Ib adesione11. Quando la sollecitazione di taglio è presente, il sito di clivaggio per un metalloprotease, un disintegrin e metalloprotease con motivo trombospondina (ADAMTS13), è esposto. ADAMTS13 fende le stringhe VWF nude e decorato della piastrina per regolare la dimensione del multimer, riducendo così la sua attività emostatiche12.

Sindrome di Raynaud è una proteina della fase acuta, e numerosi stimoli, compreso ipossia13, infezione14e citochine proinfiammatorie, sono stati indicati per mediare il rilascio VWF dalle cellule endoteliali. Simile ad altri agenti infiammatori, gli istoni extracellulari inoltre sono stati indicati per indurre il rilascio sistemico di VWF in topi15,16 e l'attivazione delle piastrine in vitro17,18, 19. questo è stato indicato per essere dipendente da sottotipo dell'istone, come differenze di lisina e contenuto di arginina può influenzare la funzione15. Nostro studio si propone di istituire una camera di flusso modello per studiare l'influenza del ricco di lisina (HK) e acquisizione di ricchi di arginina sottotipi dell'istone (HR) e secretagoghi sulla liberazione endoteliale di VWF e piastrine in tempo reale, eventi potenziali precoci in trombosi indotta da infiammazione.

Questa metodologia di camera di flusso ricapitola in vivo interazioni tra collagene subendoteliale, cellule endoteliali, VWF e piastrine in un sistema in vitro che è visivo, riproducibili e quantificabili. Esso consente la valutazione in tempo reale di tutti gli aspetti del pathway che regola l'interazione VWF-piastrine, compreso secrezione WPB, attivazione piastrinica e proteolisi VWF. Studi di sindrome di Raynaud in condizioni di sollecitazione di taglio controllato sono stati utilizzati per valutare le mutazioni di VWD che compromettere il rilascio di sindrome di Raynaud e di funzione della piastrina-associazione20, WPB fisiologia21e scissione VWF di ADAMTS135. Usiamo questa metodologia per quantificare la formazione stringa VWF-piastrine in conseguenza di uno stimolo infiammatorio: istoni extracellulari.

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Protocollo

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Questi studi sono stati approvati dalla University, Canada ricerca etica Consiglio della Regina.

1. endothelial delle cellule stimolazione

  1. Collagene-cappotto una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti.
    1. 24 ore in anticipo, cappotto una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti a 37 ° C con 1 mL di collagene (50 µ g/mL del ratto coda collagene di tipo 1 con 0,02 M di acido acetico glaciale) del buffer.
    2. Lavare i pozzetti due volte con 2 mL di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS).
      Nota: Piastre possono essere avvolto in carta stagnola e memorizzati in un sacchetto di plastica ermetico a 4 ° C.
  2. Seme le cellule endoteliali ad una densità di 1 x 106 cellule per pozzetto in 2 mL di crescita media contenente 10% siero bovino fetale (FBS). Incubare le cellule per 24 h a 37 ° C (5% CO2).
    Nota: Qui, cellule endoteliali escrescenza del sangue (BOECs) tra passaggi 5 e 15 sono state utilizzate. BOECs sono stati isolati dai volontari sani con una sequenza VWF wildtype utilizzando un metodo di riferimento in Starke et al. 22 in un modo simile a quello precedentemente descritto da Giove23.
  3. Rimuovere il supporto dopo 24 h e lavare le cellule con HBSS.
  4. Aggiungere 1 mL di medium senza siero (minimal essenziale crescita medio senza FBS) contenenti phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; 100 nM), non frazionata dell'istone (UH) e HK o HR (tutti a 25 µ g/mL) per le cellule per 2 h a 37 ° C (5% CO2).
    Nota: Questa concentrazione dell'istone era basata su rapporti precedenti in vitro citotossicità di Xu et al. 24 e Abrams et al. 25 che usato 50 µ g/mL.
  5. Raccogliere il mezzo dopo 2 h e conservare a-20 ° C fino all'analisi.

