Articolo metodologico

Isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale umano

DOI:

10.3791/56021

⸱

14 settembre 2017

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'obiettivo del presente protocollo è quello di isolare le cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale. Alcune delle applicazioni includono l'utilizzo di queste cellule come biomarcatore per identificare i pazienti con rischio cardiovascolare, trattamento delle malattie ischemiche, e costrutti di creazione valvola vascolare e cuore tessutale.

Abstract

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L'esistenza di cellule progenitrici endoteliali (EPC) nel sangue periferico e il suo coinvolgimento nella vasculogenesi fu riportata da Ashara e colleghi1. Più tardi, altri documentata l'esistenza di tipi simili di EPCs provenienti dal midollo osseo2,3. Più recentemente, Yoder e Ingram ha mostrato che EPCs derivate da sangue del cordone ombelicale aveva un potenziale proliferativo più elevato rispetto a quelli isolati da adulto periferico sangue4,5,6. Oltre ad essere coinvolti nella vasculogenesi postnatale, EPCs inoltre hanno indicato la promessa come una fonte di cellule per la creazione di ingegneria tissutale vascolare e cuore valvola costrutti7,8. Esistono diversi protocolli di isolamento, alcuni dei quali coinvolgono l'ordinamento delle cellule delle cellule mononucleari (MNCs) derivate dalle fonti indicate in precedenza con l'aiuto di markers endoteliali ed ematopoietiche, o coltura questi MNCs con crescita endoteliale specializzata medio, o una combinazione di queste tecniche9. Qui, presentiamo un protocollo per l'isolamento e coltura di EPCs utilizzando specializzati endoteliale supplementato con fattori di crescita, senza l'uso di immunosorting, seguita dalla caratterizzazione di cellule isolate mediante Western blotting e immunostaining.

Introduzione

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Parecchi ricercatori hanno studiato le caratteristiche e le potenzialità di umano EPCs5,10,11,12,13. EPC possono essere descritto come fare circolare le cellule che hanno la capacità di aderire al tessuto endoteliale nei siti di ipossia, ischemia, lesioni o di formazione del tumore e contribuiscono alla formazione di nuove strutture vascolari4,14. Loro coinvolgimento osservato nella neovascolarizzazione, sotto forma di vasculogenesi postnatale, ha condotto ad una comprensione della patofisiologia di queste cellule e il loro uso in applicazioni terapeutiche4,15, 16. il numero di EPCs in un individuo è stato indicato per essere correlati con patologia cardiovascolare9,15,16,17,18,19 ,20. Altri studi hanno anche differenziato EPCs in un fenotipo fibroblasto-come valvola e proposto che queste cellule potrebbero essere utilizzate per l'ingegneria dei tessuti cuore valvole7,21.

Le molecole di superficie determinata cella necessari per isolare EPCs non sono stati chiaramente identificate a causa di discrepanze tra le indagini4. L'adesione delle MNCs per una certa matrice, con l'esposizione a una varietà di condizioni di coltura, è stata eseguita da diversi gruppi1,17,22,23, suggerendo che presunto EPCs può visualizzare le proprietà fenotipiche differenti. Queste proprietà includono la mancanza di abilità phagocytotic, la formazione del tubo in Matrigel e l'assorbimento delle lipoproteine a bassa densità di Dil-acetilato. L'alta clonogenic e potenziale proliferativo sono due proprietà con cui EPCs può essere gerarchizzato5. EPCs possono anche formare in vitro i tubuli quando cocultured con fibroblasti di polmone fetale umano4. Queste cellule sono conosciute per esprimere gli indicatori di superficie delle cellule endoteliali e di condividere alcuni dei marcatori ematopoietici13,24,25. I marcatori espressi positivamente che sono ampiamente accettati per la fenotipizzazione EPCs sono CD31, CD34, fattore di crescita endoteliale vascolare receptor 2 (VEGFR2), von Willebrand Factor (vWF), CD133, c-Kit e vascolare endoteliale caderina (VE-caderina)4 , 18. non sono considerate essere EPCs a causa della loro limitata capacità proliferativa potenziali, di fagocitare batteri e incapacità di formare de novo umano cellule che co-esprimono CD90, CD45, CD14, CD115 o l'actina alfa-liscia del muscolo (α-SMA) vasi in vivo4,7. Questo articolo descrive un protocollo modificato per l'isolamento di cellule progenitrici endoteliali dal sangue del cordone ombelicale umano senza la necessità di qualsiasi cella ordinamento protocolli. In questo articolo abbiamo usato CD31, CD34 e VEGFR2 come gli indicatori positivi, con α-SMA come indicatore negativo.

