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Articolo metodologico

Un modello di coltura cellulare di arterie di resistenza

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DOI:

10.3791/55992

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8 settembre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology and Biophysics, University of Virginia School of Medicine, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine, 3Department of Hematology, St. Jude Children's Research Hospital, 4Research Histology Core, University of Virginia School of Medicine

In questo articolo

Sommario

È descritto un modello di coltura cellulare di arterie di resistenza, permettendo per la dissezione delle vie nell'endotelio, muscolo liscio, o tra endotelio e muscolo liscio (bivio myoendothelial) di segnalazione. L'applicazione selettiva di agonisti o isolamento della proteina, microscopia elettronica o immunofluorescenza può essere utilizzata usando questo modello della coltura cellulare.

Abstract

La giunzione di myoendothelial (MEJ), un unico microdomain segnalazione nelle arterie della resistenza di piccolo diametro, esibisce localizzazione di proteine specifiche e processi di segnalazione che possono controllare il tono vascolare e della pressione sanguigna. Come è una proiezione da entrambi la cellula endoteliale o del muscolo liscio e a causa della sua piccola dimensione (in media, un'area di ~ 1 µm2), il MEJ è difficile da studiare in isolamento. Tuttavia, abbiamo sviluppato un modello di coltura cellulare chiamato vascolare delle cellule co-cultura (VCCC) che consente di in vitro MEJ formazione, polarizzazione delle cellule endoteliali e la dissezione dei processi nella parete vascolare di resistenza e proteine di segnalazione arterie. Il VCCC ha una moltitudine di applicazioni e può essere adattata a diversi tipi di cellule. Il modello è costituito da due tipi di cellule coltivati su lati opposti di un filtro con 0,4 µm pori in cui lo in vitro MEJs può formare. Qui descriviamo come creare il VCCC tramite placcatura delle cellule e l'isolamento di endoteliale, MEJ e frazioni di muscolo liscio, che quindi possono essere utilizzate per l'isolamento di proteine o attività saggi. Può essere fissato il filtro con strati di cellule intatte, embedded e sezionati per analisi immunofluorescente. Soprattutto, molte delle scoperte da questo modello sono stati confermati tramite arterie della resistenza intatto, sottolineando la rilevanza fisiologica.

Introduzione

Nelle arterie della resistenza di piccolo diametro, una sottile lamina elastica interna (IEL) separa endoteliali (EC) e cellule muscolari lisce (SMC). Le cellule possono progetto attraverso i fori in questa matrice elastica e connessioni dirette citoplasmatico attraverso gap junction canali1,2. Questa struttura unica è definita il bivio di myoendothelial (MEJ). Il MEJ è un piccolo (circa 0,5 µm x 0,5 µm, a seconda della base vascolare), proiezione cellulare composto principalmente di cellule endoteliali ma può provenire dal muscolo liscio anche3,4. Un numero di investigatori hanno dimostrato l'immensa complessità di reti che si verificano in modo selettivo a MEJ, rendendolo un luogo particolarmente importante per facilitare la segnalazione di bi-direzionale tra endotelio e muscolo liscio5 di segnalazione ,6,7,8,9,10.

Tuttavia, una dissezione meccanicistica di vie di segnalazione presso il MEJ è difficile in un'arteria intatta. Perché il MEJ è una proiezione cellulare, non è attualmente possibile isolare un in vivo MEJ da parete vascolare. Per questo motivo, è stato sviluppato il modello VCCC1 . D'importanza, il VCCC replica fisiologica morfologia endoteliale11 e polarizzazione di segnalazione tra l'apicale e MEJ porzioni della cella12. Era questo modello unico che hanno facilitato la scoperta che l'emoglobina alfa è in cellule endoteliali, polarizzata per il MEJ. Questo è in contrasto con le cellule endoteliali convenzionalmente coltivate che non esprimono emoglobina alfa13. Per i ricercatori interessati a endotelio microvascolare, può essere più opportuno utilizzare le cellule endoteliali che sono state coltivate in VCCC, particolarmente se l'intento è quello di sezionare le vie di segnalazione che si verificano nelle arterie della resistenza di piccolo diametro.

