Un protocollo per la quantificazione della proteina in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia automatizzata immuno-MALDI (iMALDI) è presentato.
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Articolo metodologico
Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)
In questo articolo
Sommario
Abstract
Spettrometria di massa (MS) è una delle tecnologie più comunemente utilizzate per la quantificazione di proteine in campioni complessi, con eccellente specificità come risultato la rilevazione diretta del rapporto massa / carica di ogni molecola target. Tuttavia, proteomica basata su MS-, come la maggior parte delle altre tecniche analitiche, ha una polarizzazione verso analiti alta-abbondanza di misura, quindi è difficile da raggiungere limiti di rilevazione di bassa ng/mL o pg/mL in campioni complessi e questo è l'intervallo di concentrazione per molti malattia-relative proteine in biofluidi quali plasma umano. Per aiutare nella rilevazione di analiti di basso-abbondanza, immuno-arricchimento è stato integrato il saggio a concentrarsi e purificare l'analita prima misurazione MS, migliorando significativamente la sensibilità del test. In questo lavoro, la tecnologia di immuno - Assisted Laser Desorption/Ionization (iMALDI) è presentato per la quantificazione delle proteine e dei peptidi in biofluidi, basato su immuno-arricchimento su perline, seguito dalla misura di MALDI-MS senza previa eluizione. Gli anticorpi anti-peptide sono funzionalizzati su biglie magnetiche e incubati con campioni. Dopo il lavaggio, le perle vengono trasferite direttamente su una lastra di destinazione MALDI e i segnali sono stati misurati da un MALDI-tempo di volo (MALDI-TOF) strumento dopo la soluzione di matrice è stata applicata ai talloni. La procedura di preparazione del campione è semplificata rispetto ad altri saggi immuno-MS, e la misurazione di MALDI è veloce. La preparazione del campione intero è automatizzata con un liquido sistema, manipolazione con riproducibilità del migliorato e un throughput più elevato. In questo articolo, l'analisi di iMALDI è usata per determinare l'angiotensina peptide ho (Ang ho) concentrazione nel plasma, che è usato clinicamente come lettura di attività della renina plasmatica per lo screening di aldosteronismo primario (PA).
Introduzione
Spettrometria di massa è diventato uno strumento indispensabile in proteomica quantitativa. Spettrometria di massa in grado di determinare le masse delle proteine bersaglio o peptidi, quindi i segnali ottenuti analita possono essere altamente specifici rispetto ai test immunologici. Due metodi di ionizzazione electrospray e MALDI, sono più comunemente utilizzati per la rilevazione di proteine e peptidi1,2,3,4. Una sfida importante nella quantificazione della proteina basate su MS si trova nella rilevazione di bassa-abbondanza di proteine in ....
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Protocollo
gli importi dei reagenti descritti di seguito si basano sulla misurazione di 20 campioni di plasma paziente. Il protocollo presentato di seguito segue le linee guida dell'Università di Victoria ' Comitato etico ricerca umana di s.
1. generazione di Ang I nel Plasma umano
- scongelare i campioni di plasma (≥ 200 µ l) in una stanza temperatura dell'acqua del bagno per 5 min e poi mettere i campioni su ghiaccio fino a quando completamente sciolto.
- Trasferire 200 µ l di ogni campione di plasma manualmente per separare pozzetti di una piastra di profondo-pozzo (piatto del campione), di 1,1 mL e centrifugare la piast....
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Risultati
Una procedura automatizzata iMALDI per la misurazione Ang mi è mostrato nella Figura 1. Peptidi di destinazione (peptidi endogeni o peptidi da proteine digerite) sono arricchite il anti-peptide biglie magnetiche, e quindi le perle vengono trasferite ad una piastra di destinazione per la misura di MALDI. L'intera procedura è semplificata rispetto ad altre tecnologie di immuno-MS che richiedono ulteriori peptide eluizione passaggi. Automazione del dosaggio iMAL.......
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Discussione
Rispetto alla quantificazione di proteine convenzionali basati su MS, iMALDI utilizza anticorpi per arricchire gli analiti e purificarle da campioni complessi, rendendo quindi possibile quantificare le proteine o peptidi a basse concentrazioni. Un passo fondamentale nel protocollo iMALDI è l'immuno-arricchimento dei peptidi destinazione. Per questo scopo, è necessario selezionare anticorpi con alta specificità e affinità. In SISCAPA, è stato segnalato che affinità dell'anticorpo a 10-9 M o meglio sarebbe neces.......
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Dichiarazioni
C.H.B detiene il brevetto sulla tecnologia iMALDI.
Ringraziamenti
Ringraziamo il sostegno finanziario dal Genome Canada e Colombia britannica del genoma per operazioni (204PRO) e lo sviluppo della tecnologia (214PRO) attraverso la rete di innovazioni genoma (GIN). Ringraziamo la piattaforma di Drug Discovery presso l'Istituto di ricerca del McGill University Health Center per l'utilizzo dello strumento MALDI-TOF per le riprese. H.L. è grato per il sostegno da una borsa di studio post-dottorato dal National Science and Engineering Research Consiglio del Canada (NSERC). C.H.B è grato per il sostegno da Leading Edge Endowment Fund (LEEF). C.H.B. è grato per il sostegno della presidenza di McGill Segal in oncologia molecolare presso la ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Controllo sano del plasma umano | Biorecupero | HMPLEDTA2 | |
| Bicarbonato di ammonio | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Citrato di ammonio bibasico | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumina da albume d'uovo di gallina (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Acido etilendiamminotetraacetico | Sigma Aldrich | EDS | |
| Acido alfa-ciano-4-idrossicinnamico | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Fenilmetanosulfonilfluoruro | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Acido trifluoroacetico | Thermo Fisher Scientific | 85172 | grado LC-MS |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | Acqua di grado LC-MS |
| Fluka | 39253 | di grado LC-MS | |
| Fluka | 320099 | ||
| Tris(idrossimetil)amminometano | di grado LC-MS Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G sfere magnetiche | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μ m, 30 mg/mL |
| anti-Ang I anticorpo policlonale di capra | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat e SIS Ang I | sintetizzati presso l'Università di Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Sistema automatizzato di manipolazione dei liquidi | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo stazione di lavoro robotica |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 |
| magnete rotatore per tubi | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tubo rotatore |
| magnetico | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 magnete con gonna laterale |
| Magnete | VP Scientific | 771RM-1 | utilizzato per tirare le perline sul fondo del pozzo |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF strumento |
Riferimenti
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers fr....
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Ristampe e permessi
