Questo protocollo descrive la sintesi, la caratterizzazione e l'iniezione dei peptidi monomerici amiloide-β42 per la generazione di tossicità dell'amiloide in zebrafish adulto per stabilire un modello di malattia di Alzheimer, seguito da analisi istologiche e rilevazione di aggregazioni.
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Articolo metodologico
Modellazione dell'amiloide-β42 tossicità e neurodegenerazione nel cervello adulto di Zebrafish
In questo articolo
Sommario
Abstract
Morbo di Alzheimer (annuncio) è una malattia neurodegenerative in cui accumulo di amiloide tossico-β42 (Aβ42) peptidi conduce a degenerazione sinaptica, infiammazione, morte di un neurone debilitante e deficit dell'apprendimento. Gli esseri umani non possono rigenerare i neuroni persi nel caso di annuncio in parte a causa di alterata capacità proliferativa delle cellule staminali/progenitrici neurali (NSPCs) e ridotta neurogenesi. Di conseguenza, terapie rigenerative efficiente dovrebbero anche migliorare la proliferazione e neurogena capacità di NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) è un organismo rigenerativo, e possiamo imparare i programmi base molecolari con cui potremmo progettare approcci terapeutici per affrontare AD. Per questo motivo, la generazione di un modello di annuncio-come in zebrafish era necessaria. Utilizzando la nostra metodologia, possiamo introdurre derivati sintetici di Aβ42 peptide con capacità penetrante di tessuto nel cervello adulto zebrafish e analizzare la patologia della malattia e della risposta rigenerativa. Il vantaggio sopra i metodi esistenti o modelli animali è che zebrafish può insegnarci come un cervello dei vertebrati può rigenerare naturalmente e quindi ci aiutano a curare le malattie neurodegenerative umana meglio prendendo di mira NSPCs endogeno. Pertanto, il modello di tossicità dell'amiloide stabilito nel cervello adulto zebrafish può aprire nuove strade per la ricerca nel campo delle neuroscienze e della medicina clinica. Inoltre, la semplice esecuzione di questo metodo consente conveniente ed efficiente valutazione sperimentale. Questo manoscritto descrive la sintesi e l'iniezione di Aβ42 peptidi nel cervello di zebrafish.
Introduzione
Annuncio è una malattia cronica progressiva caratterizzata dalla perdita di neuroni e sinapsi in corteccia cerebrale1,2,3,4,5. I marchi di garanzia neuropathological classiche dell'annuncio sono la deposizione dei peptidi amiloidi e formazione del neurofibrillary tangles (NFTs)6. Le placche senili, noto anche come placche amiloidi, sono composti da peptidi dell'amiloide-β (Aβ) che formano strutture β-pieghettato in parenchima del cervello5. L'accumulo di Aβ42 ....
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Protocollo
questo protocollo è una procedura standard suggerita da orientamenti dell'Unione europea (2010/63) e della European Society for Fish modelli in biologia e medicina (EuFishBioMed) a Karlsruhe Insitute di Technology (KIT). Tutti i metodi descritti qui dopo sono stati approvati dalla Commissione etica (Landesdirektion Dresda; documento numero TVV-52/2015).
1. preparazione di Aβ42 Peptide
- Synthesize peptidi (Vedi tabella 1) usando la chimica standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) con 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3- tetramethyluronoiumhexafluorphosphate (HBTU) come il reagente di accoppiamento su un sintetizzat....
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Risultati
HPLC è stato utilizzato per purificare il peptide sintetizzato e spettrometria di massa è stata utilizzata per caratterizzare i peptidi purificati β amiloide. La colonna HPLC è stata riscaldata a 50 ° C per migliorare la separazione dei peptidi Aβ e tutte le frazioni sono stati raccolti. Per identificare il peptide sintetizzato correttamente, analisi di spettroscopia di massa è stata effettuata per tutte le frazioni. Il cromatogramma UPLC Mostra la purezza del composto. La frazione HPLC c.......