In questo articolo, vi proponiamo un metodo di isolamento e coltura delle cellule progenitrici endoteliali da sangue del cordone ombelicale senza cella ordinamento utilizzando specializzato supplementato crescita endoteliale con fattori di crescita (EGM). Questo EGM contiene fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e fattore di crescita del fibroblasto (FGF), che migliorano la sopravvivenza, la proliferazione e la migrazione di cellule endoteliali26. Include anche l'acido ascorbico, che è responsabile del mantenimento della morfologia di ciottoli delle cellule; 1 fattore di crescita insulino-simile (IGF-1), che fornisce angiogenici e funzione migratori; e l'eparina, che provoca una migliore stabilità a lungo termine dei fattori di crescita nel medio26. Altri fattori di crescita aggiunti al terreno di coltura delle cellule endoteliali comprende il completamento con fattore di crescita epidermico (EGF), che aiuta a stimolare la proliferazione delle cellule e differenziazione e idrocortisone, che sensibilizza le cellule per EGF26 . Indichiamo che l'utilizzo di questo mezzo di crescita specifici rendimenti più alti numeri di EPCs rispetto al medio basale endoteliale (EBM) o per volta Eagle Medium (DMEM di Dulbecco).

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Protocollo

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questa ricerca è stata condotta con l'approvazione dell'Università di Arkansas Institutional Review Board (numero di omologazione 16-04-722). Unità di sangue del cordone ombelicale sono stati raccolti in soluzione di citrato fosfato destrosio (CPD) presso l'Arkansas Cord Blood Bank, e unità che non soddisfano il requisito per l'archiviazione sono stati donati per la ricerca. Unità cordonali erano corriere al laboratorio entro 24 h dalla raccolta a temperatura ambiente.

1. isolamento di cellule endoteliali progenitrici dal sangue del cordone ombelicale

