Articolo metodologico

Profilare IgG anti-Neu5Gc in Sera umana con un assaggio microarray di Sialoglycan

DOI:

10.3791/56094

⸱

13 luglio 2017

 ,  ,  , 
1Department of Cell Research and Immunology, Tel Aviv University, 2Department of Chemistry, University of California-Davis

In questo articolo

Sommario

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Un saggio di microarray sialoglycan può essere utilizzato per valutare gli anticorpi anti-Neu5Gc nei sera umani, rendendolo un potenziale analisi diagnostica ad alto rendimento per il cancro e altre malattie umane mediate dall'infiammazione cronica.

Abstract

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Le cellule sono coperte da un mantello di catene di carboidrati (glicani) che sono comunemente alterati nel cancro e che includono variazioni nell'espressione di acido sialico (Sia). Questi sono gli zuccheri acidi che hanno una spina dorsale di 9 carbonio e che il cappuccio vertebrare i glicani sulle superfici delle cellule. Due delle principali forme di Sia nei mammiferi sono l'acido N- acetilneuraminico (Neu5Ac) e la sua forma idrossilata, l'acido N- glycolylneuraminic (Neu5Gc). Gli umani non possono produrre Neu5Gc endogeno a causa dell'inattivazione del gene che codifica la citidina 5'monophosphate-Neu5Ac (CMP-Neu5Ac) idrossilasi (CMAH). Il Neu5Gc straniero viene acquisito dalle cellule umane attraverso il consumo alimentare di carne rossa e latticini e successivamente appare su diversi glicani sulla superficie cellulare accumulandosi principalmente sui carcinomi. Di conseguenza, gli esseri umani hanno anticorpi anti-Neu5Gc circolanti che svolgono diversi ruoli nel cancro e in altre malattie mediate da infiammazioni croniche e che stanno diventando potenziali diagnostiche e terapeutichergets. Qui descriviamo un test di microarray di Sialoglycan ad alta percentuale per valutare tali anticorpi anti-Neu5Gc nei sera umani. I glicanti contenenti Neu5Gc e le loro corrispondenti coppie di controlli (glicanti contenenti Neu5Ac), ognuno con un ammino primario di base, sono legati covalentemente a vetrini in vetro epossidico. Esempiamo la stampa di 56 diapositive in un formato a 16 pozzetti utilizzando una specifica stampante nano in grado di generare fino a 896 array per stampa. Ogni diapositiva può essere utilizzata per la visualizzazione di 16 diversi campioni di sera umani per la valutazione della specificità, intensità e diversità degli anticorpi anti-Neu5Gc. Il protocollo descrive la complessità di questo strumento robusto e fornisce una guida di base per coloro che intendono indagare la risposta all'antigene carboidrato alimentare Neu5Gc in diversi campioni clinici in un formato di matrice.

Introduzione

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Sias sono zuccheri acidi che coprono catene di glicamine sulle glicoproteine ​​delle superfici cellulari e sui glicolipidi nei vertebrati. L'espressione Sia è modificata nelle cellule tumorali 1 e si correlano con la progressione e / o la metastasi 2 , 3 . Due delle principali forme Sia nei mammiferi sono Neu5Ac e la sua forma idrossilata, Neu5Gc 2 . Gli esseri umani non possono sintetizzare Neu5Gc a causa di una inattivazione specifica del gene che codifica l'enzima CMAH. Questa non umana Sia mette metabolicamente in cellule umane come "sé", proveniente da alimenti ricchi di nutrienti Neu5Gc ( es. Carni rosse) 4 , 5 . Neu5Gc è presente a bassi livelli sulle superfici cellulari dell'epitelio umano e dell'endotelina, ma si accumula soprattutto nei carcinomi. Neu5Gc è riconosciuto come straniero dal sistema immunitario humorale 2 , 6 .La complessità antigenica di Neu5Gc-glicani può avvenire a più livelli, tra cui la modifica di Neu5Gc, il legame, i glicanti sottostanti e gli scaffold e la loro densità, tutti riflessi dalla complessità della risposta anticorpale anti-Neu5Gc negli esseri umani 6 . Alcuni di questi anticorpi servono come biomarcatori del carcinoma e immunoterapia potenziale 7 . L'avvento della sintesi chemoenzimatica di diversi sialicani 8 ha aperto la strada all'analisi più approfondita di tali anticorpi, facilitata dall'utilizzo della tecnologia microarray a glicole 9 , 10 . Così, con la preparazione facilitata e la manipolazione di grandi librerie di carboidrati naturali e sintetici, i microarray glicanici sono diventati una potente tecnologia ad alto rendimento per indagare le interazioni dei carboidrati con una miriade di biomolecole 10 , 11 , 12 , 13 . In un formato a matrice vengono utilizzate quantità minime di materiali e questa visualizzazione multivalente di glicani biologicamente rilevanti consente di individuare migliaia di interazioni di legame in un singolo esperimento. Importante, questa tecnologia può essere applicata anche alla scoperta dei biomarker e al monitoraggio delle risposte immunitarie nei vari campioni 7 , 12 .

