La macchiatura di Immunohistochemical delle isoforme della catena pesante della miosina è emerso come il discriminatore di state-of-the-art di fibra del muscolo scheletrico-tipo (cioè, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Qui, presentiamo un protocollo di colorazione insieme a un algoritmo romanzo semi-automatico che facilita la rapida valutazione della morfologia del tipo di fibra e fibra.
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Articolo metodologico
Analisi semi-automatica del Mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Per anni, distinzioni tra tipi di fibre muscolari scheletriche sono state visualizzate meglio macchiando di miosina-atpasi. Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più preciso del tipo di fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX e fibre di tipo IIB possono ora essere identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC; Tuttavia, l'analisi manuale di questi dati può essere lento e giù-destra noioso. A questo proposito, rapida e accurata valutazione della morfologia e composizione di fibra-tipo è uno strumento molto desiderabile. Qui, presentiamo un protocollo per la macchiatura di immunohistochemical di state-of-the-art di MyHCs nelle sezioni congelate ottenute dal muscolo del hindlimb del mouse in concerto con un algoritmo romanzo semi-automatizzato che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra. Come previsto, il muscolo soleo visualizzato macchiatura per tipo I e fibre IIA, ma non per fibre di tipo IIX o tipo IIB. D'altra parte, il muscolo anteriore di tibialis era composto principalmente da fibre di tipo IIX e tipo IIB, una piccola frazione delle fibre di tipo IIA e poco o nessun fibre di tipo I. Varie trasformazioni di immagine sono state utilizzate per generare mappe di probabilità ai fini della misurazione di diversi aspetti della morfologia delle fibre (cioè, area della sezione trasversale (CSA), diametro Feret massima e minima). I valori ottenuti per questi parametri sono stati poi confrontati con valori ottenuti manualmente. Sono state osservate differenze significative tra una delle due modalità di analisi per quanto riguarda il CSA, diametro Feret massima o minima (tutti p > 0,05), che indica la precisione del nostro metodo. Così, il nostro protocollo di analisi immunostaining può essere applicato per l'indagine degli effetti sulla composizione del muscolo in molti modelli di invecchiamento e di miopatia.
Introduzione
Esso è stato conosciuto per qualche tempo che il muscolo scheletrico è composto da singole fibre di molti tipi1. Inizialmente, due gruppi di fibre sono state caratterizzate in base alle loro proprietà contrattili e denominato, in modo appropriato, slow-twitch (tipo I) e rapide (tipo II). Queste categorie sono stati ulteriormente distinti sulla base del metabolismo della fibra. Da allora tipo I fibre sono ricche di mitocondri e affidamento sul metabolismo ossidativo, essi sono stati chiariti da robustamente positiva nicotinammide adenina dinucleotide-tetrazolio reduttasi (NADH-TR) diaforasi2 o succinato deidrogenasi (SDH)3 la macchiatura. Al contrario, fibre di tipo II hanno esibito minore e gradi variabili di NADH-TR diaforasi o SDH macchiatura e sono stati divisi in due sottogruppi di contrazione rapida (tipo IIA e tipo IIB) un po' rozzamente basato sulle loro capacità ossidativa relativa. Queste distinzioni tra le fibre hanno state visualizzate in modo più efficace di miosina-ATPasi-miosinica dove tipo I fibre macchia scure dopo una pre-incubazione a pH 4.0 e fibre di tipo IIB assorbono precipitato seguenti pre-incubazione a pH 10.0 con le fibre di tipo IIA la macchiatura intermedio4.
Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più fine di fibra-tipo5. Tipo I, tipo IIA e tipo IIB fibre possono essere tutti identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC. Inoltre, un altro tipo di contrazione rapida metabolicamente intermedio-fibra, tipo IIX, è stato identificato6. Fibre ibride che esprimono più MyHC inoltre sono stati confermati5,7,8. Alcune specie come il gatto e il babbuino non sono noti a rapidi tipo IIB MyHCs6. Se MyHC immunostaining è attualmente la valutazione dello stato-of-the-art della composizione del muscolo, l'analisi dei dati ottenuti tramite questa tecnica è ingombrante e richiede molto tempo senza assistenza automatizzata. A tal fine, una manciata di metodi semi-automatici per analizzare questi dati sono stati sviluppati5,9,10. Qui, presentiamo un protocollo relativamente standard per l'identificazione immunohistochemical di fibra muscolare-tipo5,7,8,10, insieme a un romanzo semi-automatizzato algoritmo che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra con precisione.