Usando un robusto inserto in plastica contenente un filtro con pori di diametro piccolo (0,4 µm di diametro) per tipi distinti delle cellule co-coltura due impedisce che le cellule migrano tra strati. Il risultato è una distanza di 10 µm tra le cellule, che è significativamente più lungo di in vivo, ma ancora molte delle caratteristiche in vivo di MEJs, tra cui la localizzazione della proteina e secondo messaggero segnalazione1 replica , 14. Inoltre, la VCCC consente per il targeting di cella specifica del tipo di segnalazione tramite l'aggiunta di un agonista o antagonista al compartimento cellulare specifico. Ad esempio, caricando la CE con BAPTA-AM di chelato del calcio e stimolando la SMC con fenilefrina14. A differenza di altre descrizioni di co-coltura modelli15,16,17,18,19,20,21, questo fornisce istruzioni su come isolare le frazioni distinte per mRNA e proteine, tra cui la frazione MEJ distinta all'interno dei pori del filtro. L'aggiunta di questa tecnica per il VCCC permette per indagine specifica dei cambiamenti nella localizzazione di mRNA o trascrizione22, fosforilazione della proteina12,23e proteina attività12. Questo articolo descriverà placcatura della CE in cima al filtro e SMC sul fondo, anche se è possibile alla cultura due tipi cellulari differenti conformazioni11,18,24.

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Protocollo

1. placcatura di cellule per la VCCC

  1. cultura grande 225 cm 2 fiaschi di CE e SMC a 37 ° C, fino al 70-90% confluenti in condizioni di sterilità. Garantire che vengano utilizzati più EC rispetto SMC; Se si utilizza CE umano primario e SMC, in genere 3 boccette grande della CE alla grande 1 boccetta di SMC.
    1. Utilizzare cellule primarie a passaggi più bassi e non utilizzare oltre passaggio 10. Scegliere i mezzi di coltura basato su cellule per essere co-coltivate. Per primaria coronarica umana CE, è necessario utilizzare supporti basali di EBM-2 CE con fattori di crescita EGM2 MV. Per SMC coronarica umana primaria, è necessario utilizzare SmBM SMC media basale con fattori di crescita SmGM-2. Prima dell'uso con cellule coltivate, aggiungere fattori di crescita ai media.
  2. Costruzione del VCCC giorno 1: Spray Petri di grandi dimensioni (150 mm) e coperchi con un disinfettante (ad es., Cavicide) e asciugare con un tovagliolo di carta o salviette privo di lanugine. Quindi spruzzare le capsule di Petri con 70% di etanolo (EtOH) e metterli nella cappa di aria secca.
  3. Aprire la piastra di inserti filtro (Vedi la Tabella materiali) in condizioni sterili e rivestire il lato SMC (lato inferiore del filtro) dell'inserto con soluzione di fibronectina. Tenendo l'inserto la piastra 6-ben fornita, dispensare la soluzione di fibronectina attraverso il lato fessure sul fondo della piastra, assicurandosi che la metà inferiore del filtro è coperto (non più di 1 mL).
  4. Dopo 30 min di trattamento con soluzione di fibronectina a temperatura ambiente nella cappa cultura cellulare, prendere inserti dalla piastra, vuoto qualsiasi soluzione in eccesso e Inverti, immissione nella parte inferiore la metà del piatto Petri pulita. Mettere da parte. Essere sicuri di non disturbare la membrana di inserto filtro quando l'aspirazione di soluzione in eccesso; Questo può essere evitato delicatamente inclinando la piastra, e aspirare la soluzione fuori dal bordo dell'inserto.