La fabbricazione di microarray di glico di successo richiede la considerazione di tre aspetti importanti: il tipo di robot della stampante, la chimica di coniugazione di glicole e l'ottica di rilevazione. Per quanto riguarda la tecnica dello strumento di stampa, sono disponibili due tecniche: contatti e stampanti non a contatto. Nella stampa a contatto, 1-48 pins d'acciaio vengono immersi in una piastra di fonte multi-well contenente la soluzione di glicina e sono scoperti su diapositive di vetro funzionalizzate direttamente contattando la superficie di scivolo in vetro. La quantità di soluzione deFegato alla diapositiva è una funzione della durata persistente sulla superficie di scorrimento. Di solito, i campioni vengono prima pre-macchiati su un blocco di vetro (per raggiungere macchie omogenee) prima che siano stampate sulla superficie di scorrimento. Nelle stampanti non a contatto ( ad esempio, la stampante piezo-elettronica), i glicani vengono stampati da un capillare di vetro utilizzando segnali elettrici controllati. Il segnale elettrico può essere calibrato finemente per ottenere una stampa più precisa rispetto alla stampa a contatto. La dimensione e la morfologia dei punti sono anche relativamente più omogenei. Un ulteriore vantaggio è il riciclo del campione di nuovo alla piastra di origine dopo la stampa. Tuttavia, il principale svantaggio delle stampanti piezoelettroniche è la limitazione delle punte di stampa (4 o 8), con una durata di stampa molto lunga, che richiede particolare attenzione alla stabilità della slitta, alla temperatura, all'umidità e all'evaporazione del campione. La stampante a getto d'inchiostro non contatto richiede maggiori volumi di campionamento 14 .

A differenza delle limitate opzioni disponibili per i metodi di stampa, la chimica di coniugazione glicata è una considerazione più complessa, con molte opzioni da scegliere. La chimica di immobilizzazione selezionata deve tenere conto dei gruppi attivi sui glicani e della reattività della superficie di scorrimento. I glicani da immobilizzare su una specifica superficie microarray, sinteticamente sintetizzati o isolati naturalmente, richiedono tutti un gruppo reattivo identico. Inoltre, i glicani devono essere pura e omogenei. D'altra parte, la superficie di immobilizzazione e la chimica dovrebbero fornire riproducibilità e densità di attacco affidabile. Sono stati sviluppati più metodi di immobilizzazione con attaccamento covalente o non covalente (assorbimento fisico) 10 , 11 , 12 , 13 . Per informazioni dettagliate sulla tecnologia microarray a glicina stampata per l'inaugurazioneD investigatore, fare riferimento a queste eccellenti recensioni 13 , 15 . Importante, le recenti informazioni minime necessarie per un'iniziativa per esperimenti di Glycomics (MIRAGE) descrivono le linee guida per la preparazione dei campioni 16 e per la segnalazione di dati da analisi microarray a glicole 17 per migliorare gli standard in questo campo crescente.

Qui descriviamo un protocollo dettagliato per la fabbricazione di microarray sialoglycan usando una specifica nano-stampante a contatto in un formato a 16 pozzetti. Ognuno dei glicani possiede un'ammina primaria che medierà il loro legame covalente alle vetrate in vetro epossidico. Descriviamo anche lo sviluppo e l'analisi di una sola diapositiva usando vari campioni di sera umani, anticorpi e lectini vegetali di Sia. I test di analisi microarray di Sialoglycan comportano diversi passi importanti che includono la fabbricazione, l'elaborazione, lo sviluppo e l'analisi di array. La fabbricazione dell'array richiede la pianificazione dell'arRay, preparando i glicani e la piastra sorgente, programmando la nano-stampante e stampando le diapositive. Successivamente, le diapositive vengono elaborate, sviluppate e analizzate ( Figura 1 ).

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Protocollo

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I campioni di sera umani sono stati ottenuti dalla banca di sangue israeliana e sono stati utilizzati in conformità con la dichiarazione di Helsinki e il consiglio di revisione istituzionale dell'università di Tel Aviv.

1. Pianificazione e layout di fabbricazione dell'array

  1. Determinare il layout della diapositiva.
    NOTA: Ogni diapositiva contiene 16 sotto-array divisi in 16 blocchi identici numerati da B1 a B16 ( Figura 1B , Figura 1A supplementare ).
  2. Determinare il layout del perno. Utilizzate quattro punte, ciascuna stampa quattro sotto-array (blocchi) per diapositiva:
    Pin 1 stampa Blocchi 1, 2, 9 e 10;
    Pin 2 stampa Blocchi 3, 4, 11 e 12;
    Pin 3 stampa Blocchi 5, 6, 13 e 14; e
    Pin 4 stampa i blocchi 7, 8, 15 e 16 ( Figura 1A supplementare ).
  3. Determinare il layout del blocco e della piastra da 384 pozzetti.
    NOTA: L'ordine in cui i glicani appaiono in ogni blocco richiede un'attenta pianificazione. In questo esempio arrAy, stampare ogni campione a quattro repliche, indicare le macchie di marcatori fluorescenti per essere posizionati nell'angolo in basso a destra (per facilitare l'analisi spot) e stampare le macchie di IgG (STD) standard a sei concentrazioni crescenti ( Figura 1B supplementare ).
    1. Per ogni punto stampato, distribuire il materiale in quattro pozzetti (uno per ogni perno) in una piastra da 384 pozzetti.
      NOTA: L'ordine dei materiali nella piastra a 384 pozzetti si basa sul layout di blocco progettato ( Figura 1B-C supplementare ).

