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Articolo metodologico

Piano sagittale cinematica Gait Analysis nei topi C57BL/6 sottoposti a MOG35-55 indotto encefalomielite Autoimmune Sperimentale

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⸱

DOI:

10.3791/56032

⸱

4 novembre 2017

 ,  ,  ,  , 
1Pharmacology, Dalhousie University, 2Medical Neuroscience, Dalhousie University, 3Psychiatry, Dalhousie University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Analisi cinematica di andatura nel piano sagittale produce informazioni molto precise sulle modalità di esecuzione del movimento. Descriviamo l'applicazione di queste tecniche per identificare i deficit di andatura per topi sottoposti a demielinizzazione autoimmune-mediata. Questi metodi possono anche essere usati per caratterizzare i deficit di andatura per altri modelli di mouse con alterata locomozione.

Abstract

Analisi cinematica di andatura nel piano sagittale sono stato frequentemente utilizzato per caratterizzare i deficit del motore nella sclerosi multipla (MS). Descriviamo l'applicazione di queste tecniche per identificare i deficit di andatura in un modello murino di MS, noto come encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Deficit di paralisi e motore nei topi sottoposti a EAE in genere sono valutati utilizzando una scala di valutazione clinica. Tuttavia, questa scala produce solo dati ordinali che fornisce poche informazioni circa la natura precisa di deficit motori. La gravità della malattia EAE è stata valutata anche da rotarod performance, che fornisce una misura della coordinazione motoria generale. Al contrario, analisi di andatura cinematica dell'arto posteriore nel piano sagittale genera informazioni altamente precise come movimento è alterata. Per eseguire questa procedura, marcatori riflettenti sono collocati su un arto per rilevare il movimento articolare mentre un mouse sta camminando su un tapis roulant. Software di analisi del movimento è utilizzato per misurare il movimento dei marcatori durante la deambulazione. Parametri cinematici andatura sono poi derivati dai dati risultanti. Vi mostriamo come questi parametri di andatura possono essere utilizzati per quantificare alterati movimenti delle articolazioni dell'anca, ginocchio e caviglia in EAE. Queste tecniche possono essere utilizzate per meglio comprendere i meccanismi della malattia e identificare i possibili trattamenti per MS e altre patologie neurodegenerative che compromettere la mobilità.

Introduzione

Andatura è una serie di movimenti ripetitivi degli arti utilizzati per raggiungere la locomozione. Andatura è composta da cicli di passaggio, che sono divisi in due fasi: la fase statica, ovvero quando il piede è in movimento all'indietro sul terreno per spingere il corpo in avanti; e la fase dinamica, dove il piede è fuori la terra e movimento spedisce. Dispersioni di andatura sono caratteristiche di marchio di garanzia di molti disordini neurodegenerative, quali la ferita del midollo spinale (SCI), sclerosi a placche (MS), sclerosi laterale amiotrofica (SLA), malattia di Parkinson (MDP) e ictus; modelli preclinici roditore di questi disordini ricapitolano spesso loro rispettivi andatura menomazioni1. I meccanismi di controllo di base di locomozione in topi sono stati intensamente studiati2,3. Inoltre, ci sono modelli murini di molti disordini neurologici umani4. Analisi del passo in topi sono pertanto un approccio attraente per misurare gli aspetti multipli del deficit del motore che hanno conosciuto componenti anatomiche. Lo studio di andatura in modelli murini può fornire intuizioni le basi neuropathological dei deficit motorio nei disordini neurodegenerative e consentire l'identificazione di potenziali trattamenti.

Ispezione visiva (per esempio, il Basso del mouse scala5 e campo aperto test6) e l'analisi di andatura da piano ventrale7includono alcune tecniche che sono state utilizzate per misurare l'andatura in roditori. Più recentemente, metodi per misurare la cinematica sagittale del hindlimb movimenti hanno guadagnato popolarità perché forniscono ulteriori informazioni sull'esecuzione di movimento e di conseguenza sono più sensibili ai sottili cambiamenti nell'andatura8, 9 , 10 , 11. cinematiche tecniche sviluppate per studiare il movimento del hindlimb nel piano sagittale mentre si cammina su un tapis roulant9,12 sono stati ampiamente studiati nel contesto dell'ALS, lesioni corticali traumatiche, SCI, corsa, e Malattia di Huntington8,9,10,11,13,14,15,16. Al contrario, queste tecniche hanno visto uso limitato nello studio dei deficit motorio per modelli murini di sclerosi multipla17.