  5. Trypsinize un 225 cm 2 boccetta di SMC con 3 mL di soluzione di tripsina-EDTA X 2 pre-riscaldato, e una volta che le cellule hanno tolto la piastra, aggiungere 9 mL SMC media per neutralizzare la tripsina (3:1, media: tripsina). Trasferire in una provetta conica, mescolare bene e dispensare 10 µ l in un emocitometro per determinare il numero di cell.
    1. Il numero di cellule in 5x5 caselle (cioè, 18), moltiplicare questo valore per 10.000 per ottenere il numero di cellule in 1 mL (180.000). Quindi moltiplicare per 12 mL (volume totale della sospensione di cellule, SMC 2,16 milioni). Assicurarsi che ci siano abbastanza SMC a piastre il numero desiderato di pozzetti.
      Nota: ad esempio, 1, Beh, dovrebbe avere 75.000 SMC e così 18 pozzetti avrebbe totale 1,35 milioni di SMC. Dividere le celle 1,35 milioni necessari da 180.000 cellule per 1 mL e questo si traduce in 7,5 mL della sospensione delle cellule che sarà necessarie per la placcatura. Quindi calcolare il volume finale necessario (18 pozzetti x 750 µ l = 13,5 mL). Così, prendere 7,5 mL di sospensione cellulare, portare il volume fino a 13,5 mL con SMC media pre-riscaldato e mescolare bene.
  6. Piastra 750 µ l della sospensione delle cellule contenenti circa 75.000 SMC sulla parte inferiore di ogni filtro, facendo attenzione a non versare la soluzione media e cella. Mettere il coperchio sulla parte superiore e trasferire con cautela la capsula di Petri con gli inserti in incubatore a 37 ° C durante la notte.
    Nota: La densità di cella ottimale per altri tipi di cellule dovrà essere determinata empiricamente.
  7. Il giorno 2, riempire piatti puliti 6-pozzetti con 2 mL di fresco, pre-riscaldato SMC media. Rimuovere le piastre dall'incubatrice. Prendere gli inserti fuori uno alla volta e rimuovere il supporto di aspirazione, quindi porre nel piatto 6-pozzetti con SMC media.
  8. Cappotto il lato opposto del filtro (lato CE) con 1 mL di una soluzione di gelatina bovina di 0,5% per almeno 30 min a 37 ° C.
  9. Tripsinizzano la flask(s) di 2 cm 225 della CE con 3 mL di pre-riscaldato 2 X tripsina-EDTA (10x diluita in Dulbecco sterile ' s PBS) soluzione, con picchiettando il pallone per sollevare le cellule fuori la piastra di.
    Nota: Potrebbe essere necessario inserire nuovamente il pallone dell'incubatore a 37 ° C per 1-3 min.
    1. Una volta le cellule hanno tolto la piastra, aggiungere 9 mL CE media per neutralizzare la tripsina (3:1). Trasferire in una provetta conica, piscina insieme, mescolare bene e dispensare 10 µ l in un emocitometro per determinare il numero di cellulare.
      1. Il numero di cellule in 5x5 caselle (cioè, 60), moltiplicare questo valore per 10.000 per ottenere il numero di cellule in 1 mL (600.000). Quindi moltiplicare per 12 mL (volume totale della sospensione cellulare, CE 7,2 milioni). Assicurarsi che ci siano abbastanza CE a piastre il numero desiderato di pozzetti.
        Nota: Circa 360.000 CE sono necessari per pozzetto. Ad esempio, 18 pozzetti richiedono 6,48 milioni EC. Dividere le celle 6,48 milioni necessari da 600.000 CE / 1 mL e questo si traduce in 10,8 mL della sospensione delle cellule che sarà necessarie per la placcatura. Quindi calcolare il volume finale necessario (18 pozzetti x 18 mL = 1 mL). Così, prendere 10,8 mL di sospensione cellulare, portare il volume fino a 18 mL con pre-riscaldati media CE e Risospendere delicatamente.
  10. Piastra 1 mL di 360.000 CE sul lato superiore di ogni inserimento del filtro. Lasciare che le celle Incubare indisturbato a 37 ° C per mezzo di sostituire h. 24 il giorno 4. Raccolto il giorno 5.