2. Preparazione di Glycans e Source Plate

  1. Preparare il tampone di stampa a glicina (50 mL di tampone di fosfato 300 mM, pH 8,4). Pesare 58,5 mg di fosfato monosodico monoidrato (NaH 2 PO 4 .1H 2 O) e 3,9 g di disodio fosfato eptaidrato (Na 2 HPO 4 7H 2 O) in 40 mL di acqua deionizzata (DIW). Titolazione a pH 8,4 con 4 M NaOH. Regolare il volume a 50 mlD filtrare attraverso una membrana da 0,2 μm per la sterilizzazione.
  2. Preparare il buffer marker (50 mL di 187 mM tampone fosfato, pH 5). Pesare 289 mg di fosfato monosodico monoidrato (NaH 2 PO 4 .1H 2 O) e 1,94 g di disodio fosfato eptaidrato (Na 2 HPO 4 7H 2 O) in 40 mL di DIW. Titolate a pH 5 utilizzando 1 M HCl. Regolare il volume a 50 ml e filtrare attraverso una membrana da 0,2 μm per la sterilizzazione.
  3. Preparare il tampone della curva STD (50 ml di PBS-glicerolo: salina fosfato-tamponata, pH 7,4, integrata con il 10% di glicerolo da un glicerolo 100%) e filtrarlo attraverso una membrana da 0,2 μm per la sterilizzazione.
  4. Preparare ogni soluzione di glicola a 10 mM in DIW. Verificare le concentrazioni di glicole sialilate mediante rilevamento di fluorescenza sull'analisi cromatografica a liquido ad alta pressione in fase inversa 18 .
  5. Diluire ogni glicano a 100 μM in un volume totale di 100 μl di tampone di stampa glicanticoIn tubi di microcentrifuga.
  6. Preparare il colorante fluorescente contenente amine primaria. Solubilizzare Alexa 555-idrazide a 1 mg / mL con tampone marcatore e quindi diluire a 1 μg / mL in un volume totale di 1 mL.
    NOTA: qualsiasi altro colorante contenente amine contenente amine può essere utilizzato con una lunghezza d'onda appropriata in base allo scanner a scorrimento.
    NOTA: i punti di marcatura facilitano l'allineamento della griglia in ogni blocco durante l'analisi.
  7. Preparare le diluizioni della curva di IgG STD umana: preparare 0,5 mL di una soluzione di IgG umana a 160 ng / μL nel tampone della curva STD. Diluire serialmente lo stock 1: 1 sei volte per ottenere 80, 40, 20, 10, 5 e 2,5 ng / μL, tutti in buffer della curva STD con un volume totale di 200 μL ciascuno.
    NOTA: Altri isotipi Ig possono essere usati se adatti per l'esperimento ( ad es. IgA umano, IgM, IgE o Ig di un organismo diverso).
  8. Posizionare il piatto di 384 pozzetti sul ghiaccio. Utilizzando una multi-pipetta elettronica, l'aliquota 7 μL di ciascuna glicina, marcatore e curva STD IgG-4 replicareS di ciascuno - secondo il layout della piastra ( Figura 1C supplementare ). Per una migliore precisione, caricare 35 μL di ogni campione e l'aliquota 7 μL in ciascuno dei quattro pozzetti del campione. Posizionare i rimanenti 7 μl di ogni glicano nel loro tubo originale.
  9. Coprire la piastra con il parafilm e spin giù per 2 minuti a 250g e 12 ° C. Mettere la piastra a temperatura ambiente (RT), protetta dalla luce. Non scoprire la piastra prima che l'umidità della stanza raggiunga il 60-70%.

