Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.
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Articolo metodologico
Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni
In questo articolo
Sommario
Abstract
Calorimetria a scansione differenziale (DSC) è una tecnica potente per quantificare i parametri termodinamici che disciplinano biomolecolari pieghevole e interazione di legame. Questa informazione è fondamentale nella progettazione di nuovi composti farmaceutici. Tuttavia, molti ligandi farmacologicamente rilevanti sono chimicamente instabili alle alte temperature utilizzate nelle analisi DSC. Così, associazione di interazioni di misurazione è difficile perché le concentrazioni di ligandi e termicamente convertiti i prodotti sono in continua evoluzione all'interno della cellula del calorimetro. Qui, presentiamo un protocollo utilizzando ligandi termolabile e DSC per rapidamente ottenere informazioni termodinamiche e cinetiche sulla piegatura, l'associazione e ligando processi di conversione. Abbiamo applicato il nostro metodo per il DNA aptamero MN4 che associa la cocaina ligando termolabili. Utilizzando una nuova analisi di raccordo globale che i conti per la conversione di ligando termolabili, il set completo dei parametri di associazione e pieghevole si ottengono da un paio di esperimenti di DSC. Inoltre, ci mostra che la costante di velocità per la conversione di ligando termolabile può essere ottenuta con un solo set di dati supplementari DSC. Le linee guida per l'identificazione e l'analisi dei dati da diversi scenari più complessi è presentata, compreso irreversibile aggregazione della biomolecola, pieghevole lento, lento l'associazione e lo svuotamento rapido del ligando termolabile.
Introduzione
Calorimetria a scansione differenziale (DSC) è un metodo potente per quantificazione associazione biomolecolari e pieghevole interazioni1,2,3. I punti di forza della DSC includono la capacità di delucidare vincolante e pieghevole meccanismi e per produrre i corrispondenti parametri termodinamici2,3. Inoltre, la DSC può essere eseguita in soluzione in condizioni di quasi-fisiologiche e non richiede etichettatura di biomolecole o legante, ad esempio, con fluorofori, spin-etichette o isotopi nucleari
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Protocollo
1. preparazione del campione
- Purificare la biomolecola desiderato13.
Nota: Questo protocollo usi acquistati cocaina-associazione DNA aptamer MN4 dopo lo scambio contro 2 M NaCl, tre volte seguito da tre turni di acqua deionizzata utilizzando un filtro centrifugo con una membrana di cut-off di peso molecolare 3 kDa. - Sintetizzare e purificare, oppure acquistare il ligando termolabile desiderato13.
Nota: MN4 associa la cocaina ligando termolabili. MN4 si lega anche la chinina, che viene utilizzato come controllo negativo per thermolability di ligando a queste temperature sperimentale. - Pre....
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Risultati
Dati rappresentativi per il ligando termolabile DSC sono mostrati nella Figura 1. La posizione e l'altezza del picco-ligando termolabile sposta successivamente verso quella di biomolecole non associata come il ligando termolabile è esaurito con ogni scansione (Figura 1a). Il profilo di denaturazione gratuito è utilizzato come riferimento per l'endpoint di conversione ligando termolabile (Figura 1b). .......
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Discussione
Le modifiche e la risoluzione dei problemi
I dettagli dell'analisi raccordo globale utilizzato nella Figura 1 e Figura 2 sono stati descritti in precedenza4. Qui, descriviamo gli aspetti pratici dell'esecuzione e l'analisi di esperimenti di binding DSC con ligandi termolabili. Si noti che una previsione di DSC ottenuta per il ligando termolabile da solo viene sottratto dal ligando + biomolecola .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
R. W. H. V era sostenuta dalla McGill scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) programma di formazione in Bionanomachines. A. K. M. e P. E. J. sono stati sostenuti da borse di studio NSERC 327028-09 (A. K. M) e 238562 (E. J.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cloruro di sodio | Chem Impex | #00829 | |
| Sodio fosfato monobasico diidrato | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodio fosfato bibasico | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Acqua deioinizzata per biologia molecolare | Millipore | H20MB1001 | |
| 0,2 micron filtri sterili per siringhe | VWR | CA28145-477 | |
| Filtri centrifughi da 3 kDa | Millipore | UFC900324 | |
| Tubi per dialisi 0,5-1,0 kDa taglio | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Tubi in silicone | VWR | 89068-474 | |
| Tappi flangiati DSC in plastica | TA Instruments | 6111 | |
| Adattatore DNA MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaina | Sigma Aldrich | C008 | |
| Chinino | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimetro | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| software DSCRun | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Software NanoAnalyze | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
Riferimenti
- Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
- Privalov, P. L., Dragan, A. I.
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Ristampe e permessi