  1. preparazione dei reagenti.
    1. EGM preparare aggiungendo sostanza basale endoteliale (EBM) al 10% siero bovino fetale (FBS) completati con 20 ng/mL del fattore di crescita insulino-simile (IGF), 1 µ g/mL di acido ascorbico, fattore di crescita ricombinante umano epidermico 5 ng/mL (rhEGF), 22,5 µ g/mL eparina e 0,5 ng/mL endoteliale fattore di crescita vascolare (VEGF), insieme a 10 ng/mL di fattore di crescita del fibroblasto umano ricombinante B (rhFGF-B), idrocortisone di 0,2 µ g/mL e 2% penicillina-streptomicina-glutammina. Sterilizzare il terreno di coltura utilizzando un filtro vuoto a membrana in polietersulfone (PES) 0,2 µm.
      2. Ratto
    2. preparare io coda soluzione di collagene ad una concentrazione di 50 µ g/mL utilizzando 0,02 N di acido acetico. Sterilizzare questa soluzione utilizzando un filtro per siringa 0,2 µm.
    3. Pre-cappotto 6-pozzetti con 2 mL di preparato ratto ho coda soluzione di collagene per ciascun pozzetto. Metterli in un incubatore mantenuto a 5% CO 2 e 37 ° C per almeno 1 h prima della semina.
    4. Diluire circa 25 mL di sangue del cordone ombelicale con Hanks bilanciato sale soluzione (HBSS) ad una concentrazione di 1:1.
    5. Preparare radio-immuno precipitazione (RIPA) tampone utilizzando 150 mM di cloruro di sodio, 1% Triton X-100, 0,5% sodio desossicolato, β-glicerofosfato di 1 mM, 0,1% SDS e 50 mM Tris (pH 8.0) per il test.
  2. Isolamento di cellule progenitrici endoteliali.
    1. Caldo tutti preparati i reagenti in un bagno d'acqua mantenuto a 37 ° C prima dell'isolamento.
    2. Aggiungere 20 mL di reagente medio gradiente di densità in una provetta da centrifuga 50ml.
    3. Attentamente strato 20 mL di sangue cordonale diluito la provetta da centrifuga contenente medio gradiente di densità senza rompere questo strato puntando la pipetta verso le pareti laterali del tubo.
    4. Separare i componenti del sangue basata sulla loro densità ( Figura 1) mediante centrifugazione a 800 x g per 30 min a temperatura ambiente, con i freni del rotore della centrifuga fuori. Non disturbare i diversi strati.
    5. Rimuovere lo strato di plasma pipettando attentamente fuori dal tubo senza disturbare altri cell strati fino a quando la punta della pipetta è in grado di raggiungere il MNC strato (Vedi Figura 1). Scartare il plasma rimosso.
      Nota: Durante l'utilizzo di puntali per rimuovere il plasma, lasciare un piccolo strato di plasma sopra lo strato MNC ( Figura 1) per ridurre i disturbi.
    6. Raccogliere il buffy-coat contenente i PTM usando una siringa graduata per un ago calibro 18 e trasferirlo in una provetta da centrifuga freschi.
    7. Aggiungere un volume uguale di EBM alla centrifuga MNCs. raccolti questi tubi a 500 x g per 10 min a 4 ° C. scartare il sopranatante.
      Nota: Il pellet cellulare apparirà rosso a causa della presenza di globuli rossi/eritrociti.
    8. Aggiungere 5 mL di soluzione di cloruro di ammonio per lisare le cellule di anima rosse. Incubare la provetta in ghiaccio per 5-10 minuti, con agitazione occasionale.
      Nota: Prestare attenzione durante questo passaggio di non superare la durata di tempo, come può essere dannoso per i PTM.
    9. Centrifugare le provette a 500 x g per 10 min a 4 ° C e scartare il surnatante. Se persistono gli eritrociti, ripetere i passaggi 1.2.8 e 1.2.9 Nessun colore rosso è osservato nel pellet.
    10. Risospendere il pellet in EGM preparati e utilizzare l'emocitometro per contare i PTM.
    11. Aspirato il ratto di coda ho piastra a 6 pozzetti rivestite con collagene (dal punto 1.1.3) e lavare i pozzetti tre volte con 1x tampone fosfato salino (PBS).
    12. Del seme il pellet MNC risospeso in EGM alla piastra di collagene ad una concentrazione di 1 x 10 7 MNCs in ciascun pozzetto. Posizionarlo a 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
    13. Dopo 24 h, il mezzo di aspirare e lavare i pozzetti una volta con EGM. Aggiungere 3 mL di terreno EGM in ciascun pozzetto e posizionarlo torna a 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
    14. Riempire la piastra con mezzo EGM fresco ogni giorno per 7 giorni. Dopo 7 giorni, cambiare il mezzo EGM alterni.
    15. Usando un microscopio a campo chiaro, prendere le immagini della piastra 6 pozzetti ogni giorno per monitorare la progressione delle colonie delle cellule endoteliali. Contrassegnare la piastra dove le colonie derivano per tenere traccia della loro crescita.
      Nota: Prende solitamente fra 5 e 9 giorni per le colonie a comparire nella cultura.
  3. Espansione di cellule progenitrici endoteliali.
    1. Cappotto il matraccio di cultura T-25 con ratto coda ho collagene (50 µ g/mL) e posizionarlo a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per almeno 60 min. aspirare e lavare il matraccio di cultura cellulare T-25 tre volte con PBS 1x prima della semina delle cellule.
    2. Tripsinizzano le colonie delle cellule endoteliali quando raggiungono circa 3 millimetri nel formato utilizzando 150 µ l di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% in ciascun pozzetto. Inserire nuovamente la piastra a 6 pozzetti i 37 ° C, 5% CO 2 incubatrice per un minimo di 2-3
    3. Toccare delicatamente la piastra 6 pozzetti per sloggiare le cellule allegate. Immediatamente aggiungere 2 mL di EGM e ripristinare le cellule in una provetta da centrifuga da 15 mL.
    4. Contare le celle utilizzando un emocitometro e calcolare la densità di semina iniziale.
      5. Tubi di
    5. spin la centrifuga 15 mL a 400 x g per 5 min. Risospendere il pellet cellulare in EGM e seminare la bottiglia di T-25 con ~ 500.000 cellule. Contrassegnare questa boccetta come passaggio 1 e posizionare il pallone T-25 torna a 37 ° C, 5% CO 2 incubator.
      Nota: Le cellule possono essere placcate in EBM e DMEM per confrontare la crescita con EGM.
    6. Per ulteriori passaggi, quando il pallone raggiunge 90% confluenza, attenersi alla seguente procedura 1.3.1 - 1.3.5 e reinizializzare le cellule 10 4 cellule/cm 2 su T-75 o T-175 matracci di cultura cellulare. Procedere alla caratterizzazione di cellule isolate (passaggi 2 e 3).