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è il modello del mouse più comunemente usato di MS18. I due metodi principali di indurre EAE è tramite inoculazione attiva o passiva. In attivo EAE, topi sono immunizzati con antigeni mielinici, causando neuroinflammation mediata da cellule T autoreattive e demielinizzazione del midollo spinale e il cervelletto. EAE passiva, d'altra parte, è indotta da trasferimento di cellule T autoreattive da un mouse con EAE attivo ad un ingenuo del mouse19. Come descritto altrove, il decorso della malattia ed il neuropathology sono influenzati dall'antigene del sistema nervoso centrale (SNC) e mouse ceppo20,21,22,23,24 ,25. Negli esperimenti EAE, topi di controllo sono iniettati con adiuvante di Freund completo (CFA) senza l'antigene della mielina. EAE è caratterizzata da paralisi che inizia con la debolezza di coda e potenzialmente possono coinvolgere gli arti anteriori, ascendente conseguente atassia e paralisi20. Recentemente abbiamo caratterizzato i cambiamenti di andatura in topi C57Bl/6 sottoposti alla glicoproteina del oligodendrocyte di mielina 35-55 (MOG35-55)-indotto EAE. Questi studi hanno dimostrato l'analisi del passo di essere superiore rispetto ad analisi comportamentale classica perché deviazioni dal movimento della caviglia normale sono altamente correlate con il grado di perdita di sostanza bianca nel midollo spinale lombare di EAE topi26. Al contrario, la forza della correlazione tra la perdita di materia bianca e due altre misure comportamentali tradizionali (Punteggio clinico e rotarod) era molto più debole di26.

Qui descriviamo l'uso dell'analisi cinematica andatura per rilevare i deficit di movimento nel piano sagittale dei topi EAE cammina su un tapis roulant. Cinque marcatori riflettenti sono stati collocati su un arto posteriore per identificare il movimento dell'anca, del ginocchio e malleolare in registrazioni video ad alta velocità. Software di analisi del movimento è stato utilizzato per estrarre dati cinematici sulle escursioni congiunte. L'utilità di queste tecniche per quantificare i deficit di movimento per il modello di35-55 MOG di EAE sono discussi. Queste tecniche sono anche applicabili allo studio dei deficit di andatura in altri modelli murini di patologie neurodegenerative.

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Protocollo

questo protocollo è in conformità con il canadese Consiglio sugli orientamenti di cura degli animali ed è stato approvato dal comitato di Università di Dalhousie su animali da laboratorio.

1. costruire marcatori riflettenti:

  1. usando un punzone di foro tenuto in mano, pugno il numero desiderato di piccoli cerchi da un foglio di carta riflettente. Ogni animale richiede 5 segnapunti per una singola registrazione; due grandi e tre piccoli indicatori.
  2. Utilizzando le forbici bene, fare un taglio dritto, che si estende dal perimetro al centro del cerchio.
  3. Rimuovere la protezione del marcatore per rivelare la superficie adesiva di carta. Utilizzando una pinzetta, afferrare saldamente il marcatore e incurvarla in su se stesso usando le dita per formare una forma di cono. Per rendere un piccolo indicatore, arricciare il cono strettamente. Per rendere un grande marcatore, arricciare il cono senza bloccare.
  4. Usando una pistola di colla mano, riempire l'interno del marcatore a forma di cono con colla mentre avvincente la punta del cono con il forcipe e aderire il marcatore per un pezzo di cartone. La colla impedirà il marcatore da compressione e flessione durante la registrazione per garantire la riflessione ottima della luce. Quando la colla è secca (circa 10 min), rimuovere il marcatore dal cartone con un bisturi ( Figura 1A).

