In questo articolo, descriviamo un metodo per valutare endoteliale von Willebrand fattore rilascio e la successiva della piastrina catturare sotto sollecitazione di taglio fluido in risposta a stimoli infiammatori, utilizzando un sistema di alloggiamento del flusso in vitro .
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Articolo metodologico
Indagando von Willebrand fattore patofisiologia utilizzando un modello di flusso di camera di von Willebrand Factor-PIASTRINOGENESI. String
In questo articolo
Sommario
Abstract
Fattore di von Willebrand (VWF) è un fattore di coagulazione di glicoproteina multimerica che media l'adesione della piastrina e l'aggregazione in siti di danno endoteliale e che trasporta il fattore VIII nella circolazione. VWF è sintetizzato dalle cellule endoteliali e viene rilasciato sia costitutivamente nel plasma o viene memorizzato in organelli specializzati, chiamati corpi di Weibel-Palade (disfunzione), per il rilascio su richiesta in risposta alla sfida emostatica. Stimoli proinfiammatori e procoagulant possono indurre rapidamente WPB esocitosi e rilascio VWF. La maggior parte del VWF rilasciato dalle cellule endoteliali circola nel plasma; Tuttavia, una proporzione di sindrome di Raynaud è ancorata alla superficie delle cellule endoteliali. In condizioni di taglio fisiologico, endoteliali ancorato VWF possibile associare alle piastrine, formando una stringa di VWF-piastrine che può rappresentare il nidus della formazione di trombi. Un sistema dell'alloggiamento di flusso può essere utilizzato per osservare visivamente il rilascio di VWF da cellule endoteliali e la successiva della piastrina catturare in un modo che è riproducibile e pertinenti alla patofisiologia della formazione dell'embolo VWF-mediata. Utilizzando questa metodologia, le cellule endoteliali sono coltivate in una camera di flusso e sono successivamente stimolate con secretagoghi per indurre esocitosi WPB. Piastrine lavate sono perfusi quindi sopra l'endotelio attivato. Le piastrine sono attivate e successivamente associare a stringhe di VWF allungate in direzione di flusso del fluido. Usando gli istoni extracellulari come stimolo procoagulante e proinflammatory, abbiamo osservato formazione aumentata di stringa VWF-piastrine sulle cellule endoteliali istone-trattati rispetto alle cellule endoteliali non trattate. Questo protocollo descrive una valutazione quantitativa, visual e in tempo reale di attivazione dell'interazione VWF-piastrine in modelli di trombosi ed emostasi.
Introduzione
La trombosi è delle cause principali di mortalità nel mondo1 e può svilupparsi in risposta todysregulated generazione della piastrina attivazione e trombina in entrambe le arterie varicosee. I livelli del plasma di sindrome di Raynaud sono un regolatore chiave della coagulazione del sangue, per cui bassi livelli (< 50%) provocare i disturbi emorragici conosciuto come von Willebrand (VWD) la malattia2 e livelli elevati (> 150%) sono associati con un rischio aumentato di venosa3 e trombosi arteriosa4 .
Sindrome di Raynaud è una glicoproteina multim....
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Protocollo
Questi studi sono stati approvati dalla University, Canada ricerca etica Consiglio della Regina.
1. endothelial delle cellule stimolazione
-
Collagene-cappotto una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti.
- 24 ore in anticipo, cappotto una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti a 37 ° C con 1 mL di collagene (50 µ g/mL del ratto coda collagene di tipo 1 con 0,02 M di acido acetico glaciale) del buffer.
- Lavare i pozzetti due volte con 2 mL di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS).
Nota: Piastre possono essere avvolto in carta stagnola e memorizzati in un sacchetto di plastica ermetico a 4 ....
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Risultati
Per valutare direttamente l'effetto degli istoni sul VWF rilascio dalle cellule endoteliali, siamo esposti confluenti BOECs medium privo di siero contenente PMA (controllo positivo), UH, HR e HK per 2 h. Abbiamo mostrato che HK ha indotto un aumento di 2 volte in proteina VWF (FvW: AG) nel mezzo delle cellule endoteliali trattate (Figura 1). È interessante notare che, quando BOECs sono stati stimolati con UH e HR, c'è stato meno FvW: AG rilevato in mezzo più .......