2. Raccolta frazioni dalla VCCC

  1. eseguire l'isolamento in una stanza di 4 ° C e mantenere tutti gli strumenti su ghiaccio.
  2. Tenere a mente il numero di singoli inserti essere isolata e aggiungere tampone di lisi per un tubo da 50 mL con l'etichetta MEJ (per i filtri isolati). Quindi etichettare due piatti di 10 mm; uno per uno per SMC e CE.
  3. Regola il volume di tampone di Lisi a seconda di come concentrato deve essere lisato; per 15 inserti, 500 µ l di tampone di lisi per il tubo MEJ e 250 µ l in ogni capsula di Petri è consigliati.
  4. Lavoro con una piastra 6 inserti in un momento. Aspirazione fuori il mezzo di cella cultura cappuccio e poi trasporto in una camera fredda su ghiaccio.
    Nota: Le istruzioni seguenti sono ad 1 Inserire isolamento.
  5. Dispensare 10 µ l di PBS 1X sul fianco dell'inserto SMC.
  6. Utilizzare il sollevatore di cella per raschiare le cellule ad una estremità dell'inserto e trasferire le cellule dal sollevatore per la SMC di Petri che dispone di buffer di lisi in esso.
  7. Una volta che il sollevatore di cella ha toccato il buffer di lisi nel piatto, non permettono di toccare l'inserimento del filtro fino a quando è stato completamente spazzato via e asciugata su carta assorbente. Ripetere la raschiatura del filtro SMC almeno una o due volte per rimuovere completamente i restanti detriti cellulari SMC.
  8. Girare l'inserto sopra e dispensare 10 µ l di PBS 1X nel lato superiore/CE dell'inserimento del filtro. Ripetere i punti 2.6 e 2.7 con un raschietto di cella e la capsula di Petri CE.
  9. Raccogliere il rimanente cella e PBS liquame dal lato CE del filtro con una pipetta e trasferimento per il CE di Petri con tampone di lisi. Essere molto meticolosi nella raschiatura delle cellule fuori entrambi i lati del filtro da lasciare contaminazione minima CE/SMC nella frazione MEJ.
  10. Attentamente utilizzare il bisturi per tagliare fuori il filtro dall'inserto di plastica. A tale scopo di taglio 70-80% di esso dalla plastica e utilizzare pinze per tirare il filtro completamente fuori struttura dell'inserto in plastica. Mettere il filtro nel tubo conico di 50ml etichettato MEJ con buffer di lisi e assicurarsi che si siede nel buffer di lisi e rimane bagnato.
  11. Ripetere i passaggi di isolamento, in gruppi di 6, fino a quando non sono stati elaborati tutti degli inserti.
  12. Garantire che diversi gruppi di trattamento sono tenuti in piatti e tubi separati.
  13. Vortex la provetta conica da 50 mL MEJ in piena forza per 15 s o fino a ben miscelati. Rimuovere i filtri dal MEJ conica con le pinzette, trascinandoli lungo le pareti laterali del tubo da lasciare la massima quantità di proteine e di liquido nel tubo. Dopo questo punto, eliminare i filtri.
  14. Una volta che tutti i filtri sono stati rimossi dal tubo conico MEJ, fare un giro veloce (10-15 s a velocità max ~ 16.000 x g) in una centrifuga per estrarre tutto il liquido e le proteine alla parte inferiore del tubo. Trasferire il contenuto del tubo MEJ e i piatti CE e SMC Petri in provette da centrifuga separata, più piccola.
  15. Optional: trattare con ultrasuoni il contenuto delle provette MEJ/SMC/CE d'impostazione 4 per gli impulsi di tre 10 s su ghiaccio o omogeneizzare delicatamente a mano.
  16. Centrifugare a velocità max (~ 16.000 x g) 15 min a 4 ° C. Pipet fuori il surnatante e dosaggio lisato per contenuto proteico utilizzando il metodo di dosaggio bicinconinico.

3. Raccolta del VCCC per immunofluorescenza En Face

  1. incubazione il giorno 5 del VCCC, rimuovere gli inserti dall'incubatrice. Lavorando nella cappa di cultura cellulare, aspirare i SMC media da ciascuno dei pozzi più bassi dell'inserimento del filtro e sciacquare due volte con PBS 1X. Ripetere con il lato di CE.
  2. Mantenendo gli inserti intatti e nella piastra, aggiungere 4% paraformaldeide (PFA) per 10-20 min in camera cabina 4 ° C su un agitatore delicato. Lavare entrambi i lati del filtro inserto con PBS 1X per 5 min e ripetere due volte.
    Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.
  3. Eseguire le incubazioni di anticorpo bloccante, primaria e secondaria nella piastra, assicurare che entrambi i lati del filtro siano mantenuti nell'anticorpo + soluzione bloccante (9 mL di PBS, 25 µ l Triton X100, 50 mg albumina di siero bovino, 500 µ l di siero normale)
  4. Per montare il filtro in una diapositiva, taglia il filtro fuori l'inserto di plastica con un bisturi montata su un manico e posto su un vetrino da microscopio con mezzo di montaggio a.

4. Raccolta del VCCC per immunofluorescenza trasversale

  1. incubazione il giorno 5 del VCCC, rimuovere gli inserti dall'incubatrice. Aspirare i media da entrambi i lati del filtro inserto nella cappa di cultura delle cellule e sciacquare ogni lato del filtro due volte con PBS 1X.
  2. Mantenendo gli inserti intatti e la piastra a 6 pozzetti, aggiungere 4% PFA e incubare per una notte in una camera di cabina 4 ° C su un agitatore delicato.
    Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura.