2. Caratterizzazione di isolato cellule mediante Western Blotting

  1. Aggiungi 50-100 µ l di lysis buffer ad ogni passaggio quando seguendo la procedura di espansione per caratterizzare le cellule isolate. Raccogliere le proteine da circa 500.000 o più cellule.
  2. Pipettare vigorosamente su e giù a rottura delle cellule e rilasciare le proteine. Raccogliere e il buffer di trasferimento ad un tubo del microcentrifuge.
  3. Spin il tubo del microcentrifuge a 500 x g e attentamente trasferire il surnatante ad un nuovo tubo del microcentrifuge. Etichetta e memorizzare le provette a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
  4. Quantificare la quantità di proteine in ogni provetta utilizzando entrambi Bradford ' s o BCA dosaggio 27 , 28 , 29.
  5. Eseguire Western blotting usando le procedure standard 27 , 28 , 29. Analizzare 5 µ g di proteina totale per l'espressione di CD31, CD34, VEGFR2 e α-SMA. Utilizzare α-tubulina per normalizzare i dati.

3. Immunofluorescenza indiretta

  1. sottoporre ad ultrasuoni-18mm vetrini coprioggetti in etanolo al 50% e asciugarli. Lasciare i coprioggetti puliti in un piatto di 12-pozzetti pernottamento nella cappa di sicurezza biologica con un UV luce su per sterilizzarli.
  2. Cappotto lamelle con 50 & n. 181; g/mL di ratto coda ho collagene e trasferire la piastra a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per almeno 60 min.
  3. Aspirare il collagene e aggiungere 1 mL di PBS 1x alla piastra 12-pozzetti per lavare i vetrini coprioggetti. Aspirare il PBS 1X e ripetere due volte.
  4. Seme 250.000 coltivate EPCs in ciascun pozzetto e il posto nuovamente a 37 ° C, 5% CO 2 incubatore per almeno 3 giorni prima di effettuare immunostaining.
  5. Lavare la piastra 3 volte con PBS 1X. Aggiungere 1 mL di metanolo ghiacciato in ogni pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti per fissare le cellule.
  6. Eseguire immunostaining usando un protocollo standard 27 , 28 , 29. Utilizzare gli anticorpi alle loro appropriate diluizioni (ad es., CD31 (01:20), CD34 (01:50), α-SMA (1: 100) e VEGFR2 (01:50)).
  7. Prendere le immagini di lamelle immunostained utilizzando un microscopio a epifluorescenza.