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Discussione
Mentre la rilevanza fisiologica di VWF-piastrine stringhe rimane discutibile a causa della loro rapida dissoluzione in presenza di VWF-fendendo proteasi ADAMTS13, servono come modello quantificabili in vitro di reclutamento della piastrina di VWF un sito all'indirizzo che potrebbe formare un embolo in presenza di localizzato aumenti nei livelli di istone5. Inoltre, nelle patologie carente ADAMTS13 attività-tale come purpura thrombocytopenic thrombotic (TTP) - o in microambienti infiammato.......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Alison Michels è un destinatario di un Frederick Banting e Charles Best Canada Graduate Scholarship da istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR). Laura L. Swystun è il destinatario di una borsa di studio CIHR. David Lillicrap è il destinatario di un Canada Research Chair in Hemostasis molecolare. Questo studio è stato finanziato in parte da un CIHR sovvenzione (MOP-97849) di funzionamento.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Idrogrammi non frazionati di vitello-timo (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Recostituito in terreno siero-ridotto (5 mg/mL) |
| Isotoni ricchi di lisina vitello-timo (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Ricostituito in terreno siero-ridotto (5 mg/mL) |
| Isotoni ricchi di arginina -timo di vitello (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Ricostituito in terreno siero-ridotto (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Ricostituito in DMSO (20 mM) |
| Istamina | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Ricostituito in acqua (50 mg/mL) |
| 3,3' Ioduro di diexilossaacarbocianina (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Ricostituito in metanolo (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | Per VWF ELISA |
| Anticorpo di rilevamento anti-VWF di coniglio, coniugato | HRP DAKO | P0026 | Per test di legame VWF ELISA e istone-VWF |
| Nunc MaxiSorp a fondo piatto a 96 pozzetti | eBioscience | 44-2404-21 | Per il saggio di legame istone-VWF |
| Immulon 4 HBX Microtitolazione a fondo piatto Piastre a 96 pozzetti | Thermo Scientific | 3855 | Per VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Complesso umano di von Willebrand/fattore VIII derivato dal plasma |
| Plasma di riferimento normale | Precisione BioLogic | CCNRP-05 | Per VWF ELISA |
| curva standard O-fenilendiammina dicloridrato (OPD) reagente | Sigma-Aldrich | P8287 | Prodotto equivalente disponibile tramite ThermoFisher Scientific (numero di catalogo: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | Per la coltura e l'iniziale semina di BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Collagene a coda di ratto di tipo 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Terreni a siero ridotto | ThermoFisher Scientific | 31985070 | Per la stimolazione delle cellule endoteliali |
| Microscopia METAMORPH Software per l'automazione e l'analisi delle immagini | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Provette per la raccolta del sangue, senza additivo | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (camere di flusso) | Ibidi | Questo prodotto è stato interrotto. Si consiglia di utilizzare µ-Slide VI 0.1 (#80661) o 0.4 (# 80601) e di ricalcolare la portata e il volume piastrinico necessari per mantenere uno sforzo di taglio di 4,45 dyn/cm2 | |
| Tubo in silicone 1,6 mm ID: 5 m, sterilizzato | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connettore femmina: polipropilene naturale, sterilizzato | Ibidi | 10825 | |
| Gomito Luer Connettore maschio: polipropilene bianco, sterilizzato | Ibidi | 10802 | |
| Ago smussato 18G | BD Biosciences | 305180 | |
| Siringhe da 20 ml BD | Biosciences | 302830 | |
| Pompa a siringa | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- Microscopio a disco rotante 4X1 | Quorum Technologies | N/A | |
| Software di elaborazione delle immagini | ImageJ | N/A |
Riferimenti
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
- Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (....
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Ristampe e permessi