5. L'incorporamento del VCCC per immunofluorescenza trasversale

  1. dopo filtro inserti sono stati corretti circa per 24 h a 4% PFA, trasferimento al 70% EtOH per almeno 24 h, ma fino a diverse settimane.
  2. Elaborare i filtri su un lungo (una notte) eseguito su un processore di tessuti automatizzato. Utilizzare il programma come segue: 70% EtOH per 30 min, 85% EtOH 30 min, 95% EtOH 30 min, 100% EtOH 30 min, 100% EtOH 45 min, 100% EtOH 45 min, xilene 30 min, xilene 30 min, xilene 45 min, 60 ° C paraffina 30 min, 30 min di paraffina 60 ° C , 45 min. di paraffina 60 ° C
  3. Dopo l'elaborazione, trasferire i filtri raccolti fino alla stazione di incorporamento in paraffina liquida, mantenendo il filtro nella cassetta.
  4. Rimuovere il filtro dal cassetto, attentamente con forcipe per tenerlo solo al bordo. Con le forbici, tagliare il filtro a metà, formando due semi-circolare, a forma di metà. Le 2 metà sulla parte piatto freddo della stazione incorporamento solo lungo abbastanza per riempire l'incorporamento della muffa con paraffina liquida laici ogni.
  5. Una volta riempito con paraffina liquida, molto brevemente toccare lo stampo incorporamento per il piatto freddo, quindi incorporare l'incorporamento della muffa (tagliata il lato giù) di ogni metà del filtro; ciò assicura che durante il sezionamento, uno tagli dal centro del filtro verso il bordo .
  6. Durante l'incorporamento, utilizzare pinze per tenere il filtro per prevenire le metà di cadere nella vicenda fino a quando la paraffina è abbastanza fresca per loro di stare da solo. Spostare lo stampo di incorporamento in un piatto freddo fino completamente solidificato.
    Nota: Blocchi su vassoi di ghiaccio di raffreddamento aiuta a prevenire le sezioni rugose.

6. Sezionamento e la macchiatura del VCCC per immunofluorescenza trasversale

  1. per i blocchi di paraffina sezionamento e far scorrere il montaggio: tagliare 5 µm sezioni, inserire le sezioni in bagnomaria a 42 ° C e raccogliere le sezioni utilizzando carichi positivamente diapositive. Quindi mantenere diapositive durante la notte nel forno a 42 ° C per asciugare.
  2. Prima di iniziare la procedura di reidratazione, cuocere le diapositive a 60 ° C per sciogliere la paraffina e aiutare aderire le sezioni VCCC alla diapositiva. Raffreddare brevemente, poi reidratare le diapositive attraverso due cambi di xilene, 100% EtOH, 95% EtOH, un cambio di 70% EtOH e due cambi di acqua distillata.
  3. Evitare metodi di ricupero dell'antigene che coinvolgono microwaving o riscaldamento come sezioni possono cadere fuori della diapositiva.
  4. Eseguire il blocco standard per 1 h a temperatura ambiente, quindi il pernottamento incubazione con anticorpo primario a 4 ° C, seguita da lavaggio passaggi e anticorpo secondario per 1 h a temperatura ambiente. Montare con i mezzi di montaggio e il vetrino coprioggetti.

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Risultati

Gli inserti filtro utilizzati per la VCCC hanno piccolo, 0,4 µm fori. Figura 1A, un'it faccia vista l'inserto del filtro VCCC, Mostra i pori in cui il MEJ può formare in vitro. Lo schema raffigura le cellule di muscolo liscio placcate sul lato inferiore del filtro un giorno prima che le cellule endoteliali sono placcate sul lato opposto (Figura 1B). Una volta che le cellule sono placcate, le frazioni di CE, MEJ ...

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Discussione

Il VCCC ha una serie di vantaggi in termini di ricapitolare MEJs in vitro, ma ci sono punti di discussione quando si determina se il VCCC può essere utilizzato per applicazioni specifiche. Ad esempio, se diversi tipi di cellule devono essere usati con questo modello, esso sarà necessario essere ottimizzato. Abbiamo usato cellule umane primarie, ma è possibile isolare le cellule da bovino aorte24, o topi wildtype o ad eliminazione diretta, e li usa a VCCC1,