2. VWF quantificazione di enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA)

  1. Rivestire una micropiastra con 100 µ l di rivestimento anticorpo contenente del policlonale anti-VWF di 10 µ g/mL di tampone (10mm bibasico cloruro di sodio fosfato di sodio e 145 mM, pH 7,2) durante la notte a 4 ° C.
  2. Lavare la piastra tre volte con 250 µ l di tampone di lavaggio (fosfato di sodio bibasico 10 mM, 500 mM di cloruro di sodio e 0.1% Tween 20, pH 7,2).
  3. Diluire i campioni medi 1:2 e 1:4 con tampone di lavaggio e utilizzare plasma di riferimento normali per una curva standard, iniziando da un 01:10 diluizione.
  4. Piastra di 100 µ l dei campioni diluiti e norme durante la notte a 4 ° C.
  5. Lavare la piastra tre volte con 250 µ l di tampone di lavaggio.
  6. Aggiungere 100 µ l di anti-VWF diluito, anticorpo di rilevazione HRP-coniugato (1,1 µ g / µ l di tampone di lavaggio) alla piastra e incubare per 1 h a temperatura ambiente.
  7. Lavare la piastra ed incubare per 10 min con O-fenilendiammina dicloridrato (OPD) reagente, secondo le istruzioni del produttore.
  8. Fermare la reazione con 100 µ l di 1 M H2così4 e leggere la piastra a 492 nm.

3. fase solida istone-VWF analisi obbligatoria

  1. Rivestire una micropiastra con gli istoni diluiti in 0,5% sodio desossicolato 50mm carbonato soluzione tampone (pH 9,6) a 10 µ g/mL durante la notte a 4 ° C.
  2. Lavare la piastra tre volte con 250 µ l di PBS supplementato con 0.1% Tween 20, incubare per 10 minuti tra i lavaggi.
  3. Bloccare la piastra con 200 µ l di PBS completati con 0.1% Tween 20 e 1% albumina di siero bovino (BSA) per 1 h a temperatura ambiente.
  4. Ripetere il punto 3.2.
  5. Diluire in serie derivati dal plasma umano VWF/fattore VIII complesso da 200 mU/mL a 25 mU/mL in tampone salino (cloruro di sodio di 10 mM fosfato di sodio bibasico, 500mm e 0.1% Tween 20, pH 7,2). Aggiungere 100 µ l alla piastra per 2 h a temperatura ambiente.
  6. Ripetere il punto 3.2.
  7. Rilevare l'associazione di sindrome di Raynaud Histone immobilizzato utilizzando 100 µ l di una soluzione contenente PBS-0.1% ' Tween 20 e 1:1,000 coniglio anticorpo policlonale anti-VWF coniugato a HRP per 1 h a temperatura ambiente.
  8. Ripetere il punto 3.2.
  9. Incubare la piastra per 30 min con 100 µ l di reagente OPD e interrompere la reazione con 100 µ l di 1 M H2così4. Misurare la densità ottica a 492 nm.

4. cellule endoteliali sul flusso Chambers di semina

  1. Caricare 0,5 mL di tampone di collagene-rivestimento (descritto al punto 2.1) in una siringa da 1 mL Luer-lock.
  2. Ruotare l'estremità Luer-lock della siringa sul serbatoio di una diapositiva di camera di flusso.
  3. Spingere lentamente lo stantuffo fino a quando l'intera corsia è rivestita e ciascun serbatoio è pieno. Ripetere per ogni corsia e incubare la camera a 37 ° C per 24 h.
  4. Aspirare il buffer di collagene-rivestimento con una pipetta 200 μL. Caricare un'altra siringa da 1 mL HBSS e premere lo stantuffo lentamente per lavare ogni corsia della camera del flusso. Aspirare il lavaggio con una pipetta 200 μL all'estremità opposte della camera del flusso. Ripetere due volte.
  5. Circa 100 µ l di una soluzione di 3 x 106 cellule/mL delle cellule endoteliali (BOEC) nel medium di crescita con 10% FBS sulla corsia di una camera di flusso.
    Nota: La densità di semina delle cellule endoteliali supera la capacità della camera. Questo è per garantire la copertura massima del canale; cellule non aderenti vengono rimossi nel passaggio per i lavaggi successivi.
  6. Incubare la camera a 37 ° C per 24 h. cambiamento medio ogni 8-12 h utilizzando siringhe Luer-lock (come descritto al punto 4.4). Assicurarsi che non siano nessun bolle visibile nei vicoli.