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Protocollo
tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dal comitato di uso e University of Colorado-Anschutz Medical Campus istituzionali Animal Care (91813(05)1D).
1. giorno 1: primaria (1°) Immunostaining con l'albumina di siero bovino (BSA) blocco
- asciugato all'aria sezioni congelate del muscolo del hindlimb del mouse (ad esempio, tibiale anteriore, soleo) montate su vetrini caricati per ~ 30 min 11. disegnare un bordo intorno alle sezioni utilizzando una penna PAP barriera idrofoba.
- Posto ~ 250 µ l di 5% BSA/tampone fosfato salino (BSA/PBS) su ogni diapositiva per bloccare il legame non specifico anticorpo. Incubare i vetrini a temperatura ambiente per 1 h.
- Mentre il blocco, 01:50 di preparare diluizioni dell'anticorpo 1 ° surnatante nel 5% BSA/PBS (tutti sono anticorpi monoclonali di topo; cfr. tabella 1 6 , 12); preparare 250 µ l di soluzione per ogni diapositiva. Mantenere 1° anticorpo scorte e diluizioni su Ice.
tabella 1: anticorpi primari utilizzati per distinguere MyHCs.
- a seguito di aspirazione della soluzione blocco 5% BSA/PBS, aggiungere 250 µ l della diluizione di anticorpo 1° alle diapositive appropriate. Aggiungere 250 µ l di 5% BSA/PBS al controllo di negativo solo anticorpo secondario (2°) scivola.
- Incubare a 4 ° C per 24-48 h in un ambiente umido.
Nota: Una capsula di Petri rivestito in alluminio con filtro di carta inumidito può servire come una camera di incubazione adatto.
2. Giorno 2:2 ° Immunostaining con anticorpi fluorescenti
- aspirare la soluzione di anticorpo di 1° o 5% BSA/PBS soluzione di controllo. Lavare tutte le diapositive tre volte, 10 min con 5% BSA.
- Durante il lavaggio, preparare diluizioni 1: 200 degli anticorpi purificati, coniugati fluoroforo 2 ° nel 5% BSA/PBS (Vedi tabella 2, sono tutti anti-topo di capra). Preparare 250 µ l di soluzione per ogni diapositiva. Tenere all'oscuro su Ice. anticorpi coniugati fluoroforo a 2°
tabella 2: anticorpi secondari coniugati fluoroforo utilizzato per visualizzare primario riconoscimento dell'anticorpo di MyHCs.
- a seguito di aspirazione della terza applicazione di soluzione bloccante di 5% BSA/PBS, aggiungere 250 µ l della diluizione di anticorpo 2° a tutte le diapositive. Incubare per 90 min a temperatura ambiente in un ambiente buio, umido.
- Soluzione di anticorpo 2° aspirato. Lavare tutte le diapositive tre volte, 10 min con 5% BSA/PBS.
- Risciacquare con PBS. Secco per 10 min.
- Montare il coprioggetto con un mezzo di montaggio acquoso non permanente, bassa viscosità.
- Quando asciutto, sigillare i bordi di diapositiva con smalto. Asciugare e conservare in un contenitore scuro.
3. Diapositive con epifluorescenza di imaging
- pulire i vetrini con un piccolo, 70% imbevuto di etanolo lab-wipe.
- Ottenere immagini digitali di sezioni di muscolo immunostained utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di un apparecchio fotografico (Vedi la Tabella materiali).
- Selezionare un'area di circa 1 mm 2 (obiettivo 10x, NA 1,4). Filtro passa-lungo di
- Vedi fluorescenza degli anticorpi coniugati Alexa 488 2° tramite un 505 nm. Mostra la fluorescenza generata da eccitazione degli anticorpi coniugati Alexa 594 2° tramite un filtro di passa-lungo 595 nm. Digitalizzare immagini con un computer PC equipaggiato con un software di imaging compatibile. Includere la barra della scala da imaging software per analisi successive.
4. Analisi delle immagini con Fiji
Nota: prima di procedere con l'analisi, Fiji (disponibile gratuitamente dal National Institutes of Health, Bethesda, MD) deve essere installato tramite https://imagej.net/Fiji/Downloads. Inoltre, la macro utilizzata in questo processo è fornita nel File supplementare. Inserire il file di macro in una directory accessibile.
- Carico un campo chiaro l'immagine di una sezione selezionata in Fiji. Passare al plugin → segmentazione → segmentazione Weka Trainable.