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Heart, polmone ed Istituto del sangue concede 14PRE20420024 fellowship predoctoral R01088554, T32HL007284 e American Heart Association. Ringraziamo in particolare la St. Jude cellulare Imaging ha condiviso la ricerca Core, tra cui Randall Wakefield e Linda Horner per le immagini di microscopia elettronica, Adam Straub per assistenza con immagini rappresentative di immunofluorescenza e Pooneh Bagher per lei prezioso feedback sul protocollo manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Diametro 24 mm, 0,4 & micro; m Transwell Inserto filtrante a membrana in poliestereCorning3450Si tratta di una piastra a 6 pozzetti di inserti Pallone da
225 cmCorning431082
piastre a 6 pozzetti (senza inserti filtranti)Corning3506
Cellule endoteliali primarie dell'arteria coronarica umanaLonzaCC-2585
Cellule muscolari lisce primarie dell'arteria coronaria umanaLonzaCC-2583
EBM-2 EC Terreni basaliLonzaCC-3156
Fattori di crescita EC (EGM2 MV Quotazioni singole)LonzaCC-4147Aggiungere al terreno basale prima dell'uso
SmBM SMC Terreni basaliLonzaCC-3181
Fattori di crescita SMC (SmGM-2 SingleQuot)LonzaCC-4149Aggiungere al terreno basale prima dell'uso
0,5% Tripsina-EDTA 10XGibco15400-054Diluire a 2X con emocitometro dPBS sterile
VWR15170-208
grandi piastre di Petri per placcatura SMC (150 mm)Corning353025
Gelatina bovinaSigmaG-9382
Fibronectina umanaCorning3560085µ g/ml di fibronectina e conservare a -20
10x Soluzione salina tamponata di Hanks (HBSS)Gibco14065-056Diluire a 1x con acqua sterile
10x Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (dPBS)Gibco14200-075Diluire a 1x con acqua sterile
Bisturi curvo monouso (tagliente da 30 mm) con manicoAmazonMDS15210
ForcipeFisher17-467-201
Sollevatore cellulareCorning3008
Raschietto cellulareBD Falcon353085
provetta conica da 50 mLCorning352070
Piastre di Petri da 10 mmFalcon35-1008
Rneasy mini kitQiagen74104
Reagente per lisi dell'RNAQiagen79306
ParaformaldeideSigma158127Preparare una soluzione al 4% con dPBS etanolo al
70%Fisher04-355-305
Disinfettante cavicidaFisher131000
tampone per lisi proteica RIPASigmaR0278
Dismembranatore sonicoFisherModello 50
1x PBS per la raccolta di EC/SMC e immunocitochimicaGibco10010023non deve essere sterile
NomeAziendaNumero di catalogoComments
Embedding/Sectioning/Staining
ParaffinFisherP31-500
Processatore automatizzato di tessutiExcelsiorES
Stazione di inclusione + piastra freddaLeicaHistoCore Arcadia
Tissue Tek Accu-Edge Lama per microtomoVWR25608-961 o 25608-964
Vetrini per microscopioThermo Fisher22-230-900
Vetrinicoprioggetti Thermo Fisher12-548-5E
Thermo FisherP36931
NomeAziendaCatalog NumberComments
Other Solutions**Eseguire tutti i passaggi in condizioni sterili se si utilizza la soluzione su cellule vive
Acqua sterile dPBSper autoclave da sterilizzare. Utilizzando l'acqua sterile, fare DPBS (450 ml di acqua sterile: 50 ml 10X DPBS), miscelare e filtrare sterilizzare (0,2µ m filtro).
Concentrazione finale: 1X
HBSSda sterilizzare. Utilizzando l'acqua sterile, fare HBSS (450 ml di acqua sterile: 50 ml 10X HBSS), miscelare e filtrare per sterilizzare (0,2µ m filtro).
Concentrazione finale: 1X
madre di fibronectinaUtilizzare 50 ml di acqua sterile per fibronectina per fare una riserva di aliquote da 1 ml, quindi congelare fino al momento del bisogno
Concentrazione finale: 100µ g/mL
di fibronectina per rivestire il lato SMC del VCCCscongelare un'aliquota e aggiungere 1 mL di fibronectina (100µ g/mL) a 19mLs di 1X HBSS per raggiungere una concentrazione finale di 5µ g/mL.
Concentrazione finale: 5µ g/mL
2x Soluzione di tripsina EDTADiluire 10X 0,5% di tripsina-EDTA a 2X con 1X dPBS (40mL DPBS: 10mL 10X Tripsina) .
Concentrazione finale: 2X
Soluzione bloccante/anticorpale(9mL 1X PBS, 25mL Triton X100, 50mg di albumina sierica bovina, 500mL di siero normale)
Gelatina bovina per rivestire EC VCCCMescolare 0,5 g di gelatina bovina in 100 ml di acqua distillata. Autoclavare in autoclave prima del primo utilizzo e conservare a temperatura ambiente. Conservare in condizioni sterili.
Concentrazione finale: 0,50%
1x PBS per la raccolta di cellulenon deve essere sterile
acqua sterile per autoclavesoluzione

Riferimenti

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