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Risultati

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Isolamento ed espansione di cellule progenitrici endoteliali:
Uno schema (Figura 1) viene fornito raffigurante il protocollo generale. I livelli di componenti del sangue diverso sono stati osservati dopo centrifugazione in gradiente di densità del sangue del cordone ombelicale con il mezzo di gradienti di densità. Al momento di semina MNCs sulle piastre collagene-trattati, la conseguenza delle colonie in primo luogo è stata osservata fra g...

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Discussione

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Come accennato in precedenza, aderente EPCs possiedono una morfologia di ciottoli. Nostro MNCs isolato progredito da una colonia di cellule fusiformi (Figura 2A-2D) nelle prime fasi di una colonia di ciottoli (Figura 2E-2F) per un periodo di dieci giorni nella cultura. EPC sono state etichettate in modo diverso dai gruppi di ricerca differenti, vale a dire come ritardati di cellule progenitrici endoteliali10

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questo materiale si basa su lavori sostenuta dalla National Science Foundation Grant No. CMMI-1452943 e dall'Università di Honors di Università dell'Arkansas. Vorremmo anche riconoscere l'Arkansas Cord Blood Bank per averci fornito unità cordonali.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
A) Per l'isolamento e la coltivazione
EGM-2 BulletKitLonzaCC-3162Questo prodotto viene fornito con tutti i fattori di crescita necessari per rendere il
siero fetale bovinoThermofisher Scientific26140079
Pencillin-Streptomycin-Glutamine (100x)Thermofisher Scientific10378016
Ficoll-PaqueGE Heatlhcare17-1440-02
salina bilanciata di HankThermofisher Scientific14170-112
Cloruro di ammonioStem Cell Technologies7850
1x tampone fosfato soluzione salinaThermofisher Scientific14190250
Coda di ratto I CollagenCorning354236
Acido acetico glacialeAmresco0714-500ML
0,05% tripsina-EDTAThermofisher Scientific25300054
tampone HEPESThermofisher Scientific Thermofisher Scientific15630080
Dulbecco's Modified Eagle's MediumThermofisher Scientific10566-016
B) Anticorpi e lisati cellulari
CD31 Abcamab28364Diluizione 1:250 per Western blotting
CD34Santa Cruz Biotechnologysc-7045Diluizione 1:100 per Western blotting
α-SMAabcamab5694Diluizione 1:100 per Western blotting
α-tubulinaabcamab7291Diluizione 1:2.500 per Western blotting
VEGFR2abcamsc504Diluizione 1:100 per Western blotting
Lisato di cellule endoteliali della vena ombelicale umanaSanta Cruz Biotechnologysc24709 
di cellule interstiziali valvolariLinea cellulare primaria coltivata dal proprio laboratorio e lisata con tampone RIPA
C) Western blotting e immunocolorazione
10x tampone Tris/Glycine/SDSBiorad161-0772Utilizzato come tampone di corsa
10x tampone Tris/GlycineBiorad161-0771Utilizzato come tampone di trasferimento
Membrana di trasferimento Immobilon-FLMerck MilliporeIPFL0010Si tratta di una membrana di trasferimento PVDF che ha 45 µ m dimensione dei pori ed è menzionato nel protocollo come membrana western blot
4x tampone campione LaemmliBiorad161-0747
2-mercaptoetanoloBiorad161-0710
10% Criterion TGX gel prefabbricatoBiorad5671033
Prolong Gold antifadeThermofisherScientific P36930Utilizzato per il montaggio di vetrini coprioggetti immunocolorati per la conservazione a lungo termine
MetanoloVWR analiticoBDH1135-4LP
medio di crescita endoteliale Soluzione Lisato

Riferimenti

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Isolamento cellulareCentrifugazione su gradiente di densitTerreno di crescita endotelialeAnalisi Western BlotCaratterizzazione tramite immunocolorazioneRivestimento di collageneIncubazione di colture cellulariFormazione di colonie

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