5. isolare le piastrine da sangue umano intero

  1. In un armadietto con un ago 30 G di sicurezza biologica, aggiungere 300 µ l di tampone acido citrato destrosio (citrato trisodico 85 mM, 111 mM D-glucosio e acido citrico di 71 mM, pH 4.5) per un additivo-libero 3 mL sangue raccolta vacutainer.
  2. Raccogliere sangue intero da volontari sani (gratuito da anti-piastrine e non-steroidei anti-infiammatori per sette giorni) mediante prelievo venoso (tre tubi da 3 ml), a seguito di un protocollo simile a quello pubblicato da Bernardo et al.26.
  3. Scartare il primo tubo, come il danno iniziale del tessuto connesso con l'iniezione in vena può causare l'attivazione piastrinica spontanea.
  4. Capovolgere delicatamente la consegnate tre volte per mescolare il sangue con l'anticoagulante.
  5. Centrifugare la consegnate a 150 x g per 15 min a 24 ° C (temperatura ambiente).
  6. Rimuovere lentamente il plasma ricco di piastrine (surnatante) con una pipetta in una cappa di sicurezza biologica e attentamente trasferirlo in una provetta conica da 15 mL. Trasferire il volume ricco di piastrina di ogni vacutainer una singola provetta conica per evitare potenziale inter-attivazione.
    Nota: Isolamento delle piastrine deve essere eseguita in un armadietto per prevenire la contaminazione batterica e potenziali della piastrina artificiale e/o attivazione endoteliale di sicurezza biologica.
  7. Centrifugare le provette coniche a 900 x g per 10 min a 24 ° C (temperatura ambiente) a pellet le piastrine.
  8. Pipettare e scartare il surnatante della piastrina-poveri.
  9. Lavare la pallina con attenzione con 1 mL di tampone di citrato-glucosio-sodio (CGS) (citrato di sodio 13 mM, 30 mM D-glucosio e 120 mM di cloruro di sodio, pH 7.0).
    Nota: Le piastrine apparirà nelle formazioni di wisp-come quando il buffer CGS viene aggiunto e il pellet è risospeso delicatamente. Nei campioni contaminati da attivazione piastrinica, le piastrine non saranno facilmente Risospendere e appariranno disomogeneo.
  10. Una volta completamente risospeso, centrifugare i campioni a 900 x g per 10 min a 24 ° C (temperatura ambiente).
  11. Rimuovere il tampone di lavaggio CGS e risospendere il pellet in 3 mL di tampone di Tyrode (cloruro di sodio 138 mM, 5,5 mM D-glucosio, bicarbonato di sodio di 12mm, 2,9 mM di cloruro di potassio e fosfato di sodio bibasico 0,36 mM, pH 7.4). Garantire la completa risospensione delle piastrine e, se si osservano aggregazioni, scartare il campione.
  12. Aggiungere 1,5 µ l da un 20 mM DiOC6 soluzione di riserva (dissolvenza 57,25 mg in 5 mL di metanolo) in ogni provetta conica da 3 mL di piastrine lavate per una concentrazione finale di 1 µM.
    Nota: DIOC6 è una tintura mitocondriale fluorescente verde utilizzata in questo esperimento alle piastrine di etichetta.
  13. Aliquotare 1 mL della soluzione delle piastrine lavate a tre provette per microcentrifuga da 1,5 mL.
    Nota: Il volume piastrinico richiesto per questo esperimento è calcolato in base alle dimensioni del vano di flusso, la sollecitazione di taglio desiderata e la lunghezza dell'esperimento (passo 6.5). Questo protocollo può essere regolato al cambiamento delle condizioni per assicurare che non c'è abbastanza volume per flusso del fluido.
  14. Utilizzare le piastrine lavate entro 2 h di isolamento.