3. Programmazione del Nano-stampante

  1. Aprire il software "Microarray Manager". Utilizza la finestra "Proprietà del metodo".
  2. Impostare il layout della tabella di lavoro: scegliere la "56 diapositiva".
    NOTA: questa è una configurazione predefinita che consente la stampa di 56 diapositive. Calibrare per ogni tipo di piastra, pin e formato di stampa ( Figura 2 supplementare , passaggio 1).
  3. Selezionare "Configurazione pin"| "Pin Tool 1x4 9 mm".
    NOTA: questa è una configurazione predefinita per l'utilizzo di quattro pin ( Figura 2 supplementare , passaggio 2).
  4. Definire il tipo di pin. Calcolare e creare il tipo di pin adatto alla stampa.
    NOTA: Questo passo definisce quanti punti un pin dovrebbe stampare prima di riemergere nel campione 384-well e dovrebbe essere ottimizzato per i diversi tipi di pin e la chimica della superficie di scorrimento.
    NOTA: Quando si utilizzano i piedini 946MP3, considerare due importanti questioni: 1) ogni pin può stampare fino a 140 spot omogenei e 2) il pre-spotting è essenziale per scaricare il liquido in eccesso dalla punta del perno prima di stampare sulle diapositive. Pertanto, programmare ogni pin per stampare 20 pre-spot su un blocco di pre-stampa (ottimizzato per i pin 946MP3 su diapositive rivestite in epoxy).
    1. Calcolare il numero totale di punti stampati per campione.
      NOTA: qui, ciascun pin mette 4 punti per sotto-array (blocco); Un totale di 4 sotto-array per diapositive = 16 spot / slide. Dopo 7 diapositive, ogni perno stampa 16 punti 7 = 112. Inoltre, 20 pre-spot prima della stampa dà 132 punti / tuffo. Pertanto, il tipo di pin è definito come "946MP3-132 spot" (4 spot per campione per blocco x 4 blocchi x 7 diapositive + 20 pre-spot = 132).
    2. Crea il "Tipo di pin" ( Figura 2 supplementare , passaggio 3). Premere "Setup" (pannello sinistro del software). | "Micro Spotting Pins" | "Nuovo nome" (punti 946MP3-132). Definire il numero di punti per dip (132), il diametro spot (100 μm), l'assorbimento (0,25 μL), la distribuzione (0,7 nL) e la distanza minima del punto (100 μm). Premere "OK" | "OK."
    3. Nella finestra "Proprietà metodo", selezionare il tipo di pin creato: "946MP3-132 spot".
  5. Definire le condizioni di lavaggio. Impostare "Lavaggio prima dell'avviamento" e "Lavaggio dopo la finitura" su "Lavaggio normale" ( Figura 2 supplementare , passaggio 4).
  6. Definire l'elenco "Plate".
    NOTA: Questo è il modello di campionamento dalla piastra (l'ordine di scorrimento dalla piastra a 384 pozzetti) in base al layout della piastra. Per caricare la lastra nell'elenco delle piastre, impostare un modello di campionamento delle lastre.
    1. Crea il piatto "Campionamento di campionamento". Vai a "Modelli" ( Figura 3 supplementare ) "Campioni di campionamento". Dare un nuovo nome ( ad esempio, array JoVE) e selezionare "Inserisci". | "Fill top-bottom" | "Pin Strumento 1 x4 9 mm". Selezionare l'ordine dei pick-up ben definiti in base al layout della piastra predefinito ( Figura 1A supplementare ). Premere "OK" | "OK."
    2. Caricare il pattern di campionamento delle piastre. Fare clic sul lato destro della cella "Plate list" ( Figura supplementare Figura 3 ) "Aggiungi piastra" e selezionare il modello di campionamento della piastra corretta (la "matrice JoVE" descritta nel passaggio 3.6.1). Selezionare "Lavaggio normale". stampa"OK" | "OK."
  7. Vai alle "Piastre di campionamento" e cambia l'offset di posizione su 1 (che determina dove la piastra si trova sulla piattaforma dell'allarme).
    NOTA: La posizione offset di 0 è più vicina al bagno del sonicatore.
  8. Definire il "Microarray Print Design". Calcolare le distanze da blocco a blocco e spaziatura.
    1. Prendiamo in considerazione le dimensioni dello strumento di sviluppo che divide la diapositiva in 16 pozzetti di 7 x 7 mm, con spazi di 2 mm tra sotto-array (un totale di 9 mm tra i blocchi, figura 4 supplementare ).
    2. Considera le dimensioni della sotto-matrice.
      NOTA: la distanza tra le macchie è di 0,275 mm e ci sono 12 colonne e 18 righe in questo disegno di stampa; Le dimensioni totali sono: larghezza (11 x 0.275 mm = 3.025 mm) e altezza (17 x 0.275 mm = 4.675 mm). Calcolare la distanza orizzontale: 9 mm - (11 0.275) = 5.97 mm. Calcolare la distanza verticale: 9 mm - (17 x 0.275) = 4.325 mm. Calcola dDal lato sinistro della diapositiva: 4,33 mm + 1,07 mm = 5,5 mm. Calcolare la distanza dal lato superiore della diapositiva: 2,95 mm + 0,55 mm = 3,5 mm ( Figura 4 supplementare ).
    3. Definire i "Disegni di stampa" ( Figura 5 supplementare ). Seleziona "Modelli" | "Print Designs" | "Nuovo."
      1. Selezionare "Pin Setup" | "Pin Strumento 1 x 4 9 mm" | "Pin - 946MP3-132 punti". Nella scheda "Generale", modificare il "nome della stampa microarray" (ad esempio, "array JoVE"). Selezionare "Spot Speed" | "Replica numero" (4) | "Altezza del tocco" (0 mm) "Altezza Soft Touch" (3 mm) "Stampa a tutte le posizioni disponibili" ( Figura 5A supplementare ).
      2. Nella scheda "Microarray", scegliere la distanza orizzontale e verticale (5,9 mm e 4,325 mm dal punto 3.8.2) e il numero di microarray orizzontali e verticali (2). Selezionare "StampaMicroarray orizzontalmente "|" Print Duplicate Microarray "( Figura 5B supplementare ).
      3. Nella scheda sub-array, scegliere il numero massimo di colonne (12), il numero massimo di righe (18) e la distanza tra le colonne e le righe (275 μm) ( Figura 5C supplementare ).
      4. Nella scheda misure, scegliere la distanza dal lato sinistro della diapositiva (5.5 mm), la distanza dalla parte superiore della diapositiva (3,5 mm, calcolata nel passo 3.8.2), la larghezza dello scivolo di stampa (25 mm) , E l'altezza della slitta di stampa (75 mm) ( Figura 5D supplementare ). Premere "OK" | "OK."
  9. Fare clic sul lato destro della cella "Microarray Print Designs" e selezionare il disegno definito ("JoVE array" dal punto 3.8.3; Figura 6 supplementare ).
  10. Definire il "Slide Count" (56) e modificare il "Offset di posizione" (0). Questo determina il poLa prima diapositiva da stampare sul ponte dell'arrampatura ( Figura 6 supplementare ).
  11. Definire il "Microarray Pre-Print Design" ( Figura 6 supplementare ). Selezionare "Blocco Vetro" | "Pre-stampa 1 x pin da 4 mm".
    NOTA: Questa impostazione di spaziatura consente di ottenere 46,464 pre-spot (per tutti e 4 i pin) sul blocco di vetro, quindi 46,464 / 4 = 11.616 punti pre-per perno. Quando lo spazio sul blocco di pre-stampa era stato esaurito, la stampante si fermerà e il blocco dovrà essere ripiegato.
    NOTA: per calcolare dopo quanti campioni il blocco di pre-stampa è pieno, considerare quanto segue: ogni campione sarà preso da 8 pin-dips nella piastra di 384 pozzetti per completare 56 diapositive (7 diapositive per tuffo) e ogni tuffo Ha altri 20 pre-spot, dando un totale di 160 pre-spot per campione. Pertanto 11.616 / 160 = 72.6 campioni. Pertanto, il blocco di vetro di pre-stampa dovrebbe essere ripiegato dopo 72 campioni (per valutare il tempo di spostamento, misura hCi vorrebbe un campione per completare un percorso completo su 56 diapositive e poi moltiplicarlo per 72).
  12. Selezionare "Utilizza PrePrint Design". | "Sì" | "Scansione dei codici a barre" (No) | "Stampa singola replica" (No) ( Figura 6 supplementare ).
  13. Fai clic su "Convalida" ( Figura 6 supplementare ).
  14. Fare clic su "Salva" e salvare il metodo come un file arr. (Ad esempio, "JoVE array.arr", Figura 6 supplementare ).