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Discussione
I peptidi dell'amiloide possono essere modificati per includere le variazioni di sequenza o vari tag. Per esempio, può essere generato un peptide amiloide uova strapazzato, e i peptidi possono essere etichettati con tag fluorescente al N-terminale dell'estremità del peptide o etichettati come vettore peptidi39. Allo stesso modo, in questo protocollo, il peptide vettore è il cellula-penetrante peptide TR a causa della sua efficacia a carico di trasporto profondo nel tessuto di cervello
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da DZNE e l'Associazione Helmholtz (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) e DFG (KI1524/6) (C.K.); e dall'associazione di Leibniz (SAW-2011-IPF-2) e BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Vorremmo anche ringraziare Ulrike Hofmann per sintesi peptidica e Nandini Asokan, Prayag Murawala e Elly Tanaka per aiuto durante le riprese la procedura.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Aminoacidi protetti da Fmoc | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germania) | Aminoacidi a base di Fmoc per la sintesi di peptidi in fase solida (SPPS) | |
| N,N,N′,N′-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU) | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germania) | RL-1030 | Activator |
| Oxyma | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germania) | RL-1180 | Supressore di racemizzazione |
| N,N-Diisopropiletilamina | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germania) | SOL-003 | Base |
| Dimetilformammide | IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germania) | SOL-004 | Solvente |
| N-Metilmorfolina | Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germania | A12158 | Base |
| 1-Idrossibenzotriazolo idrato (HOBT) | Sigma-Aldrich Co. LLC. ( St. Louis, MO, USA) | 157260 ALDRICH | Activator |
| Piperidine | MERCK KGaA (Darmstadt, Germania) | 822299 | Reagente di deprotezione Fmoc |
| Diclorometano (DCM) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germania) | 106050 | Solvente |
| Acido formico (FA) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germania) | 100264 | Componente tampone per HPLC |
| Acido trifluoroacetico (TFA) | MERCK KGaA ( Darmstadt, Germania) | 808260 | Reagente miscela Clevage |
| Triisopropilsilano (TIS) | MERCK KGaA (Darmstadt, Germania) | 233781 Reagente miscela ALDRICH | Clevage |
| Acetonitrile (per UPLC/LCMS) | Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH | 34967-1L | Solvente |
| acetonitrile (per HPLC) | VWR International Ltd, Inghilterra | 83639.320 | Solvente |
| Dietiletere | VWR International Ltd, Inghilterra | 23811.326 | Solvente per la precipitazione di peptidi |
| Ditiotritolo (DTT) | VWR International Ltd, Inghilterra | 0281-25G | Clevage Reagente per miscela |
| TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin | Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germania) | S30023 | Fase solida per |
| SPPS Sintesi di peptidi Siringhe da 5 ml con filtri inclusi | Intavis AG (Colonia, Germania) | 34.274 | Provetta di reazione per SPPS e per scissione dal filtro in fase solida |
| politetrafluoroetilene (PTFE) | Sartorius Stedtim (Aubagne, Francia) | 11806-50-N | Filtrazione di peptidi precipitati |
| Filtro per siringa in polivinilidenfluoruro (PVDF) | Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe | KC78.1 | Pre-filtrazione per |
| sintetizzatore di peptidi | Intavis, Colonia, Germania | ResPep SL | Sintetizzatore automatizzato di peptidi in fase solida |
| Water Alliance HPLC | Waters, Milford Massachusetts, USA | Waters 2998, Waters e2695 | Cromatografia liquida semi-preparativa in fase inversa ad alta pressione (HPLC) |
| PolymerX, dimensione delle perle 10μ m, 250x10 mm | Phenomenex Ltd. Germania | 00G-4328-N0 | Colonna HPLC in polistirene divinilbenzene poroso |
| Milli-Q Advantage A10, con filtro Milli-Q | EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA | LCPAK0001 | Sistema di purificazione dell'acqua |
| Unità di filtrazione | Sartorius Stedtim (Aubagne, Francia) | 16307 | Unità di filtrazione per precipitazione di peptidi |
| UPLC Aquity con rivelatore | UVWaters, Milford Massachusetts, USA | M09UPA 664M | Ultra HPLC analitica in fase inversa per LC-MS |
| ACQUITY UPLC BEH C18, dimensione del cordone 1,7 &; m, 50x2,1 mm | Waters, Milford Massachusetts, USA | 186002350 | Colonna analitica C18 |
| ACQUITY TQ Detector | Waters, Milford Massachusetts, USA | QBB908 | Spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (ESI-MS) |
| CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6 | Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germania | 16706, 101542 | Liofilizzatore con pompa a vuoto |
| Lettore di piastre Paradigm | Beckman Coulter | ||
| MESAB (etil-m-amminobenzoato metansolfonato) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Piastre di Petri | Sarstedt | 821.472 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Life Technologies, GIBCO | 10010-056 | |
| Ago | Becton-Dickinson | 305178 | |
| Microscopio da dissezione | Olympus, Leica, Zeiss | varia con il produttore | |
| Dumont Pinzette | World Precision Instruments | 501985 | |
| Gillies Pinze da dissezione | World Precision Instruments | 501265 | |
| Capillari per iniezione di vetro | World Precision Instruments | TWF10 | |
| PicoNozzle | World Precision Instruments | 5430-12 | |
| Pneumatico PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | |
| Illuminatore anulare; Guida luminosa anulare | Parkland Scientific | ILL-RLG | |
| criostato | Leica | CM1950 |
Riferimenti
- LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
- Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Serpell, L. C.
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Ristampe e permessi