6. apparato Portacella

  1. Attaccare un pezzo di tubo (diametro interno di 1,6 mm) ad un connettore Luer gomito maschio ad una estremità e un femmina adattatore Luer lock a altra in silicone sterile 70 cm.
  2. Collegare la femmina adattatore Luer lock collegato al tubo per una siringa da 20 mL.
  3. Ripetere i passaggi da 6.1 e 6.2 due volte per generare tre connessioni siringa identiche.
  4. Utilizzare una pompa a siringa per generare il flusso del fluido. Le seguenti impostazioni nella pompa a siringa di ingresso: diametro interno del tasso di flusso e siringa.
    Nota: Una siringa da 20 mL ha un diametro interno di 19,55 mm. La portata è calcolata in base la sollecitazione di tasso/cesoia di taglio desiderato e le dimensioni della camera del flusso. Per la camera di flusso utilizzata nello studio corrente, per raggiungere 1 dine/cm2 (osservati in taglio basso venoso), è necessaria una portata di 9,37 µ l/min. A causa di prova che collega gli istoni a trombosi venosa, è selezionata una distorsione venosa moderata di 4,45 dyn/cm2 . Anche questo si basa sul presupposto che il buffer ha una viscosità simile all'acqua. La portata è quindi pari a 41,7 µ l/min. equazioni utilizzate per calcolare che la portata per diverse dimensioni della camera di flusso può essere trovata alla:
    1. Impostare la pompa per prelevare fluido utilizzando l'opzione pulsante nella pompa a siringa.
  5. Caricare le tre siringhe collegate alla tubazione della pompa siringa e fissare saldamente tra parentesi quadre le siringhe e tuffatori.
  6. Allegare un gomito maschio Luer a entrambe le estremità di un secondo pezzo di 20 cm di tubo in silicone sterile.
  7. Collegare un gomito Luer un ago calibro 18 smussato.
  8. Ripetere due volte, creando tre sistemi di aspirazione identico per le tre corsie della camera del flusso.
    Nota: Il tubo in silicone e Luers può essere lavato con candeggina al 10% seguita da acqua distillata prima di riutilizzarli. Non si consiglia di riutilizzare gli alloggiamenti di flusso.

7. microscopio impostazioni

  1. Utilizzare un microscopio di disco rotante dotato di un palco completamente automatizzato. Eseguire l'illuminazione con un lancio di laser che fornisce 405, 458, 491, 543 e 633 nm laser linee. Catturare tutte le immagini con un obiettivo X 20. Regolare tutti i parametri con il software di analisi (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf).
  2. Selezionare le impostazioni di canale (filtro di emissione: 520/35), con eccitazione a 491 nm, per l'acquisizione. Impostare l'elettrone moltiplicando charge coupled device ad un guadagno di elettrone-moltiplicando di 150, con un tempo di esposizione di 200 ms, per ottenere l'intervallo di dati dinamica completa.
    Nota: Le piastrine sono etichettate con un colorante fluorescente verde, DiOC6, con massimi di lunghezza d'onda (eccitazione, 482 nm; emissione, 504 nm).
  3. Regolare la potenza del laser nm 491 al 20%.
  4. Segnare il centro di tutte e tre le corsie e selezionare 1 μm per gamma z e 0,5 μm per dimensione del passo. Selezionare il numero di intervalli di tempo (cioè, durata) e il tempo tra le immagini (cioè, intervallo) per acquisire un'immagine ogni 10 s; Selezionare "60 punti di tempo" per ogni diapositiva. Impostare il microscopio per catturare immagini da tre corsie e salvarli in una cartella designata esperimento.
    Nota: Poiché la camera di flusso ha tre corsie, necessario alternare le tre posizioni di catturare le immagini al microscopio.