2. Preparare l'animale per la registrazione

  1. Anesthetize il mouse con gas isoflurano (2,5%; 2 litri/min O 2) posizionando il mouse in una camera di induzione. Una volta che il mouse è incosciente, collocarlo in un cono di naso posizionato sulla cima di un acqua di ricircolo riscaldamento coperta. Lo scopo di amputate è per immobilizzare il mouse per il posizionamento dei marcatori; la procedura non è dolorosa. Pertanto, la profondità dell'anestesia non ha bisogno di essere valutata.
  2. Applicare un lubrificante di occhio d'attualità a entrambi gli occhi.
  3. La barba del hindlimb desiderata usando tagliatori elettrici. Iniziano alla caviglia e si estendono verso la colonna vertebrale e inferiore delle costole; garantire pelliccia non è lasciato come questo altererà adesione marcatore.
    Nota: Qui, l'arto posteriore destro è stato registrato; Tuttavia, può essere utilizzato in entrambi hindlimb.
  4. Usando un pennarello indelebile, indicare la posizione della cresta iliaca e l'articolazione dell'anca. La cresta iliaca è appena sotto la parte inferiore delle costole ed è facilmente palpabile riunendo le ginocchia sotto il mouse ' corpo di s.
    Nota: L'articolazione dell'anca può essere trovato flettendo ed estendendo la gamba per trovare il punto di articolazione tra bacino e femore.
  5. Utilizzando una pinzetta, afferrare l'estremità appuntita di un marcatore di piccolo e immergere la base in colla adesiva ad azione rapida, o un'alternativa equivalente. Posizionare il puntatore sulla punta della quarta cifra e tenere in posizione per 2-3 e consentire la colla si asciughi. Posizionare gli altri due piccoli indicatori sul metatarso-falangea e caviglia nello stesso modo ( Figura 1B).
  6. Posto grande marcatori sulla cresta iliaca e dell'anca ( Figura 1B) nello stesso modo come i piccoli indicatori.
  7. Rimuovere il mouse dal cono di naso e trasferire immediatamente per la sala di registrazione utilizzando una gabbia di trasferimento. Posizionare il mouse sul tapis roulant stazionarie e consentire il completo recupero dall'anestesia.

3. Registrazione di andatura

  1. prima di registrare il mouse ' andatura di s, prendere una foto di un blocco di calibrazione con dimensioni note sul tapis roulant.
    Nota: Questo permetterà i pixel del video da convertire in misure reali. La fotocamera dovrebbe essere posizionata circa 120 cm da tapis roulant.
    1. Posizione la macchina fotografica a livello e la stessa altezza come il tapis roulant. Mantenere la stessa posizione della telecamera per le registrazioni seguendo l'immagine di calibrazione.
  2. Una volta che il mouse ha recuperato pienamente dall'anestesia, girare il tapis roulant ad una velocità bassa (5 cm/s) a lasciare che il mouse iniziare a piedi. Assicurarsi che la direzione di cintura di tapis roulant è tale che i marcatori del mouse sono rivolto verso la fotocamera.
  3. Aumento il tapis roulant velocità gradualmente fino a 20 cm/s; questa è la velocità ideale per un'andatura costante in topi sani più.
    Nota: Sebbene sia ideale per avere tutti i topi camminare alla stessa velocità, alcuni potrebbe essere Impossibile raggiungere costantemente questa velocità.
    1. Se il mouse è in grado di camminare a 20 cm/s, ridurre la velocità se necessario ed essere sicuri di prendere nota di questo. Ridurre la velocità del tapis roulant fino al raggiungono dei cicli coerente passo.
      Nota: Un'analisi successiva dei dati possibile regolare per differenze nelle velocità.
  4. Begin registrazione del video, una volta che il mouse è a piedi costantemente (cioè camminare ad un ritmo costante, non allevamento o tessitura lato a lato). Continuare a registrare fino a 8 a 12 cicli di passaggio consecutivi sono stati registrati. Per ogni video, registrare la velocità del tapis roulant e il lato del mouse registrata.
  5. Una volta che la registrazione è completa, spegnete il tapis roulant e tornare il mouse alla sua gabbia. Pulire il tapis roulant accuratamente tra le registrazioni come profumi lasciati da altri topi possono alterare il comportamento dei topi in arrivo. Per ridurre lo stress e danni alla pelle, non rimuovere i marcatori; consentire i topi per rimuoverli per conto proprio.

