Analisi semi-automatica del Mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo

Sommario

La macchiatura di Immunohistochemical delle isoforme della catena pesante della miosina è emerso come il discriminatore di state-of-the-art di fibra del muscolo scheletrico-tipo (cioè, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Qui, presentiamo un protocollo di colorazione insieme a un algoritmo romanzo semi-automatico che facilita la rapida valutazione della morfologia del tipo di fibra e fibra.

Abstract

Per anni, distinzioni tra tipi di fibre muscolari scheletriche sono state visualizzate meglio macchiando di miosina-atpasi. Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più preciso del tipo di fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX e fibre di tipo IIB possono ora essere identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC; Tuttavia, l'analisi manuale di questi dati può essere lento e giù-destra noioso. A questo proposito, rapida e accurata valutazione della morfologia e composizione di fibra-tipo è uno strumento molto desiderabile. Qui, presentiamo un protocollo per la macchiatura di immunohistochemical di state-of-the-art di MyHCs nelle sezioni congelate ottenute dal muscolo del hindlimb del mouse in concerto con un algoritmo romanzo semi-automatizzato che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra. Come previsto, il muscolo soleo visualizzato macchiatura per tipo I e fibre IIA, ma non per fibre di tipo IIX o tipo IIB. D'altra parte, il muscolo anteriore di tibialis era composto principalmente da fibre di tipo IIX e tipo IIB, una piccola frazione delle fibre di tipo IIA e poco o nessun fibre di tipo I. Varie trasformazioni di immagine sono state utilizzate per generare mappe di probabilità ai fini della misurazione di diversi aspetti della morfologia delle fibre (cioè, area della sezione trasversale (CSA), diametro Feret massima e minima). I valori ottenuti per questi parametri sono stati poi confrontati con valori ottenuti manualmente. Sono state osservate differenze significative tra una delle due modalità di analisi per quanto riguarda il CSA, diametro Feret massima o minima (tutti p > 0,05), che indica la precisione del nostro metodo. Così, il nostro protocollo di analisi immunostaining può essere applicato per l'indagine degli effetti sulla composizione del muscolo in molti modelli di invecchiamento e di miopatia.

Introduzione

Esso è stato conosciuto per qualche tempo che il muscolo scheletrico è composto da singole fibre di molti tipi¹. Inizialmente, due gruppi di fibre sono state caratterizzate in base alle loro proprietà contrattili e denominato, in modo appropriato, slow-twitch (tipo I) e rapide (tipo II). Queste categorie sono stati ulteriormente distinti sulla base del metabolismo della fibra. Da allora tipo I fibre sono ricche di mitocondri e affidamento sul metabolismo ossidativo, essi sono stati chiariti da robustamente positiva nicotinammide adenina dinucleotide-tetrazolio reduttasi (NADH-TR) diaforasi² o succinato deidrogenasi (SDH)....

Protocollo

tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dal comitato di uso e University of Colorado-Anschutz Medical Campus istituzionali Animal Care (91813(05)1D).

1. giorno 1: primaria (1°) Immunostaining con l'albumina di siero bovino (BSA) blocco

1. asciugato all'aria sezioni congelate del muscolo del hindlimb del mouse (ad esempio, tibiale anteriore, soleo) montate su vetrini caricati per ~ 30 min ¹¹. disegnare un bordo intorno alle sezioni utilizzando una penna PAP barriera idrofoba.
2. Posto ~ 250 µ l di 5% BSA/tampone fosfato salino (BSA/PBS) su ogni diapositiva per bloccare ....

Risultati

Muscoli del hindlimb (cioè, tibiale anteriore, soleo) sezionati da un topo C57BL/6 maschio di età sconosciuta erano flash congelati affondando una muffa di plastica che contiene il muscolo in OCT composto in isopentano raffreddato ad azoto liquido. Quindi, utilizzando un cryotome, erano taglio a-20 ° C e trasferite al vetro caricati positivamente diverse diapositive¹²sezioni di serie di 8-10 µm.

.......

Discussione

Qui, abbiamo fornito direzione utile per l'identificazione dei tipi di fibra muscolare scheletrica. In tal modo, descriviamo un nuovo algoritmo per l'analisi dei dati.

Poiché in gran parte, i nostri risultati confermano quelli di precedenti rapporti^5,8,10 e riflettono le nostre misurazioni manuali, l'algoritmo sembra essere accurata. Ancora, abbiamo incontrato alcuni trabocchetti sperimentale infreque.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Albumina sierica bovina	Sigma Aldrich	A9418-100G	5% in PBS
Barriera idrofobica Pap Pen	Scientific Device Laboratory	9804-02
Vetrini per microscopio	Globe Scientific	1358W
Coverglass	Fisher Scientific	12-544-E
Immumount	Thermo Scientific	9990402
Smalto per unghie	L'Oreal
Nikon Eclipse TE-200 Microscopio a fluorescenza invertita e campo chiaro	Fuori produzione
			1:50
SC-71 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari	Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa		topo monoclonale IgG1; 1:50
BF-F3 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari	Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa		monoclonale di topo IgGM; 1:50
6H1 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari	Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa		monoclonale di topo IgGM; 1:50
Alexa Fluor 594 anti-IgG2b	Invitrogen	A21145	anti-topo di capra; 1:200
Alexa Fluor 488 anti-IgG1	Invitrogen	A21121	anti-topo di capra; 1:200
Alexa Fluor 594 anti-IgGM	Invitrogen	A21044	capra anti-topo; 1:200
OTT	Sakura Finetek	4583
isopentano	Fisher Scientific	O3551-4	raffreddare con azoto liguido
PBS	Fisher Bioreagents	BP665-1	10x, diluire a 1x
salviette Kim	Kimberly-Clark	06-666A

Soluzioni di imaging SPOT RT/KE SPOT RT940 Dell Optiplex BA-F8 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa monoclonale di topo IgG2b;