8. sindrome di Raynaud-PIASTRINOGENESI String

  1. Rimuovere il terreno di coltura dalla camera di flusso (dal passaggio 4) utilizzando la stessa tecnica come descritto al punto 4.4.
  2. Aggiungere 100 µ l di entrambi istamina (25 µM), PMA (100 nM), UH, HK o HR (tutti a 25 µ g/mL) diluito in medium senza siero (come descritto al punto 1.4) per stimolare il monostrato BOEC per 15 min a temperatura ambiente O2Co2.
    Nota: Anche se non necessario per il rilascio VWF, eseguendo questa stimolazione a 37 ° C migliorerà VWF esocitosi27.
  3. Garantire che uno dei tre corsie separate della camera del flusso rimangono non trattate come un controllo sperimentale.
  4. Rimuovere il supporto utilizzando una siringa da 1 mL e sostituirlo con 100-200 µ l di PBS per lavare secretagogues fuori il monostrato endoteliale.
  5. Montare la camera di flusso su uno stativo di diapositiva utilizzando clip vascolari per fissare la camera a posto.
  6. Collegare il connettore Luer maschio disponibile sull'estremità del tubo di 70 cm (collegato alla siringa) al serbatoio della camera del flusso. Ripetere per le due altre flusso camera corsie.
  7. Avviare la pompa a siringa per rimuovere il lavaggio con PBS. Pipetta ulteriori PBS nel serbatoio dell'alloggiamento di flusso avversaria per garantire che le corsie non funzionare a secche.
  8. Osservare il sistema di flusso per flusso equivalente attraverso tutte le tre corsie e quindi sospendere la pompa a siringa.
  9. Selezionare un'area di catturare le immagini in circa la metà di ogni corsia, in più o meno la stessa zona fra gli esperimenti.
    Nota: La persona che gestisce il microscopio può essere accecata delle condizioni sperimentali. Questo passaggio garantisce che il microscopio è focalizzato prima della portata delle piastrine (vedere il passaggio 7).
  10. Allegare un accoppiatore femmina luer per una siringa da 5 mL e poi per il connettore luer maschio libero (passo 6,8) e immergere l'ago smussato nel tubo del microcentrifuge 1,5 mL contenente la soluzione di piastrine lavate (passo 5,13). Disegnare lentamente la soluzione piastrinica attraverso la tubazione per non garantire bolle d'aria all'interno del sistema.
  11. Rimuovere la siringa da 5 mL e collegare il Luer maschio al serbatoio aperto della camera del flusso. Ripetere per tre corsie.
  12. Riavviare la pompa a siringa e catturare le immagini durante il flusso della piastrina utilizzando le impostazioni di microscopio e protocollo dal passaggio 7 per 10 min al buio.
  13. Dopo 10 min, staccare il tubo di aspirazione del serbatoio di camera di flusso il Luer e riempire il serbatoio con PBS per mantenere il flusso sopra il monostrato endoteliale.

9. VWF-piastrine String quantificazione

Nota: Il flusso continuo di PBS è necessaria per mantenere l'allungamento di stringa VWF-piastrine per analisi di immagine. Cessazione di flusso comporterà il VWF diventando globulare e comprometterà la quantificazione di stringa VWF-piastrine. È necessario rabboccare ogni serbatoio con PBS durante la cattura dell'immagine. HBSS può sostituire PBS se riducendo la cella o distacco è osservato durante questo passaggio.

  1. Inizio con il primo vicolo, catturare 10 immagini per ogni diapositiva senza sovrapposizione utilizzando un 20 X obiettivo obiettivo intorno metà della diapositiva. Ripetere questa operazione per ogni corsia.
    Nota: Le aree che circondano i serbatoi dovrebbero essere evitate a causa della turbolento shear stress.
  2. Utilizzando il software di elaborazione delle immagini, regolare la luminosità facendo clic su "Immagine", "Regola" e "Luminosità/contrasto". Trascinare la barra di scorrimento fino a quando le piastrine aderite possono essere visti abbastanza bene per quantificazione.
  3. Registrare una stringa di VWF-piastrine quando tre o più allineate le piastrine sono osservate nell'immagine. Contare tutte le stringhe di VWF-piastrine in un'immagine. Ripetere per tutte le 10 immagini e media per l'esperimento.
    Nota: La persona che effettua la quantificazione può essere accecata delle condizioni sperimentali. Non è necessario co-macchia per VWF, come questo è stato confermato da studi indipendenti8,28,29.
  4. Ripetere l'esperimento un minimo di tre volte per valutare ogni secretagogo.

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Risultati

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Per valutare direttamente l'effetto degli istoni sul VWF rilascio dalle cellule endoteliali, siamo esposti confluenti BOECs medium privo di siero contenente PMA (controllo positivo), UH, HR e HK per 2 h. Abbiamo mostrato che HK ha indotto un aumento di 2 volte in proteina VWF (FvW: AG) nel mezzo delle cellule endoteliali trattate (Figura 1). È interessante notare che, quando BOECs sono stati stimolati con UH e HR, c'è stato meno FvW: AG rilevato in mezzo più ...