4. Analisi

  1. elaborare il video utilizzando il software di analisi del movimento.
    Nota: Nei nostri esperimenti, abbiamo usato script personalizzati progettati per il software di imaging e statistico (Vedi Tabella materiali) che sono stati scritti da Dr. Nicolas Stifani. Le seguenti operazioni vengono eseguite utilizzando il software di analisi di movimento selezionato.
    1. Estrarre le coordinate in pixel dei marcatori dei video e utilizza il video di calibrazione, trasformare i valori dei pixel in centimetri e calcolare gli angoli articolari in ciascun fotogramma.
    2. Identificare l'inizio e la fine di ogni ciclo di passaggio, ottenendo così informazioni sulla durata di passo e lunghezza.
    3. Normalizzare il passo durata del ciclo di 200 fotogrammi normalizzati, tale che swing e posizione sono rappresentate rispettivamente da 100 fotogrammi,.
  2. Utilizzando i fotogrammi normalizzati, calcolare i parametri cinematici per analisi dei dati con il software del foglio elettronico (Vedi Tabella materiali).
    1. Per stabilire l'angolo medio di un particolare giunto, prendere la media di tutti gli angoli all'interno di una cornice normalizzato come:
      figure-protocol-1
      Nota: qui x rappresenta il valore dell'angolo a un dato normalizzato telaio e n rappresenta il numero di telaio normalizzato.
    2. a stabilire il range di movimento di un'articolazione particolare per un determinato mouse, sottrarre l'angolo più piccolo dall'angolo più grande in un set di fotogrammi normalizzati come segue:
      Gamma di movimento = angolo massimo - angolo minimo.
      Nota: Qui angolo massimo e l' angolo minimo sono gli angoli più grandi e più piccoli realizzati all'interno del ciclo del passo normalizzato, rispettivamente.
    3. Per stabilire la differenza di RMS, in primo luogo sottrarre l'angolo medio di ogni tempo-punto sperimentale dalla registrazione della linea di base. Successivamente, ogni differenza di Piazza, prendere la media dei valori tutti al quadrato e la radice quadrata della media. L'equazione è la seguente:
      figure-protocol-2
      Nota: qui figure-protocol-3 rappresenta l'angolo medio dalla linea di base di registrazione; y rappresenta l'angolo medio da ogni punto di tempo sperimentale; n rappresenta il numero di fotogrammi normalizzati. Radice significa quadrato della differenza (RMS) è una misura utilizzata per valutare la deviazione in andatura da registrazioni di base.
  3. Utilizzare grafica scientifica e software di statistiche per analizzare e presentare i dati (Vedi Tabella materiali).

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Risultati

Figura 1 è una rappresentazione schematica della procedura utilizzata per l'analisi cinematica di andatura. In primo luogo, riflettenti marcatori sono fatti e collocati su un mouse a 5 punti anatomici. Andatura viene poi registrato mentre il mouse sta camminando su un tapis roulant. Software di analisi del movimento è utilizzato per estrarre dati cinematici per la successiva analisi.

Figura 2A -C rappresentano il cicl...

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Discussione

In topi con EAE, i due metodi più comuni di deficit motori di misurazione sono punteggi clinici e cadono la latenza da un rotarod27,28. Queste tecniche hanno diverse limitazioni. Anche se conveniente e ampiamente utilizzato, segnando clinico è limitato cedendo solo ordinali dati livelli, nel senso che la grandezza delle differenze tra punteggi clinici non sono noti. Punteggio clinico soffre anche di essere in grado di fornire informazioni precise circa la natura ...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Vorremmo riconoscere Sid Chedrawe per la sua assistenza tecnica con le riprese. Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti dalla MS Society of Canada (EGID 2983).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
FotocameraNikonNikon D750Utilizzato per filmare il video
Nastro riflettenteB& L EngineeringMKR-Tape-2
Forbici finiStrumenti per la scienza15023-10
PinzeStrumenti per la scienza fine11252-20
Pistola per collaCraftsmartE231647
manico per bisturi #4RobozR5-9884
Lama per bisturi No.10Feather2020-12
C57BL/6 topiCharles River Laboratories
Macchina per anestesiaEZ AnesthesiaEZ-AF9000 Sistema
Coperta riscaldante per il ricircolo dell'acquaAndroitHTP-1500
Lubrificante topico per gli occhiRefreshDIN00210889
ShaverOster78997-010
Telecamera ad alta velocitàFastec Fastec IL3-100
Luce ad alta potenzaSmith Victor CorporationModello 700 SG (600 Watt luce al quarzo, 120 Volt)
Light StandPromasterLS1
Tapis roulantCostruito su misura presso l'Istituto Zoologico dell'Università di Colonia
Microsoft Excel 2016MicrosoftVersion 2016
KinemaJNicolas StifaniQuesto è uno script generato per l'uso con ImageJ
KinemaRNicolas StifaniQuesto è uno script generato per l'uso con Rstudio
Vicon MotusVicon MotusVersione 9.00
GraphPad PrismGraphPadVersione 6.00
fine di flusso automatico

Riferimenti

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