- Al fine di stabilire le zone cellulari della sezione, tracciare una linea su una fibra e fare clic " aggiungere alla classe 1 ". Quindi, tracciare una linea sullo spazio tra le fibre e fare clic " aggiungere alla classe 2 " per contrassegnare i domini extracellulari. Ripetere fino a quando ci sono 5-10 etichette in ogni classe.
- Clic treno classificatore. La sovrapposizione risultante di rosso e verde, aggiungere altre etichette manualmente (Vedi punto 4.2) a pezzi in modo non corretto segmentate dell'immagine, se necessario. Ripetere fino a fibre (rosso) in modo appropriato sono separati dallo spazio tra le fibre (verde).
- Clic " probabilità di ottenere " e salvare l'immagine in una cartella nuova con etichetta.
- Ripetere la procedura di cui sopra (punti 4.2-4.3) con l'immagine fluorescente prelevato dallo stesso campo. Etichetta immunostained fibre come " classe 1 " e tutte le regioni non fluorescenti come " classe 2 ". Salvare la mappa di probabilità risultante nella stessa cartella in cui è memorizzata l'immagine trasformati brightfield.
- Aprire una delle mappe di probabilità precedentemente salvato in Fiji. Disegnare una linea retta nella barra della scala fornita dal software di imaging. Vai a analizzare → impostare scala. Modificare i parametri (cioè, distanza nota, unità di lunghezza) al loro valori appropriati come dato dalla barra della scala, quindi controllare il " Global " casella per standardizzare la scala per ogni immagine.
- Passa al plugin → macro → eseguire → Tyagi et al fibra quantificazione macro.ijm (vedere il File supplementare). Immediatamente, verrà visualizzato un riquadro di navigazione. Aprire l'immagine ' cartella host s; verrà visualizzata una finestra di dialogo. Per ogni finestra di dialogo, modificare il " sfondo " a discesa valore per " luce. "
Nota: la cartella ora verrà popolata con immagini dei contorni della fibra e file di software di calcolo dei risultati (CSA e Feret diametro sono più pertinenti allo quantificare la morfologia delle fibre; parametri misurati possono essere regolati in analizzare impostare misure). Dati di morfologia fibra generati dalla funzione di poro-analisi di Fiji saranno trasferiti automaticamente ai file di software di foglio di calcolo per entrambe le immagini fluorescenti e luminose campo. - Calcolare la frazione di fibre che esprime un determinato MyHC in un campo dividendo il numero di fibre fluorescenti nel campo per il numero di fibre totale nell'immagine corrispondente campo luminoso.
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Risultati
Muscoli del hindlimb (cioè, tibiale anteriore, soleo) sezionati da un topo C57BL/6 maschio di età sconosciuta erano flash congelati affondando una muffa di plastica che contiene il muscolo in OCT composto in isopentano raffreddato ad azoto liquido. Quindi, utilizzando un cryotome, erano taglio a-20 ° C e trasferite al vetro caricati positivamente diverse diapositive12sezioni di serie di 8-10 µm.
...
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Discussione
Qui, abbiamo fornito direzione utile per l'identificazione dei tipi di fibra muscolare scheletrica. In tal modo, descriviamo un nuovo algoritmo per l'analisi dei dati.
Poiché in gran parte, i nostri risultati confermano quelli di precedenti rapporti5,8,10 e riflettono le nostre misurazioni manuali, l'algoritmo sembra essere accurata. Ancora, abbiamo incontrato alcuni trabocchetti sperimentale infreque...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nessun conflitto di interessi di divulgare.
Ringraziamenti
Siamo grati alla Fondazione Boettcher e l'associazione sclerosi laterale amiotrofica (n. 17-II-344) per il loro supporto di questa ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Albumina sierica bovina | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Barriera idrofobica Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Vetrini per microscopio | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Smalto per unghie | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Microscopio a fluorescenza invertita e campo chiaro | Fuori produzione | ||
| 1:50 | |||
| SC-71 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari | Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa | topo monoclonale IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari | Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa | monoclonale di topo IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Studi sullo sviluppo degli anticorpi primari | Banca degli ibridomi presso l'Università dell'Iowa | monoclonale di topo IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | anti-topo di capra; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | anti-topo di capra; 1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | capra anti-topo; 1:200 |
| OTT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentano | Fisher Scientific | O3551-4 | raffreddare con azoto liguido |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10x, diluire a 1x |
| salviette Kim | Kimberly-Clark | 06-666A |
Riferimenti
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- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
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