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Discussione

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Mentre la rilevanza fisiologica di VWF-piastrine stringhe rimane discutibile a causa della loro rapida dissoluzione in presenza di VWF-fendendo proteasi ADAMTS13, servono come modello quantificabili in vitro di reclutamento della piastrina di VWF un sito all'indirizzo che potrebbe formare un embolo in presenza di localizzato aumenti nei livelli di istone5. Inoltre, nelle patologie carente ADAMTS13 attività-tale come purpura thrombocytopenic thrombotic (TTP) - o in microambienti infiammato...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Alison Michels è un destinatario di un Frederick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship da istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR). Laura L. Swystun è il destinatario di una borsa di studio CIHR. David Lillicrap è il destinatario di un Canada Research Chair in Hemostasis molecolare. Questo studio è stato finanziato in parte da un CIHR sovvenzione (MOP-97849) di funzionamento.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Idrogrammi non frazionati di vitello-timo (UH)Worthington BiochemicalHLYRecostituito in terreno siero-ridotto (5 mg/mL)
Isotoni ricchi di lisina vitello-timo (HK)Sigma-AldrichH5505Ricostituito in terreno siero-ridotto (5 mg/mL)
Isotoni ricchi di arginina -timo di vitello (HR)Sigma-AldrichH4830Ricostituito in terreno siero-ridotto (5 mg/mL)
Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma-AldrichP8139Ricostituito in DMSO (20 mM)
IstaminaSigma-AldrichH7125-1GRicostituito in acqua (50 mg/mL)
3,3' Ioduro di diexilossaacarbocianina (DiOC6)InvitrogenD273Ricostituito in metanolo (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating AntibodyDAKOA0082Per VWF ELISA
Anticorpo di rilevamento anti-VWF di coniglio, coniugatoHRP DAKOP0026Per test di legame VWF ELISA e istone-VWF
Nunc MaxiSorp a fondo piatto a 96 pozzettieBioscience44-2404-21Per il saggio di legame istone-VWF
Immulon 4 HBX Microtitolazione a fondo piatto Piastre a 96 pozzettiThermo Scientific3855Per VWF ELISA
Humate-PCSL BehringN/AComplesso umano di von Willebrand/fattore VIII derivato dal plasma
Plasma di riferimento normalePrecisione BioLogicCCNRP-05Per VWF ELISA
curva standard O-fenilendiammina dicloridrato (OPD) reagenteSigma-AldrichP8287Prodotto equivalente disponibile tramite ThermoFisher Scientific (numero di catalogo: 34006)
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Per la coltura e l'iniziale semina di BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)ThermoFisher Scientific14025092
Collagene a coda di ratto di tipo 1Corning354236
Gibco Opti-MEM I Terreni a siero ridottoThermoFisher Scientific31985070Per la stimolazione delle cellule endoteliali
Microscopia METAMORPH Software per l'automazione e l'analisi delle immaginiMolecular DevicesN/A
BD Vacutainer Provette per la raccolta del sangue, senza additivoBD Biosciences366703
µ-Slide III 0.1 (camere di flusso)IbidiQuesto prodotto è stato interrotto. Si consiglia di utilizzare µ-Slide VI 0.1 (#80661) o 0.4 (# 80601) e di ricalcolare la portata e il volume piastrinico necessari per mantenere uno sforzo di taglio di 4,45 dyn/cm2
Tubo in silicone 1,6 mm ID: 5 m, sterilizzatoIbidi10842
Luer Lock Connettore femmina: polipropilene naturale, sterilizzatoIbidi10825
Gomito Luer Connettore maschio: polipropilene bianco, sterilizzatoIbidi10802
Ago smussato 18GBD Biosciences305180
Siringhe da 20 ml BDBiosciences302830
Pompa a siringaNew Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTMN/A
Quorum WaveFX- Microscopio a disco rotante 4X1Quorum TechnologiesN/A
Software di elaborazione delle immaginiImageJN/A

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, aB., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel - Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473(2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384(2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend'homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

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