4. Stampa di matrici progettate

NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguiti in una stanza pulita con umidità del 60-70% e con guanti e abbigliamento adeguati per la protezione

  1. Accendere la macchina nano-stampante e l'umidificatore.
  2. Per il tampone di lavaggio e l'umidificazione, riempire con acqua di DI. Svuotare la bottiglia di lavaggio (scarico) e il carbocco della trappola per umidificazione ( Figura 7A supplementare ).
  3. Impostare l'umidificatore su70% di umidità e avvio di umidificazione.
  4. Pulire tutti i pin prima della stampa. Preparare 50 ml di soluzione di pulizia (65 ° C) (15 g di reagente di pulizia a pin-tip e 50 ml di acqua di 65 ° C, mescolati accuratamente fino a quando il reagente solido si dissolve completamente).
    1. Applicare la soluzione di pulizia ad ogni punta del perno immergendo la spazzola pin (fine) nella soluzione di pulizia pin-tip e spazzolando la superficie di ogni punta del perno.
      NOTA: La soluzione di pulizia a pin-tip è corrosiva e tossica. Assicurati di indossare guanti e occhiali di protezione in qualsiasi momento quando si utilizza questa soluzione. Il contatto con i pin nella soluzione di pulizia pin-tip per più di qualche minuto può provocare danni permanenti del perno.
    2. Riempire il bagno ad ultrasuoni con 1 L di acqua distillata e inserire i perni in un rack galleggiante per la pulizia del perno nel bagno. Sonicare per 5 min e rimuovere i perni. Lasciare asciugare e strofinare delicatamente con salviette speciali in camera pulita.
  5. Aprire la stampa "Microarray Manager"Software; Al set di connessione, la spia della stampante si accende (rosso / verde). Premere "Stop" | "Cancella" | "Init" ( Figura 7B supplementare , passaggi 1-3); Il braccio della testa di stampa ripristina gli allineamenti X, Y, Z.
  6. Per caricare i perni nella testina di stampa, premere "Carica" ​​( Figura 7B supplementare , passaggio 4) e inserire i perni nella testina di stampa in base alla configurazione definita del layout dell'utensile di stampa / pin ( Figura 7C supplementare ); Questo layout utilizza 4 piedini, ciascuna stampa 4 sotto-array su ogni diapositiva per ottenere complessivamente 16 sotto-array per diapositiva ( Figura 1A supplementare ). Dopo aver posizionato i perni, premere nuovamente "Init".
  7. Montare le diapositive sul ponte di allestimento. Aprire la scatola di scorrimento e pulire ogni diapositiva soffiando gas di azoto ultra-alta purezza. Inserire il numero di diapositive desiderato sulla piattaforma di array. Tenere le diapositive con due dita negli angoli inferiori e quindi posizionare la diapositiva nella suaposizione. Tenere i due angoli di destra e spingere leggermente gli angoli sinistro finché la diapositiva non si adatta perfettamente alla sua posizione. Spingere leggermente verso l'angolo sinistro per assicurare una tenuta salda ( figura supplementare 7D ).
  8. Pulire il vetro pre-blocco con acqua distillata, etanolo al 70% e etanolo al 100% e lasciar asciugare all'aria (utilizzare solo salviette a secco). Posizionare il vetro pre-blocco nella sua posizione sul ponte.
  9. Riempire un bagno del sonicatore ( Figura 7B supplementare ). Premere su "Fill" per 55 secondi, quindi premere "OK". Scollegare il sonicatore facendo clic su "Drain" per 20 secondi e quindi premendo "OK". Ripetere il riempimento e drenare ancora una volta e riempire di nuovo per 55 s.
  10. Riempire il bagno di lavaggio ( Figura 7B supplementare ): premere "Primo" per 40 secondi, quindi premere "OK".
  11. Posizionare la piastra da 384 pozzetti con i campioni aliquotati nella sua posizione sul ponte di allestimento e rimuovere il coperchio del parafilm.
  12. Inizia la stampa.
  13. Al termine della stampa, svuotare la vasca del sonicatore ( Figura 7B supplementare ) e spegnere l'umidificatore.
  14. Lasciare che le diapositive si asciugino sul ponte dell'array per 16-24 ore senza umidificazione.
  15. Immettere le diapositive con una penna di marcatura resistente al solvente / alcool e conservarle in una scatola sigillata sotto vuoto al buio.

5. Elaborazione e sviluppo delle matrici

  1. Estrarre una scivolata dalla scatola sigillata sotto vuoto e metterla in un cappuccio chimico per 5 minuti, allineato verso l'alto, per evaporare l'eccesso di liquido.
  2. Scansiona la diapositiva al guadagno più alto (950 PMT) per assicurare che tutti i punti siano stati stampati.
  3. Procedere con il blocco chimico dei gruppi epossidici sullo scivolo
    1. Preparare 50 ml di soluzione di blocco di etanolamina (0,1 M Tris-HCl, pH 8 e 0,05 M etanolamina). Mescolare 140 ml di DIW con 8,8 ml di Tris-HCl (1,7 M, pH 8) e 0,45 ml di etanolammina (16,6 M). Trasferimento a un 5Tubo di colorazione da 0 mL ( Figura 8A supplementare ) e caldo a 50 ° C.
    2. Idrata la diapositiva. Posizionare la diapositiva in un tubo di colorazione riempito con DIW, coprirlo con una pellicola e incubare per 5 minuti con scossa lenta e dolce a RT.
    3. Bloccare i gruppi epossidici reattivi sulla diapositiva. Immergere il vetrino nel tubo di colorazione da 50 ml riempito con soluzione di bloccaggio di etanolamina pre-riscaldata, coprire con la pellicola e incubare per 30 minuti con scossa lenta e dolce a RT.
    4. Scartare la soluzione di blocco dell'etanolamina nell'apposito contenitore per i rifiuti biologici e posizionare il vetrino in un nuovo tubo di colorazione pulito riempito di 50 ° C DIW. Coprire con la pellicola e incubare per 10 minuti con scossa lenta e dolce a RT.
    5. Scartare l'acqua e trasferire le diapositive su un supporto per la colorazione di vetro ( Figura 8B supplementare ). Posizionare il supporto di verniciatura in vetro in un supporto di piastra oscillante e centrifughi asciugare la slitta per 5 minuti a 200 xg e RT.
  4. Impostare un divisore e procedere con il blocco biologico.
    1. Posizionare la diapositiva su un divisore da 16 pozzetti ( Figura 8C supplementare ).
    2. Preparare la soluzione di lavaggio PBST: 50 ml di soluzione fisiologica tamponata (PBS), pH 7,4 + 0,1% di Tween-20.
    3. Preparare la soluzione di blocco biologico (PBS-OVA): 5 ml di PBS, pH 7,4 + 1% di ovalbumina di pollo (10 mg / ml).
      NOTA: La scelta del reagente bloccante è fondamentale per il successo della rilevazione di anticorpi anti-Neu5Gc. L'ovalbumina è fatta in polli che, come gli umani, non possono sintetizzare Neu5Gc, causando una mancanza di espressione di questa Sia. Per la rilevazione di Neu5Gc, anche i contaminanti minori possono ridurre notevolmente la sensibilità del saggio, a volte anche non riescono a rilevare alcuna reattività anti-Neu5Gc. Ad esempio, il reagente bloccante più comunemente usato, l'albumina del siero bovino (BSA), sebbene non glicosilato da solo, contiene contaminanti IgG bovini che trasportano le parti Neu5Gc e quindi competono conI glicati stampati quando si legano al campione con anticorpi anti-Neu5Gc 19 , 20 .
    4. Prewet i pozzetti. Utilizzando una pipetta multipli, aggiungete 200 μL di PBST nei pozzetti, posizionarli in una camera umida coperta e agitare per 5 min.
      NOTA: La camera di umidità è un vassoio di vetro con una carta bagnata bagnata, ricoperta di involucro di nylon e foglio per proteggere i campioni dalla luce.
    5. Rimuovere il PBST facendo scorrere e toccare delicatamente su un tovagliolo di carta pulito ed aliquota di 200 μL di buffer di bloccaggio PBS-OVA in ciascun pozzetto. Posizionare in una camera umida e incubare per 1 h a RT con una leggera scossa.
  5. Preparare la rilevazione primaria diluita in buffer di blocco PBS-OVA, come indicato nella Tabella 2 .
    NOTA: Per la valutazione del controllo di qualità di questo microarray sialoglycan, utilizzare diverse proteine ​​leganti Sia: Sambucus nigra lectin (SNA), isolata dalla corteccia di sambuco, dovrebbe riconoscere Sia &# 945; 26; Si prevede che Maakia Amurensis Lectin II (MALII) riconoscerà Siaα23; E il polio anti-Neu5Gc IgY è atteso riconoscere tutti i Sialoglycans contenenti Neu5Gc. Inoltre, utilizzare vari campioni di sera umani per profilare la risposta IgG anti-Neu5Gc. La concentrazione di lectine / anticorpi / sere deve essere calibrata sperimentalmente.
  6. Far scivolare il buco di blocco PBS-OVA asciutto e aggiungere 200 μL di anticorpi primari per pozzetto (volume minimo per pozzetto: 70 μL), incubare in una camera umida per 2 h.
  7. Flick asciugare il rilevamento primario e lavare 4 volte con PBST (tra il 3 ° e 4 ° lavaggio, incubare la diapositiva in PBST per 5 minuti nella camera umida). Lavare una volta con PBS.
  8. Preparare l'anticorpo secondario in PBS, come indicato nella Tabella 2 .
  9. Flick asciugare il PBS e aggiungere 200 μL di anticorpo secondario. Incubare per 1 h a RT con agitazione.
  10. Flick asciugare l'anticorpo secondario e lavare quattro volte con PBST (tra il 3Rd e 4 ° lavaggio, incubare la slitta in PBST per 5 minuti nella camera umida).
  11. Rimuovere con cautela il telaio e posizionare le diapositive in un tubo di colorazione per diapositive di 50 ml riempito con PBS e agitare per 5 min.
  12. Riempire due bagni di verniciatura a scorrimento ( Figura supplementare 8D ) con DIW, posizionare la diapositiva nel supporto di scorrimento e immergerlo all'interno del bagno. Immergere rapidamente 10 volte e poi passare al secondo bagno e immergere altri 10 volte. Incubare per 10 minuti a RT con agitazione.
  13. Scartare l'acqua e trasferire la diapositiva su un supporto per la colorazione di vetro ( Figura 8B supplementare ; lasciare scivolare l'aria in aria). Posizionare il supporto di colorazione in vetro in un supporto di piastra oscillante e centrifugare asciugare lo scivolo per 5 minuti a 200 g e RT.
  14. Scansiona la diapositiva e poi lo memorizzi in una scatola sigillata sotto vuoto al buio.

6. Analisi di array e analisi dei dati

  1. Aprire lo scanner fluorescente a scorrimento e lasciarlo caldo per 5 min. Apri ilLa scansione e l'analisi del software.
  2. Impostare i parametri di scansione ( Figura 9A supplementare ): scansione a 532 nm e potenza del 100% con guadagno di 350 PMT, con una linea in media e una posizione di messa a fuoco 0 μm. Utilizza una risoluzione di 10,0 μm pixel.
    NOTA: I parametri di scansione possono essere regolati su diversi tipi di diapositive, fluorescenza e risoluzione.
  3. Scansiona la diapositiva sviluppata. Aprire la porta dello scanner e posizionare la diapositiva all'interno, con l'array rivolta verso il basso. Avviare la scansione (verde "Play" sul menu del pannello di navigazione del software, Figura 9B supplementare ).
  4. Salvare le diapositive scansionate come file tiff.
  5. Preparare la diapositiva per l'analisi. Seleziona "Carica l'elenco di matrici" e carica il file GAL appropriato che elabora gli array in ogni blocco sulla diapositiva ( Figura 9C supplementare ).
    NOTA: il file GAL contiene informazioni relative all'identità e alla posizione (X, Y) di ciascun punto della diapositiva. Questo file può essere creatoDal software della stampante che esporta un file di testo delimitato da tabulazioni basato sulle identità dei campioni nella piastra di origine dei 384 pozzetti e il disegno di stampa definito.
  6. Impostare i parametri di allineamento e di analisi. Premere il pulsante "Opzione" nel menu del pannello di navigazione del software ( Figura 10 supplementare ).
  7. Definire i parametri di allineamento. Trova funzioni circolari, ridimensiona le funzioni durante l'allineamento con il 50 - 350%, il movimento delle funzioni limite fino a una traduzione massima di 40 μm, le funzionalità che non soddisfano la soglia di sfondo (soglia CPI 0), stimano l'avvolgimento e la rotazione quando si trovano blocchi e automatizzano la registrazione delle immagini (10 pixel) ( Figura 10 supplementare ).
  8. Definire i parametri di analisi: rapporto W1 / 532, deviazione standard normale, analisi delle funzioni assenti e sottrazione subacquea. Fai clic su "select" e quindi "Media locale di sfondo" e imposta 2 pixel da escludere e una larghezza di 3 pixel di sfondo. Premere "OK". SeT il livello di saturazione dello scanner a default ( Figura 10 supplementare ).
    NOTA: Il metodo di sottrazione di sfondo dipende dal disegno sperimentale e può essere modificato in base alle esigenze specifiche.
  9. Allinea le mappe delle funzionalità. Impostare il programma in modalità blocco (premere "B"), selezionare tutti i blocchi (Ctrl + A), posizionare le griglie di mappe di array e allineare tutti i blocchi (Alt + Shift + F7) ( Figura 11 supplementare ).
  10. Raffinare l'allineamento delle funzioni in ogni blocco. Zoom (premere "Z" per entrare in modalità zoom) nel blocco superiore sinistro, premere di nuovo "B" (modalità blocco) e premere la griglia di questo blocco. Spostare solo la griglia di questo blocco finché non si allinea perfettamente con i blocchi e premere F5 per allineare le funzioni in questo blocco selezionato. Ripetere il movimento della griglia e l'allineamento F5 finché i punti non sono perfettamente cerchiati. Fai lo stesso per ognuno dei 16 blocchi fino a quando tutte le griglie sono in atto.
  11. Analizzare e salvare i dati. Seleziona tutti i blocchi (Crtl +A) e quindi analizzare i dati (Alt + A). Salvare i risultati dell'analisi (Ctrl + U) come file .prpr.
  12. Aprire il file.gpr salvato in un programma di fogli di calcolo e analizzare l'intensità di ciascun spot sulla base della fluorescenza dopo la sottrazione di sfondo locale (F532-B532).

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Risultati

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Stampa, sviluppo e analisi di array:

La stampa di un microarray di sialoglycan con più campioni di glicina e curve di IgG di IgG in 16 blocchi differenti richiede una calibrazione approfondita per garantire che tutti i campioni siano stampati in modo uniforme possibile in tutti i 16 blocchi per diapositiva ea tutte le diapositive nella stessa stampa. Pertanto, sono necessari esperimenti di calibrazione multipli prima di determina...

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Discussione

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Una fabbricazione di microarray di glycan di successo richiede una pianificazione attenta e comprende diversi passaggi importanti nel protocollo. Questi includono: (1) pianificare i layout di blocco e piastre che definiscono tutti i parametri successivi ( ad esempio, distanze, spaziatura, quantità di campioni e stampa); (2) pulire i perni e garantire l'integrità del perno, che è fondamentale per controllare l'omogeneità spot; (3) mantenendo l'alta umidità durante la stampa, cruciale per evitare l...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto in parte da un premio per la ricerca della carriera di ricerca del Fondo Israel Cancer Research, una sovvenzione dell'Iniziativa Nazionale di Nanotecnologia Israeliana e della Helmsley Charitable Trust per un'Area Tecnologica Focale sulle Nanomedicine per la Theranostics Personalizzata (VP-K) e National Istituti di Salute concedono una sovvenzione R01GM076360 (a XC).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Glicohub, Inc., Davis, CA, USA (http://www.glycohub.com/services)Contattare info@glycohubusa.com per richieste di compostiGlicani
stampati Fosfato monosodico monoidratoSigmaS9638Componente tampone di stampa
Fosfato disodico eptaidratoSigmaS9390Componente tampone di stampa
Fosfato soluzione salina tamponataHy-LabsBP-507/500DTampone di stampa/incubazione/lavaggio
Tris-baseSigmaT1503Reagente bloccavetrini
GlycerolSigmaG-7893Componente tampone di stampa
EtanolamminaThermo-Fisher Scientific0700/08Reagente bloccavetrini
Ovalbumina (Grado V)SigmaA5503Proteina bloccante vetrino
Tween-20SigmaP7949Detersivo per vetrini
Alexa 555-HydrazideThermo-Fisher ScientificA20501MPMarker su array
ChromPure Human IgG, molecola interaJackson Immunoresearch009-000-003Componente di stampa
Biotinilato - SNAVector LaboratoriesB-1305Legante della lectina vegetale sia-alfa2– 6-linked
Biotinilated-MALIIVector LaboratoriesB-1265Lectina vegetale - legante Sia-alpha2 ... 3-linked
Chicken-anti Neu5Gc IgYBioLegend146903Rilevamento primario
Cy3-StreptavidinJackson Immunoresearch016-160-0848Cy3-anti IgG umano legame alla biotina
Jackson Immunoresearch109-165-088Rilevamento secondario contro IgG umano
Cy3-anti IgY di pollo JacksonImmunoresearch703-165-155Secondario rilevamento contro
campioni di sieri umaniBanca del sangueRilevamento primario
Azoto compresso (grado 5)Strumento generale per spolverare/essiccare
Vetrini rivestiti in resina epossidicaCorning40044
Vetrini Vetrini rivestiti in resina epossidicaPolyAn2D 104-00-221Diapositive. In questo tipo di vetrini la superficie è più idrofobica (rispetto ai vetrini di carotaggio), quindi il tampone di stampa dei glicani dovrebbe essere integrato con lo 0,005% di Tween-20 per ottenere 100 &; micro; macchie di dimensioni m.
Piastra per microtitolazione a 384 pozzetti,Genetix2070Piastra di stampa
Marcatore da laboratorio VWRVWR52877-310Etichettatura dei vetrini,
Tubo di colorazione, ArrayItMSTStrumento di sviluppo dei vetrini
Bagno di colorazione,VWR25608-904Strumento di sviluppo dei vetrini
PortavetriniVWR631-9321
Scanner GenePix Dispositivimolecolari4000BScanner per vetrini
LM-60 NanoPrinterArrayItLM-60Stampante
Pins ArrayIt946MP3Perni di stampa Modulo
ProPlateGrace Bio-LabsP37004Modulo di sviluppo vetrini
Acqua distillataBio-Lab2321020500Necessario per arrayer e umidificatore
Multi Pippete elettronico, 8 canali, gamma di volume 2-125 μ LThermo-Fisher Scientific (Matrix)MA-2131 Impact2 Equalizer 384Multi pippete per la distribuzione del campione in una piastra a 384 pozzetti
di IgY di pollo israeliana , , , , , ,, , array

Riferimenti

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